一株适合于糖蜜发酵生产高纯度l-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株适合于糖蜜发酵生产高纯度L-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用，一种德式乳酸杆菌LactobacillusdelbrueckiiSZ01,CCTCC?NO：M2014268，该菌株从废糖蜜中筛选，通过紫外诱变驯化得到，能很好的利用糖蜜，在温度为55℃，糖浓度为23%的条件下进行发酵生产L-乳酸，本发明发酵生产的L-乳酸，产量高达180-200g/L，光学纯度可以达到99.86%，发酵时间为30-35h左右，糖酸转化率达到95-99%，在发酵行业中发酵时间短，产量高，转化率高，这在降低工业成本的同时，还大大缩短了企业回收利益的时间。
【专利说明】一株适合于糖蜜发酵生产高纯度L-乳酸的德式乳酸杆菌及发酵方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物发酵及其应用，具体涉及一株德式乳酸杆菌，以及利用糖蜜发酵生产高纯度L-乳酸的发酵方法，同时还涉及一种德式乳酸杆菌在发酵生产L-乳酸中的应用方法。
【背景技术】
[0002]德式乳酸杆菌属是一类革兰氏阳性菌，不形成芽孢，不运动。固体培养基上菌落甚小，牛奶中不起作用。能发酵麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及糊精生乳酸。不发酵木塘、乳糖、棉子糖、菊芋糖、淀粉等。能利用硝酸盐，生长温度为45°C~50°C，能把95%以上的糖转化成乳酸(副产物甚少)，是一种耐高温的真正乳酸菌，广泛应用于乳酸发酵行业。
[0003]目前，文献报道的发酵法生产乳酸研究多用培养基原料为葡萄糖，无论是酿酒酵母菌，还是乳酸菌的生产原料都是葡萄糖。利用糖蜜生产乳酸是降低工业成本的一个关键因素。目前有文献记载，利用中国工业微生物菌种保藏管理中心提供的米根霉RhizopusOryZae3038为出发菌株进行驯化发酵，以甘蔗糖蜜为发酵原料，发酵条件为发酵温度为30°C，转速为200rmp，装液量为50ml/250ml三角瓶，接种量10%，发酵时间为96h，在最适条件下，摇瓶发酵L-乳酸的累积量为114.97g/L。广西大学利用诱变筛选得到一株鼠李糖乳杆菌SCT-10-10-60发酵生产L-乳酸，优化后的发酵条件为初始糖蜜浓度为20% (m/V)，温度为37°C，碳酸钙浓度为4% (m/V)，发酵培养的接种量为6% (V/V)，发酵40h，L-乳酸的产量最高可达到106g/L。华中科技大学筛选到一株高温发酵生产L-乳酸的菌株，经过诱变后，能在421:下，以 15(^/1初始葡萄糖、8(%为接种量，？!1为5.8的条件下进行发酵，最终产量可达到136±1.2g/L乳酸，产率达到3.6±0.03g/(Lh)，发酵周期为48h。但这些研究仅仅只停留在实验阶段，并未应用于工业化生产。本发明人利用一株从糖蜜中筛选出来的德式乳酸杆菌，在工业化条件下进行筛选驯化，能在高温的条件下，利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖等，后来发现它也可以运用于糖蜜发酵生产乳酸。
[0004]糖蜜是制糖工业的副产品，是一种粘稠、黑褐色、呈半流动的物体，组成因制糖原料、加工条件的不同而有差异，其中含有大量的可发酵糖(主要是蔗糖)，因而是很好的发酵原料，可用作酵母、味精、有机酸等发酵制品的底物或基料，也可用作某些食品的原料和动物饲料。糖蜜包括甘蔗糖蜜与甜菜糖蜜，它含有大约40~50%的总糖(主要成分是蔗糖、果糖、葡萄糖)，在发酵行业中最为廉价的碳源原料。它与葡萄糖或淀粉水解液比较，价格低廉，已经广泛用于酵母、酒精、柠檬酸、核黄素及多糖等产品的工业生产。到目前为止，工业上还没有利用糖蜜发酵生产乳酸的实例。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供了一株适合于糖蜜发酵生产高纯度L-乳酸的德式乳酸杆菌，该菌株是从糖蜜中筛选，通过紫外诱变驯化得到，该菌株已于2014年6月18日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名:德式乳酸杆菌Lactobacillus delbrueckiiSZOl ;保藏编号:CCTCC NO:M2014268 ;地址:中国武汉武汉大学。
[0006]本发明的另一个目的在于提供了一种利用德式乳杆菌SZOl发酵生产高光学纯度L-乳酸的方法，在23 %的高糖浓度下，550C的高温下，对水解后的糖蜜进行发酵生产L-乳酸，L-乳酸的光学纯度可以达到99.5%以上，L-乳酸的浓度可达到180-200g/L，发酵时间在 30-35h。
[0007]本发明一个目的在于提供了一种用于乳酸发酵的糖蜜的预处理方法，该方法简单易行，适于工业化生产。
[0008]本发明最后一个目的在于提供了德式乳杆菌SZOl在制备L-乳酸中的应用。
[0009]为了实现以上目的，本发明采用如下技术措施:
[0010]德式乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii) SZOl 的获得:
[0011]以从糖蜜中分离筛选出来的一株德式乳杆菌作为出发菌株，并通过紫外诱变获得目的菌株， 申请人:将其命名为(Lactobacillus delbrueckii) SZOl。该德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) SZOl于2014年6月18日已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC N0.M2014268，分类命名:德式乳杆菌Lactobacillus delbrueckii SZOI,地址:中国武汉武汉大学。
[0012]德式乳杆菌SZOl是一类革兰氏阳性菌，不形成芽孢，不运动，兼性厌氧。在琼脂平板上生长，形成边缘不光滑，不透明的菌落。能利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，不能利用木糖、乳糖、淀粉等。生长温度为55°C，能将95%以上的糖转化为乳酸(副产物甚少)，是一株耐高温的真正乳酸菌，可广泛应用于乳酸发酵产业生产。
[0013]一种用于乳酸发酵的糖蜜的预处理方法，步骤如下:
[0014]对糖蜜进行水解，水解步骤为:糖蜜与水按照体积比为1:1进行混合，用硫酸调节pH为3.5-4.0,并升温至85°C，每隔2小时用生物传感分析仪SBA_40C(山东省科学院生物研究所)测处理液中的葡萄糖含量，当测量的水解液中葡萄糖数值不再升高即为水解结束，时间为7-8小时。水解结束后，加入絮凝剂絮凝，加入活性炭(0.1% w/v颗粒活性炭)脱色，然后过滤，糖蜜预处理结束，水解后的糖蜜中的葡萄糖的浓度可达到70-80% (w/v)。最后将水解后的糖蜜稀释到发酵所需的糖浓度，备用。
[0015]德式乳杆菌SZOl发酵生产L-乳酸中的应用，包括利用常规方案使用德式乳杆菌SZOl发酵生产L-乳酸的应用，或是利用糖蜜为原料之一，进行德式乳杆菌SZOl发酵生产L-乳酸的应用。
[0016]利用糖蜜，发酵生产L-乳酸的方法，具体步骤如下:
[0017]1、德式乳杆菌SZOl的活化:将德式乳杆菌SZOl置于LB的培养平板上，于50_55°C条件下培养6-8h，活化；
[0018]所述的LB培养基的配方为:葡萄糖20g,酵母粉5g,蛋白胨1g,氯化钠5g,补充蒸馏水至1000ml ；
[0019]2、德式乳杆菌SZOl的种子液培养:将活化的德式乳杆菌SZOl菌株取直径在Icm左右的菌落分别接种于装有10ml的种子培养基的250ml的三角瓶中，于150r/min，55°C条件下震荡培养8-10h，检测摇瓶内pH降到4.0-5.0即可认为完成摇瓶种子液的制备。
[0020]所述的种子培养液的配方为:水解糖蜜后糖浓度(以葡萄糖计)为130g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二铵2g/L。
[0021]3、德式乳杆菌SZOl的发酵罐种子液培养:发酵种子培养基的装罐量为发酵罐的三分之二，将步骤2)制备的摇瓶种子液按10%的接种量接种到发酵罐中，55°C培养，转速为150r/min，pH设定为6.8，使用氢氧化钙溶液作为中和剂，进行发酵罐种子液的培养，培养至种子培养基中的葡萄糖含量为初始糖浓度的一半即完成发酵罐种子液的制备。
[0022]所述的发酵罐种子液的配方为:水解糖蜜后糖浓度为230g/L，硫酸铵150g/L，磷酸二铵 0.5g/L。
[0023]4、德式乳杆菌SZOl的上罐发酵培养:发酵培养基的装罐量为发酵罐的三分之二，将步骤2)制备的种子液按10%的接种量接种到发酵罐中，55°C培养，转速为150r/min，pH设定为6.8，使用氢氧化钙溶液作为中和剂，进行发酵培养。
[0024]所述发酵培养基的配方为:糖蜜水解后糖浓度(以葡萄糖计)230g/L;硫酸铵150g/L,磷酸二铵 0.5g/L。
[0025]常规方案即为将上述培养基中的糖蜜替换为相同浓度的葡萄糖即可。
[0026]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0027]1、本发明筛选诱变的德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) SZOl菌株可以在温度为55°C，糖浓度为23 %的条件下进行发酵生产L-乳酸，高温高糖条件下进行发酵能严格杜绝杂菌的污染，在工业化生产中具有很大的优势。
[0028]2、本发明所利用的原料为工业制糖的废弃物一糖蜜。糖蜜因为含糖分高，价格低廉，受到很多发酵厂家的热捧，但是由于微生物较难利用双糖物质，所以糖蜜在发酵行业的应用一直有着不可逾越的瓶颈。本发明能很好的利用糖蜜进行乳酸发酵，这在工业化生产中，对于降低原材料的成本，而带来的经济效益是不可估量的。现在很多企业都利用葡萄糖作为发酵原料，这无形的增加了发酵成本，不利于后期经济收益。
[0029]3、利用本发明发酵生产的L-乳酸，产量高达180_200g/L，光学纯度可以达到99.86%，发酵时间为30-35h左右，糖酸转化率达到95-98%，在发酵行业中发酵时间短，产量高，转化率高，这在降低工业成本的同时，还大大缩短了企业回收利益的时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1显示的是传代培养五次后，进行发酵生产乳酸的产量示意图。
[0031]图2显示的是在不同初始糖浓度对德式乳杆菌发酵生产乳酸的影响示意图。
[0032]图3显示的是不同的发酵温度对德式乳杆菌发酵生产乳酸的影响变化示意图。
[0033]图4显示的是相同糖浓度条件下，利用水解后的糖蜜进行发酵和利用纯葡萄糖进行发酵生产乳酸的对比图
[0034]图5是发酵结束后，发酵产物的液相色谱(HPLC)检测的光学纯度结果显示。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实例，进一步阐述本发明。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。
[0036]本发明所述的糖浓度均以葡萄糖计。
[0037]实施例1:
[0038]德式乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii) SZOl 的获得:
[0039]以溴甲酚绿平板为筛选平板，用接种环挑一部分废糖蜜在溴甲酚绿平板上划线，在37°C的恒温培养箱中培养，长出菌落，且菌落的颜色变为黄色，或者周围有黄色透明圈即可认为筛选出可以产乳酸的菌株。挑选菌落中的黄色透明圈较大的进行划线培养，并用LB液体培养基进行培养，用生物传感分析仪SBA-40C进行检测，有L-乳酸显示，说明此株菌株生产L-乳酸，再利用液相检测L-乳酸的光学纯度，即可得出筛选的菌株是生产L-乳酸且光学纯度较高的菌株，并经过紫外诱变获得L-乳酸产量较高的菌株，再经过连续继代培养进行驯化，最终获得的菌株将其命名为德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)SZOl ο该德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) SZOl于2014年6月18日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO:M2014268，分类命名:德式乳杆菌Lactobacillus delbrueckii SZ01,地址:中国武汉武汉大学。
[0040]德式乳杆菌SZOl是一类革兰氏阳性菌，不形成芽孢，不运动，兼性厌氧。在琼脂平板上生长，形成边缘不光滑，不透明的菌落。能利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，不能利用木糖、乳糖、淀粉等。生长温度为55°C，能将95%以上的糖转化为乳酸(副产物甚少)，是一株耐高温的真正乳酸菌，可广泛应用于乳酸发酵产业生产。
[0041]实施例2:
[0042]德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) SZOl种子液的制备,其步骤如下:
[0043]1、德式乳杆菌 SZOl的活化:将德式乳杆菌SZOl置于LB的培养平板上，于55°C条件下培养8h，活化；
[0044]2、德式乳杆菌SZOl的摇瓶种子培养:将活化的德式乳杆菌SZOl菌株取直径在Icm左右的菌落分别接种于装有10ml的种子培养基的250ml的三角瓶中，于150r/min,55°C条件下震荡培养，培养10h，摇瓶种子培养的pH达到4.5，在可见分光光度计(紫外可见分光光度计756PC型)的波长为600nm下，检测菌体OD值为1.3，备用；
[0045]所述种子培养基组分及配方为:水解糖蜜后糖浓度(以葡萄糖计)为130g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二铵2g/L。
[0046]3、德式乳杆菌SZOl的发酵罐种子液培养(一级种子):将培养好的摇瓶种子液按接种量为10%的接种量接种到5L种子发酵罐中，装液量为3L，转速为150r/min，温度为55°C，pH设置为6.8，利用氢氧化钙溶液作为中和剂，发酵罐种子液发酵至种子培养基中的葡萄糖含量为初始的一半即完成发酵罐种子液的制备，用于本发明实施例。
[0047]所述发酵种子液培养基组分及配方为:水解糖蜜后糖浓度为230g/L，硫酸铵150g/L，磷酸二铵 0.5g/L。
[0048]水解糖蜜的步骤为:甘蔗糖蜜(糖蜜含蔗糖48% )和水(自来水)按体积比I:1进行混合，用硫酸调节PH为3.5-4.0,并升温至85°C，每隔2小时用生物传感分析仪SBA-40C(山东科学院生物研究所)测处理液中的葡萄糖含量，当葡萄糖含量值不再升高即为水解结束，本实施例中，水解后葡萄糖浓度为75% (w/v)，时间为8小时。水解结束后，加入絮凝剂(聚丙烯酰胺，加入量为聚丙烯酰胺/水解液体积Ig/1L)絮凝，加入活性炭(0.1% w/v的颗粒活性炭)脱色，然后过滤，糖蜜预处理结束。最后将水解后的糖蜜稀释到发酵所需的糖浓度，备用，用于本发明实施例。
[0049]实施例3:
[0050]德式乳杆菌SZOl遗传稳定性验证实验
[0051]为了验证本菌株的遗传稳定性， 申请人:选择LB平板，将所得菌株在平板上连续接种五代，用接种环分别挑取每代平板上的菌落转至种子培养液中进行摇瓶培养，培养条件为:温度55°C，转速150r/min，培养时间为10h，然后每一代以10%接种量，在内装有3L液体发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵,发酵条件为:55°C发酵,转速为150r/min, pH设定为6.8，用氢氧化钙溶液作为中和剂，发酵时间为30h，用生物传感分析仪SBA-40C测量所产L-乳酸的含量，以考察其产乳酸的稳定性。
[0052]乳酸产量的测量:使用山东省科学院生物研究所出产的生物传感分析仪SBA-40C。
[0053]其中所述LB平板培养基组分及培养为:葡萄糖130g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨1g/1，氯化钠58/1，琼脂粉2%。
[0054]所述的种子培养液的配方为:葡萄糖130g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二铵2g/L
[0055]所述的发酵培养基的配方为:葡萄糖230g/L，硫酸铵150g/L，磷酸二铵0.5g/L。
[0056]结果表明:经过五代的传代培养发酵，发现每代菌株发酵后的乳酸产量分别为183.47g/L, 182.60g/L, 182.86g/L, 182.44g/L, 183.40g/L(图1)，糖酸转化率为 99.15% ~99.71%。这可以说明此次的筛选驯化菌株的遗传稳定性较好，可以用于生产发酵。
[0057]实施例4:
[0058]初始糖浓度对德式乳杆菌SZOl发酵生产L-乳酸的影响
[0059]发酵培养基中的初始糖浓度(以水解糖蜜后的葡萄糖计)设定为13%，18%，23%,28%,33% (w/v)。
[0060]13%初始糖浓度的发酵培养基配方:水解糖蜜后糖浓度为130g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二铵2g/L ；
[0061]18%初始糖浓度的发酵培养基配方:水解糖蜜后糖浓度为180g/L，硫酸铵70g/L，磷酸二铵1.0g/L ；
[0062]23%初始糖浓度的发酵培养基配方:水解糖蜜后糖浓度为230g/L，硫酸铵150g/L，磷酸二铵 0.5g/L ；
[0063]28%初始糖浓度的发酵培养基配方:水解糖蜜后糖浓度为280g/L，硫酸铵200g/L，磷酸二铵 0.25g/L ；
[0064]33%初始糖浓度的发酵培养基配方:水解糖蜜后糖浓度为330g/L，硫酸铵250g/L，磷酸二铵 0.lg/L。
[0065]将实施例2制备的德式乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) SZOl发酵罐种子液接种至50L的发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的装液量为30L，发酵条件为:接种量为10%,转速为150r/min，温度为55°C，pH设置为6.8，利用氢氧化钙溶液作为中和剂，发酵时间及对应的乳酸产量见图2。
[0066]由图2可以看出，当糖浓度高于23%时，发酵时间增加，而且发酵结束后的乳酸浓度并没有明显的提高。在糖浓度低于23%时，可以看到发酵周期较短。说明发酵过程中，糖浓度还影响到发酵整个周期。
[0067]表1不同初始糖浓度对德式乳杆菌发酵的影响
【权利要求】
1.一种德式乳酸杆菌，其特征在于:德式乳酸杆菌LactobaciIlus delbrueckiiSZOI, CCTCC NO:M2014268。
2.利用权利要求1所述的德式乳酸杆菌发酵生产L-乳酸的方法，具体步骤如下: 1)、德式乳杆菌SZOl的活化:将德式乳杆菌SZOl置于LB的培养平板上，于50-55°C条件下培养6-8 h，活化； 所述的LB培养基的配方为:葡萄糖20 g,酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化钠5 g,补充蒸馏水至1000 ml ； 2)、德式乳杆菌SZOl的种子液培养:将活化的德式乳杆菌SZOl菌株取直径在Icm左右的菌落分别接种于装有100 ml的种子培养基的250 ml的三角瓶中，于150 r/min, 55°C条件下震荡培养8-10 h，检测摇瓶内pH降到4.0-5.0即可认为完成摇瓶种子液的制备； 所述的种子培养液的配方为:水解糖蜜后糖浓度(以葡萄糖计)为130 g/L，硫酸铵4g/L，磷酸二铵 2 g/L ； 3)、德式乳杆菌SZOl的发酵罐种子液培养:发酵种子培养基的装罐量为发酵罐的三分之二，将步骤2)制备的摇瓶种子液按10%的接种量接种到发酵罐中，55°C培养，转速为150r/min, pH设定为6.8，使用氢氧化钙溶液作为中和剂，进行发酵罐种子液的培养，培养至种子培养基中的葡萄糖含量为初始糖浓度的一半即完成发酵罐种子液的制备； 所述的发酵罐种子液的配 方为:水解糖蜜后糖浓度为230 g/L，硫酸铵150 g/L，磷酸二铵 0.5 g/L ； 4)、德式乳杆菌SZOl的上罐发酵培养:发酵培养基的装罐量为发酵罐的三分之二，将步骤3)制备的种子液按10%的接种量接种到发酵罐中，55°C培养，转速为150 r/min，pH设定为6.8，使用氢氧化钙溶液作为中和剂，进行发酵培养； 所述发酵培养基的配方为:糖蜜水解后糖浓度(以葡萄糖计)230 g/L，硫酸铵150 g/L,磷酸二铵0.5 g/L ； 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:水解糖蜜的步骤如下: 糖蜜与水按照体积比为1:1进行混合，用硫酸调节PH为3.5-4.0，并升温至851:，每隔2小时检测葡萄糖含量，当测量的水解液中葡萄糖数值不再升高即为水解结束，时间为7-8小时。
3.水解结束后，加入絮凝剂絮凝，加入活性炭脱色，过滤即得。
4.权利要求1所述的菌株在发酵生产L-乳酸中的应用。
【文档编号】C12P7/56GK104178438SQ201410376025
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】刘锋, 明晓东, 雷滟敏 申请人:湖北艾尔生物科技有限公司