一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
【专利摘要】本发明实施例提供了一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，属于生物制药领域。其制备方法为：在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中，以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子和葡萄糖作用下，用氰化试剂维持pH值在6～8，室温下反应得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。本发明提供的制备方法以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶的催化下，“一锅法”完成还原反应和氰基取代反应得到产物，过程简单且生产成本低。
【专利说明】—种(3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备
方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，具体涉及阿伐他汀中间体(3R，5R)-6-氰基-3，5_二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
【背景技术】
[0002]他汀类药物通过抑制胆固醇合成途径的HMG-CoA还原酶，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高脂血症有较好的疗效，是目前临床上应用广泛的血脂调节药物。阿伐他汀(Atorvastatin)由于其具有起效快、降脂作用强、作用时间长等优点，成为全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，是目前最有市场前景的他汀类药物。而(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯是阿伐他汀的最为重要的中间体，因而，开展对(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的合成改进，对阿伐他汀制备方法的研究具有十分重要的作用。
[0003](3R, 5R)-6-氰基_3，5_ 二羟基己酸叔丁酯是合成阿伐他汀侧链的重要的中间体，其化学结构为:
【权利要求】
1.一种(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中，以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子和葡萄糖作用下，用氰化试剂维持PH值在6~8，室温下反应得到(31?，51?)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯；在起始时的反应体系中，所述复合酶、脱卤酶、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.01 ~0.02: 0.01 ~0.02:0.0005 ~0.002:1 ~2:1。
2.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶的制备方法为:将携带酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35~40°C下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35~40°C下摇床扩大培养，至OD6tltl值达到0.8~I时，加入诱导剂，于35~40°C下继续培养4~8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10~20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15~-25°C，然后再冷冻干燥24~48小时，即得所述重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的复合酶。
3.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述脱卤酶的制备方法为:将携带脱卤酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35~40°C下摇床活化8~12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35~40°C下摇床扩大培养，至OD6tltl值达到0.8~I时，加入诱导剂，于35~40°C下继续培养4~8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10~20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15~-25°C，然后再冷冻干燥24~48小时，即得所述状脱卤酶。
4.根据权利要求2或者3所述的生物制备方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求1或2或3所述的生物制备方法，其特征在于，所述盐酸三乙醇胺缓冲液的浓度为0.05Μ~0.15Μ。
6.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与盐酸三乙醇胺缓冲溶液的质量体积比为150-300mg/mL。
7.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPHo
8.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述氰化试剂为氰化钠溶液或氰化钾溶液，其质量浓度为10~30%。
9.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，其制备方法具体为:在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱齒酶、辅因子、葡萄糖和(5R) -6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用氰化钠溶液或氰化钾溶液维持pH值在6~8，室温搅拌反应，反应完成后加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，即得所述(3R，5R) -6-氰基-3，5- 二羟基己酸叔丁酯。
【文档编号】C12P13/00GK103695486SQ201410001100
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】张龑, 熊进军, 葛石平 申请人:黄冈华阳药业有限公司, 黄冈师范学院