氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化中的应用，实验证明，在骨髓间充质干细胞的培养基中添加浓度为5μg/mL的氧化型低密度脂蛋白，BMMSCs具有显著的细胞增殖，并能检测到心肌样细胞特异性蛋白和心肌细胞标志性分子的表达，表明骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化，其心肌样细胞转化率高达30％。
【专利说明】氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细 胞分化的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的方法，特别是涉及氧 化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的应用。
【背景技术】
[0002] 骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)是存在于 骨髓内的一类成体干细胞，具有很强的自我更新能力和多向分化潜能，在特定的生理环境 下或体外诱导培养条件下，可向成骨、软骨、脂肪、成肌、神经和内皮等多种成体细胞分化。 BMMSCs是目前在组织工程和再生医学中应用最广泛的种子细胞之一，已被临床上应用于神 经系统和心血管系统疾病的治疗。动物实验研究表明，将BMMSCs移植到特定组织和器官 中，其可向该组织和器官的功能细胞分化。
[0003] 心肌细胞是不可再生细胞，一旦死亡，只能靠邻近组织的心肌成纤维细胞的增殖 来补充。然而，成纤维细胞会分泌大量的胶原蛋白，这将造成心肌纤维化，会导致心肌功能 下降，严重者可导致心力衰竭。而利用干细胞的心肌分化特性和干细胞移植来治疗心肌梗 死，已成为心血管和干细胞领域的一个热点问题。近年来，有关BMMSCs向心肌细胞分化以 及移植治疗心肌梗死的研究已成为国内外研究的重点课题之一。相关研究显示，移植到心 肌梗死部位的BMMSCs可通过向心肌细胞分化而补充部分损失的心脏固有心肌细胞，不同 程度地改善心脏功能，缩小心肌梗死面积。但是，目前有关干细胞移植治疗心肌梗死仍存在 诸多问题，其中最主要的是向心肌细胞转化效率较低的问题。相关研究显示，移植到心肌梗 死部位的干细胞，包括脐带来源的干细胞、脐带血来源的干细胞和骨髓间充质干细胞，均不 能产生有效治疗数量的心肌细胞。
[0004] 研究显示，血管紧张素 II (Angiotensin II，Ang II)可促进BMMSCs向心肌 样细胞转化，5-氮杂胞啼陡核苷（5-Azacytidine)也可通过活化细胞外信号调节激酶 1/2 (Extracellular Signal-Regulated Protein 1/2, ERK1/2)而促进 BMMSCs 向心肌样细 胞转化。然而，采用血管紧张素 Π 体外诱导BMMSCs向心肌样细胞分化时，存在用量大、成 本高、诱导转化效率低等问题，而且血管紧张素 II在体内容易引发高血压等副作用。5-氮 杂胞嘧啶核苷则属于化学诱导剂，会对机体产生不良刺激作用，例如肝功能损伤、白细胞减 少等，此外，5-氮杂胞嘧啶核苷在临床上亦用作化疗药物，其容易引起细胞凋亡。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要针对现有技术所存在的问题，提供一种诱导转化效率高、副作用少 的诱导剂，以高效地诱导BMMSCs向心肌样细胞定向分化。
[0006] 本发明所采用的技术方案如下：
[0007] 氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs)向心肌样细胞定向分化 中的应用。
[0008] 在其中一个实施例中，在骨髓间充质干细胞的培养基中添加浓度为5 μ g/mL的氧 化型低密度脂蛋白。
[0009] 实验证明，氧化型低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein, ox-LDL) 能够诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs)向心肌样细胞定向分化，心肌样细胞转化率高达 30%。BMMSCs经ox-LDL诱导培养后，促细胞增殖基因 Mdm2表达增高，显著促进BMMSCs 细胞增殖，并能检测到心肌样细胞特异性蛋白--波形蛋白（Vimentin)的表达，同时，心 肌细胞标志性分子-心钠素 （Atrial Natriuretic Peptide, ANP)、B型钠素（B-type Natriuretic Peptide，BNP)、α -肌球蛋白重链（a -MHC)、β -肌球蛋白重链（β -MHC)和 α-心肌肌动蛋白（a-Cardiac Actin)的mRNA表达量亦显著增高。
[0010] 氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL)作为诱导剂，不但能够有效诱导BMMSCs向心肌样 细胞分化，而且能够促进细胞增殖，同时，氧化型低密度脂蛋白属于内源性物质，不会对机 体产生不良的刺激作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为BMMSCs的细胞形态图；
[0012] 图2为BMMSCs对DiΙ-ox-LDL的摄入检测图；
[0013] 图3为BMMSCs经ox-LDL诱导后的MTT检测结果；
[0014] 图4为Western-blotting检测BMMSCs促细胞增殖基因 Mdm2的表达；
[0015] 图5为免疫荧光检测BMMSCs中Vimentin的表达，其中，A为Heochest3342染色 细胞，B为Vimentin阳性细胞，C为Heochest3342染色细胞与Vimentin阳性细胞的叠加；
[0016] 图6为ox-LDL诱导BMMSCs向心肌样细胞转化的转化率；
[0017] 图 7 为 Western-blotting 检测 Vimentin 的表达量；
[0018] 图8A至图8E为RT-PCR检测心肌细胞标志分子的mRNA表达量。
【具体实施方式】
[0019] 实施例一：小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs)的分离和培养
[0020] 在无菌条件下，从小鼠后肢股骨骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，加入含20%胎 牛血清的DMEM培养基中，以5X IO5AiL的浓度接种于细胞培养瓶，置于37°C、5% CO2的培 养箱中进行培养，培养3周后获得高纯度的BMMSCs (如图1所示）。
[0021] 实施例二：小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs)的诱导分化
[0022] 取培养3周后的BMMSCs，用0. 25%胰蛋白酶消化，PBS缓冲液清洗后，加入含20% 胎牛血清的DMEM培养基中充分混匀；以5 X IO6AiL的细胞浓度将BMMSCs接种于培养瓶中， 并向培养基中加入5 μ g/mL的氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL)，然后在37°C、5% CO2的条件 下进行诱导培养，每3天换液一次并添加5 μ g/mL的ox-LDL，诱导分化4周。
[0023] 分别取诱导1周、2周、3周和4周的细胞液，于荧光显微镜下观察诱导后的细胞形 态，并通过MTT法测定细胞增殖数量，通过细胞免疫组织化学方法检测Vimentin阳性细胞 的数量和心肌样细胞转化率，以及通过RT-PCR法检测心肌细胞标志性分子的mRNA表达情 况（详见实施例三至实施例八）。
[0024] 实施例三：二辛酰基四甲基吲哚花青过氯酸盐（Dil)荧光标记的 ox-LDL(Dil-ox-LDL)摄入检测
[0025] 将BMMSCs以IX IOVcm2的密度接种于12孔培养板中，培养4天后向培养基中添加 5μ g/mL的Dil-ox-LDL，置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，然后用无血清的DMEM 培养基洗涤细胞2次，置于荧光显微镜下观察并拍照，检测结果如图2所示。
[0026] 检测结果表明，BMMSCs具有很强的摄取ox-LDL的能力。
[0027] 实施例四：MTT法检测细胞增殖情况
[0028] 将BMMSCs以I X IOVcm2的密度接种于96孔培养板中，同时设置对照组和样品组， 对照组采用常规DMffl培养基，样品组在DMffl培养基中加入5 μ g/mL的ox-LDL，于37 °C、5 % CO2的培养箱中孵育24小时后，向每孔加入10 μ L浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续孵育2 小时，然后向每孔加入100 μ LDMSO溶液，再孵育2小时后，采用酶联免疫检测仪检测570nm 处的吸光值。
[0029] 检测结果显示，对照组的吸光值为0. 140D，样品组的吸光值为0. 210D，由样品组 吸光值与对照组吸光值的比值计算样品组的相对细胞增殖数值，结果如图3所示。实验结 果证明，与对照组相比，样品组的BMMSCs在培养24小时后细胞数量显著增加，表明ox-LDL 能够刺激BMMSCs的增殖。
[0030] 实施例五：免疫印迹（Western-blotting)检测促增殖基因 Mdm2的表达
[0031] 以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4周后的细 胞作为样品组，分别用总蛋白提取试剂盒提取对照组、样品组细胞的总蛋白，用12%的聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上（电流为200mA，转 膜时间为2小时）；室温下用5%的BSA封闭PVDF膜1小时，然后加入兔抗小鼠 Mdm2抗体 (1 : 1000稀释），置于摇床上在4°C下过夜孵育；用含有0. 1% Tween20的Tris碱缓冲液 (TBS)洗膜3次，然后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR(l : 1000稀释），置 于摇床上在室温下孵育1小时；用含有0. 1 % TWeen20的TBS洗膜3次，用ECL超敏发光液 (购自美国Thermo Fisher Scientific Inc.)发光并曝光底物。以持家基因 β-actin作为 内参对照，经灰度扫描后分别与β-actin的灰度值进行比较，计算对照组、样品组的心肌 样细胞促增殖基因 Mdm2的表达量，结果如图4所示。
[0032] 检测结果显示，样品组的BMMSCs经诱导培养后，促增殖基因 Mdm2表达量显著升 高，表明ox-LDL能够刺激BMMSCs的增殖。
[0033] 实施例六：免疫荧光检测心肌样细胞特异性蛋白Vimentin的表达
[0034] 将BMMSCs以IX IOVcm2的密度接种于12孔培养板中，同时设置对照组和样品 组，对照组采用常规DMEM培养基，样品组在培养4天后向DMEM培养基中加入5 μ g/mL的 ox-LDL，于37°C、5% CO2的条件下诱导培养3周；用4%的中性福尔马林固定细胞，PBS缓 冲液洗涤细胞2次，在室温下用1 %的牛血清白蛋白（BSA)作为封闭液封闭细胞30分钟，然 后向细胞滴加兔抗小鼠 Vimentin抗体（1 : 200稀释），室温孵育1小时后，用PBS缓冲液 洗涤细胞3次；然后添加荧光素 Cy3标记的山羊抗兔二抗IgM(l : 200稀释），室温避光孵 育30分钟后，用PBS缓冲液洗涤细胞2次；然后滴加 He〇chest3342染料（细胞核特异性染 料，购自美国ImmunoChemistryTechnologies，LLC)溶液（1 : 500稀释），室温下孵育5分 钟后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次；置于荧光显微镜下观察、拍照，并分别统计细胞总数（即 He〇chest3342染色细胞数量）、Vimentin阳性细胞数量，并计算心肌样细胞转化率，结果如 图5、图6所示。
[0035] 心肌样细胞转化率=Vimentin阳性细胞数量/Heochest3342染色细胞数量
[0036] 实验结果证明，样品组的Vimentin阳性细胞数量以及心肌样细胞转化率均显著 高于对照组，表明ox-LDL能够诱导BMMSCs向心肌样细胞分化。
[0037] 实施例七：免疫印迹（Western-blotting)检测心肌样细胞特异性蛋白Vimentin 的表达量
[0038] 以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4周后的细 胞作为样品组，分别用总蛋白提取试剂盒提取对照组、样品组细胞的总蛋白，用12%的聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将其转到PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）上（电流为200mA，转膜 时间为2小时）；室温下用5%的BSA封闭PVDF膜1小时，然后加入兔抗小鼠 Vimentin抗 体（1 : 1000稀释），置于摇床上在4°C下过夜孵育；用含有0. 1% Tween20的Tris碱缓冲 液（TBS)洗膜3次，然后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗IgG-HR(l : 1000稀释）， 置于摇床上在室温下孵育1小时；用含有0. 1 % Tween20的TBS洗膜3次，用ECL超敏发光 液（购自美国Thermo Fisher Scientific Inc.)发光并曝光底物。以持家基因 β-actin 作为内参对照，经灰度扫描后分别与β-actin的灰度值进行比较，计算对照组、样品组的 心肌样细胞特异性蛋白Vimentin的表达量，结果如图7所示。
[0039] 实验结果证明，样品组的Vimentin表达量显著高于对照组，表明ox-LDL能够诱导 BMMSCs向心肌样细胞分化。
[0040] 实施例八：反转录聚合酶链式反应（RT-PCR)检测心肌细胞标志分子ANP、BNP、 a -MHC、β -MHC 和 a -Cardiac Actin 的 mRNA 表达量
[0041] 以实施例一培养得到的BMMSCs作为对照组，以实施例二中经诱导分化4周后的细 胞作为样品组，分别用RNA提取试剂盒从对照组、样品组的细胞提取总RNA，并用DnaseI (脱 氧核糖核酸酶）处理RNA样品，以除去DNA污染。分别将对照组、样品组的RNA样品稀释为 100 μ g/mL,分别取10 μ L样品,用反转录试剂盒合成第一链cDNA。分别以对照组、样品组的 第一链cDNA作为模板，采用表1所示的引物进行PCR反应，以测定BMMSCs经ox-LDL诱导 后的心肌细胞标志性分子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC和a-Cardiac Actin表达量。
[0042] PCR反应体系：cDNA模板100ng、引物0.3 μ Μ、10 X PCR反应液2 μ L，加入去离子水 至 20 μ L。
[0043] PCR反应条件：94°C预变性5分钟，94 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸2分 钟，30个循环后，72 °C终延伸10分钟。
[0044] 表IPCR反应引物
【权利要求】
1. 氧化型低密度脂蛋白在诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞定向分化中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在骨髓间充质干细胞的培养基中添加浓 度为g/mL的氧化型低密度脂蛋白。
【文档编号】C12N5/077GK104388384SQ201410598896
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】林俊堂, 曹毓琳, 张芬熙, 王现伟, 李永海, 丰慧根, 连杰 申请人:河南省华隆生物技术有限公司, 新乡医学院