乳腺癌21基因联合检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了乳腺癌21基因联合检测的试剂盒，本发明的PCR扩增引物由包括21对引物对所组成，可以联合检测21个基因相关表达量：Ki67,STK15,Survivin,CCNB1,MYBL2,MMP11,CTSL2,GRB7,HER2,GSTM1,CD68,BAG1,ER,PGR,BCL2,SCUBE2,ACTB,GAPDH,PRLPO,GUS,TFRC。本发明所涉及的21对引物产出片段都小于100bp，大大提高了石蜡标本提取mRNA逆转录后PCR的效率；预混了21基因的所有引物，省去了实验者设计和合成21对基因的时间和精力；无需再添加21基因的相应引物，预混在母液中大大减小了反应孔的误差。本试剂盒操作简单，只需加入模板就能在定量PCR仪上检测，大大缩短了检测实验时间。本发明适用于单样品和多样品，都能快速得到结果，能很好的满足科研和临床检测需求。
【专利说明】乳腺癌21基因联合检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学分子生物学领域，涉及一种试剂盒，具体为一种针对乳腺癌21基因联合检测的试剂盒。
【背景技术】
[0002]近几年来，随着基因组学的研究深入，针对雌激素受体阳性患者的“21基因检测” (Oncotype Dx)已经被证实比临床病理学指标更能准确预测雌激素受体阳性、腋下淋巴结阴性且降低服用他莫昔芬患者的远处转移风险。该检测是唯一由美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国立综合癌症网络(NCCN)指南联合推荐的多基因检测。这21个基因包括16个肿瘤相关基因及5个参考基因。其中肿瘤相关基因包括:增殖相关基因(K1-67、STK15、Survivin>Cyclin B1、MYBL2)、侵袭相关基因(Stromelysin3、Cathepsin L2)、Her-2 相关基因(GRB7、Her-2)、激素相关基因(ER、PR、Bcl_2、SCUBE2)、GSTM1、BAG1、CD68。而 5 个参考基因则为 Beta-actin、GAPDH、RPLPO,⑶S 和 TFRC。
[0003]而目前21基因的检测主要是是通过从病人的石蜡标本中提取mRNA后进行RT-QPCR的方法来检测各个基因的表达再量化为复发风险评分(RS)。在检测实验时，一个real time PCR反应体系中引物的用量极少不到I μ I。而PCR反应本身就是灵敏度极高的实验，如此多的基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多。如何能得到相应基因的精确CT值及能减少实验时间和减小实验误差成了亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]为克服上述存在的问题和技术的不足，本发明提供了一种快速有效的乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其能很好的满足科研和临床检测需求。
[0005]本发明解决其技术问题采用的技术方案:
[0006]一种乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其特征是21个基因为Ki67，STK15, Survivin, CCNB I, MYBL2, MMPl I, CTSL2, GRB7, HER2, GSTM1, CD68, BAG I, ER, PGR, BCL2, SCUBE2, ACTB, GAPDH, PRLPO,⑶S, TFRC ；
[0007]所述试剂盒包括以下扩增21个基因的引物对:
[0008]引物对l:K1-67:
[0009]F:5， CTCCACAGTCAGACCCAG 3，
[0010]R:5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，；
[0011]引物对2:STK15:
[0012]F:5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
[0013]R:5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ；
[0014]引物对3:Survivin:
[0015]F:5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
[0016]R:5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，；[0017]引物对4:CyclinBl:
[0018]F ; 5，CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
[0019]R:5， CTCCTGCAACAACCTGAA 3’ ；
[0020]引物对5:MYBL2:
[0021]F:5， AGGGAGGACAGACAATGCT 3’
[0022]R:5， CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，；
[0023]引物对6:MMP11:
[0024]F:5’ GGTGGCAGCCCATGAATT 3’
[0025]R:5’ GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3’ ；
[0026]引物对7:CTSL2: [0027]F:5， TACAGCCAAGGGAAACAT 3，
[0028]R:5’ GAAAGCAACCCATCATCT 3’ ；
[0029]引物对8:GRB7:
[0030]F:5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
[0031]R:5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3’ ；
[0032]引物对9: HER2:
[0033]F:5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
[0034]R:5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，；
[0035]引物对10:ER:
[0036]F:5’ TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3’
[0037]R:5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ；
[0038]引物对11:PGR:
[0039]F:5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
[0040]R:5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3’ ；
[0041]引物对12:BCL2，:
[0042]F:5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’
[0043]R:5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3’ ；
[0044]引物对13:SCUBE2:
[0045]F:5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
[0046]R:5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ；
[0047]引物对14:GSTM1:
[0048]F:5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
[0049]R:5’ TCAAGTAGGGCAGATTGG 3’ ；
[0050]引物对15:BAG1:
[0051]F:5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
[0052]R:5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3’ ；
[0053]引物对I6: CD68:
[0054]F:5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
[0055]R:5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ；[0056]引物对17:ACTB:
[0057]F:5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
[0058]R:5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3’ ；
[0059]引物对18:GAPDH:
[0060]F:5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’
[0061]R:5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3’ ；
[0062]引物对19:PRLP0:
[0063]F:5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
[0064]R:5’ CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3’ ；
[0065]引物对20:⑶S:
[0066]F:5’ CCACGGTGTCAACAAGCA 3’
[0067]R:5， ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
[0068]引物对21:TFRC:
[0069]F:5’ CACCATCTCGGTCATCAG 3’
[0070]R: 5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3’。
[0071]本发明还提供了乳腺癌21基因联合检测试剂盒的制备方法，步骤如下:
[0072](I) 21对基因引物的设计和合成:根据primerf设计引物，目的片段都小于lOObp，大大保证了石蜡标本mRNA逆转录后的PCR效率，21对基因引物由如下序列表中SEQ IDNO:1-SEQIDNO:21所组成的引物对所组成:
[0073]增殖相关基因(K1-67、STK15、Survivin、CyclinB1、MYBL2)
[0074]引物对l:K1-67:
[0075]F:5’ CTCCACAGTCAGACCCAG 3’
[0076]R:5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，；
[0077]引物对2:STK15:
[0078]F:5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
[0079]R:5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ；
[0080]引物对3:Survivin:
[0081]F:5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
[0082]R:5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，；
[0083]引物对4:CyclinBl:
[0084]F:5， CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
[0085]R:5’ CTCCTGCAACAACCTGAA 3’ ；
[0086]引物对5:MYBL2:
[0087]F:5’ AGGGAGGACAGACAATGCT 3’
[0088]R:5’ CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，；
[0089]侵袭相关基因(Stromelysin3、CathepsinL2)
[0090]引物对6:Stromelysin-3 (MMPll):
[0091]F:5， GGTGGCAGCCCATGAATT 3，
[0092]R:5’ GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3，；[0093]引物对7 =Cathepsin L2 (CTSL2):
[0094]F:5’ TACAGCCAAGGGAAACAT 3’
[0095]R:5’ GAAAGCAACCCATCATCT 3，；
[0096]Her-2 相关基因(GRB7、HER2)
[0097]引物对8:GRB7:
[0098]F:5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
[0099]R:5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3，；
[0100]引物对9:HER2:
[0101]F:5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
[0102]R:5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，；
[0103]激素相关基因(ER、PR、Bcl_2、SCUBE2)
[0104]引物对10:ER:
[0105]F:5’ TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3’
[0106]R:5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ；
[0107]引物对11:PGR: [0108]F:5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
[0109]R:5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3，；
[0110]引物对12:BCL2，:
[0111]F:5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’
[0112]R:5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3，；
[0113]引物对13:SCUBE2:
[0114]F:5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
[0115]R:5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ；
[0116]其它(GSTM1、BAG1、CD68)
[0117]引物对14:GSTM1:
[0118]F:5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
[0119]R:5， TCAAGTAGGGCAGATTGG 3，；
[0120]引物对15:BAG1:
[0121]F:5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
[0122]R:5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3，；
[0123]引物对16:CD68:
[0124]F:5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
[0125]R:5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ；
[0126]参考相关基因(ACTB、GAPDH、RPLPO、⑶S、TFRC)
[0127]引物对17:ACTB:
[0128]F:5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
[0129]R:5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3，；
[0130]引物对18:GAPDH:
[0131]F:5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’[0132]R:5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3，；
[0133]引物对19: RPLPO:
[0134]F:5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
[0135]R:5’ CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3，；
[0136]引物对20:⑶S:
[0137]F:5’ CCACGGTGTCAACAAGCA 3’
[0138]R:5’ ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
[0139]引物对21:TFRC:
[0140]F:5’ CACCATCTCGGTCATCAG 3’
[0141]R:5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3，；
[0142]以上引物均由上海生工生物公司合成；
[0143](2)预混液的配制:在普通荧光定量PCR试剂盒的基础上引入这21对引物；制成每个引物对应的21管一定剂量反应预混液，包含定量PCR反应所需的全部组分和引物，制成成品反应液。成品反应液中米用热 启动性质的闻纯度DNA聚合酶,保证特异性。引物在低温都能保存很长时间且较稳定。因此只要加入模板就能直接在荧光定量PCR仪上检测，大大加速实验的进程且避免了逐个去配制各基因的反应液时的误差；
[0144](3)根据单个样品检测时所需反应液的量的比例，计算出检测100份样品所需的预混液用量，配制到一个可以封闭的棕色管子中，混匀，保存，即得本发明的试剂盒；
[0145](4)试剂盒中成品反应液的性能检测:将上述配制好的试剂盒储存在一定条件下，在即时，I天，I周，I个月，2个月，3个月的时间段用同一模板来做定量PCR，将得到的CT值算出RS值，统计每次的结果是否有差异性。
[0146]本发明有益的效果是:
[0147]1、本发明所涉及的21对引物产出片段都小于lOObp，大大提高了石蜡标本提取mRNA逆转录后PCR的效率。
[0148]2、该发明预混了 21基因的所有引物，省去了实验者设计和合成21对基因的时间和精力。
[0149]3、本试剂盒操作简单，只需加入模板就能在定量PCR仪上检测，将大大缩短了检测实验时间
[0150]4、本试剂盒无需再添加21基因的相应引物，成品反应液中已包含，大大减小了反应孔的误差
[0151]5、本发明适用于单样品和多样品，都能快速得到结果，能很好的满足科研和临床检测需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0152]图1:石蜡标本样品1、2、3，提取得到的RNA电泳图。
[0153]图2:成品反应液性能检测。成品反应液制成后即时检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。
[0154]图3:成品反应液性能检测。成品反应液制成保存I天后检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。[0155]图4:成品反应液性能检测。成品反应液制成保存I周后检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。
[0156]图5:成品反应液性能检测。成品反应液制成保存I月后检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。
[0157]图6:成品反应液性能检测。成品反应液制成保存2月后检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。
[0158]图7:成品反应液性能检测。成品反应液制成保存3月后检测样品I统计分析的RS值。检测结果高风险:RS > 31。
[0159]图8:成品反应液性能检测。成品反应液检测样品2统计分析的RS值。检测结果中风险:18 < RS < 31。
[0160]图9:成品反应液性能检测。成品反应液检测样品3统计分析的RS值。检测结果低风险:RS < 18。
【具体实施方式】 [0161]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合举例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的举例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0162]本发明在普通的荧光定量PCR试剂盒的基础上，加入已知的21个基因的引物，预混成21管反应液。每个基因引物对应相应的预混液管，并标明。再进行预混液性能检测。具体步骤如下:
[0163](I)志愿者乳腺癌石蜡标本mRNA的提取，分别得到样品1、2、3:(采用QIAGEN公司RNeasy? FFPE Kit)
[0164]1.首先用刀片，修剪蜡块。
[0165]2.在石蜡切片机上切成蜡片5 μ m，取5~10张。
[0166]3.马上把组织片放入到1.5ml EP管中，盖上盖子。
[0167]4.加入1ml 二甲苯脱腊,镟润振荡10s, 1000Orpm,离心8min。
[0168]5.离心弃去二甲苯，加入无水乙醇洗脱。如果脱蜡还没有完全，再加入二甲苯重复上面的步骤。
[0169]6.加入240 μ I Buffer PKD，漩涡振荡。加入10 μ I的蛋白酶K，轻柔上下颠倒
[0170]7.在 56°C孵育 15min,然后 80°C孵育 15min。
[0171]8.转移液体到一个新的2ml离心管中。
[0172]9.在冰上孵育 3min。13500rpm 离心 15min。
[0173]10.将上清转移到一个新的离心管中，不要碰到下面的沉淀。
[0174]11.加入 1/10 上清液体积的 DNase Booster Buffer,然后加入 10 μ I DNase I 原液。颠倒管子，离心，使壁上的液体至底部。
[0175]12.室温放置 15min。
[0176]13.加入 320 μ I Buffer RBC,彻底混合溶解。
[0177]14.加入1200 μ I无水乙醇，立即进行下一步。
[0178]15.吸出700 μ I的样品，包括沉淀物，移到一个RNeasy MinElute spin column套在2ml EP离心管上，盖上盖子，^ 1000Orpm,离心15s。
[0179]16.重复 17,直到全部的样品都穿过了 RNeasyMinElute spin column。
[0180]17.加入 500 μ I 的 Buffer RPE 到 RNeasy MinElute spin column 中，盖上盖子，≥1000Orpm,离心15s,倒去废液。
[0181]18.加入 500 μ I 的 Buffer RPE 到 RNeasy MinElute spin column 中，盖上盖子，≥1000Orpm,离心2min,洗膜,倒去废液
[0182]19.将RNeasy MinElute spin column放到一个新的2ml离心管中，打开盖子,离心5min。倒去废液。
[0183]20.再将 RNeasy MinElute spin column 放到一个新的 1.5ml EP 管中。加入 14 -30 μ I RNase-free water,正好布满膜上。盖上盖子,离心Imin,洗提RNA。(电泳结果见图1)
[0184](2)将提取好的mRNA逆转录成cDNA: (TaKaRa试剂盒DRR047A)
[0185]A:基因组DNA的去除反应
【权利要求】
1.一种乳腺癌21基因联合检测试剂盒，其特征是21个基因为Ki67，STK15, Survivin,CCNB I, MYBL2, MMPl 1，CTSL2, GRB7, HER2, GSTMl, CD68, BAG I, ER, PGR, BCL2, SCUBE2,ACTB, GAPDH, PRLPO,⑶S，TFRC ； 所述试剂盒包括以下扩增21个基因的引物对: 引物对I:K1-67:
F: 5， CTCCACAGTCAGACCCAG 3，
R: 5， GCACGCTAAGAGTTCTCC 3，； 引物对2:STK15:
F: 5’ AGGCTCAGCGGGTCTTGT 3’
R: 5’ AACCGGCTTGTGACTGGA 3’ ； 引物对 3:Survivin:
F: 5’ TACGCCTGTAATACCAGCAC 3’
R: 5， AAGCGCAACCGGACGAAT 3，； 引物对 4 =Cycl inBl:
F; 5， CGGGAAGTCACTGGAAAC 3，
R: 5’ CTCCTGCAACAACCTGAA 3，； 引物对5:MYBL2:
F: 5， AGGGAGGACAGACAATGCT 3，
R: 5， CTTTGGACTCGCTCAAGAA 3，； 引物对6:MMP11:
F: 5， GGTGGCAGCCCATGAATT 3，
R: 5， GGTAGCGAAAGGTGTAGAAGG 3，； 引物对7: CTSL2:
F: 5， TACAGCCAAGGGAAACAT 3，
R: 5， GAAAGCAACCCATCATCT 3，； 引物对8:GRB7:
F: 5’ CCCACTGACTTCGGTTTCT 3’
R: 5’ GTGCGGCTCTGCTCATCT 3’ ； 引物对9:HER2:
F: 5’ GAGTCCATGCCCAATCCC 3’
R: 5， CCCACGTCCGTAGAAAGGT 3，； 引物对10:ER:
F: 5， TGCCAAGGAGACTCGCTAC 3，
R: 5， AGCCCTCACAGGACCAGA 3 ； 引物对11:PGR:
F: 5’ GCTGCGGTGGAGGTTGAGGA 3’
R: 5’ ACCCAGAGCCCGAGGTTTGC 3’ ； 引物对12:BCL2，:
F: 5’ CTTCGCCGAGATGTCCAG 3’R: 5’ CCAGTTCACCCCGTCCCT 3’ ；
引物对 13:SCUBE2:
F: 5’ ATGGGAGGAGCTGCCTTGA 3’
R: 5’ CGCCGTTTCACCCGTTTA 3’ ； 引物对14 =GSTMl:
F: 5’ GACGCTCCTGATTATGACA 3’
R: 5， TCAAGTAGGGCAGATTGG 3，； 引物对15 =BAGl:
F: 5’ ATCTTGGAGGAGATTGACA 3’
R: 5’ AGGAATGCCTGAACCTTT 3’ ； 引物对16:CD68:
F: 5’ CTTTGCTGCCATCCTTCA 3’
R: 5’ TTGTGGCTCTTGGTAGTCC 3’ ； 引物对17 =ACTB:
F: 5’ TTCCAGCCTTCCTTCCTG 3’
R: 5’ CTTTGCGGATGTCCACGT 3’ ； 引物对18:GAPDH:
F: 5’ ATCATCAGCAATGCCTCC 3’
R: 5’ TCCTTCCACGATACCAAAG 3’ ； 引物对19:PRLPO:
F: 5’ GGTCATCCAGCAGGTGTT 3’
R: 5， CCTCCAGGAAGCGAGAAT 3，； 引物对20:⑶S:
F: 5， CCACGGTGTCAACAAGCA 3，
R: 5， ACCAAGCCAGCGAAGCAG 3，；
引物对21 =TFRC:
F: 5， CACCATCTCGGTCATCAG 3，
R: 5’ TCCATATTCCCAAACAGC 3’ 。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤: (O预混液的配制:在普通荧光定量PCR试剂盒的基础上引入这21对引物，制成每个引物对应的21管一定剂量反应预混液，包含定量PCR反应所需的全部组分和引物，制成成品反应液，成品反应液中采用热启动性质的高纯度DNA聚合酶； (2)根据单个样品检测时所需反应液的量的比例，计算出检测100份样品所需的预混液用量，配制到一个可以封闭的棕色管子中，混匀，保存，即得所述试剂盒； (3)试剂盒中成品反应液的性能检测:将上述配制好的试剂盒储存在一定条件下，在即时，I天，I周，I个月，2个月，3个月的时间段用同一模板来做定量PCR，将得到的CT值算出RS值，统计每次的结果是否有差异性。
【文档编号】C12Q1/68GK104004844SQ201410238140
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月28日 优先权日:2014年5月28日
【发明者】陈伟 申请人:杭州美中疾病基因研究院有限公司