专利名称：蛙病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖动物疾病防治的药物，特别涉及名特优水产养殖动物的疾病预防和治疗的抗病毒疫苗。该疫苗包括病毒、用于增殖该病毒的宿主细胞及其制备技术。
沼泽绿牛蛙(Rana grylio)又称美国青蛙，自80年代后期引入我国后，其养殖业发展很快，但遗憾的是沼泽绿牛蛙的病害也随之增加。据不完全统计，养蛙业每年因病致死而损失的人民币在5000万元以上。其病症表现有红腿病、水霉病、气泡病、脱皮病、肿腿病、烂皮病等，有些病表面上似乎为菌类感染，但实质上很可能是由于病毒首先入侵所致。抗菌素类的药物对这类疾病不起作用或效果很有限。目前国内尚无蛙病毒病原研究的报道，更无蛙病毒疫苗的研制报告。国外仅局限于蛙病毒病原的研究，尚未见有蛙病毒疫苗的文献报道。
近年来，我们在国内发现了一种称之为“蛙的病毒性致死综合症”疾病。对蛙的危害极大，发病主要出现在刚刚变态之后的幼蛙，其症状及发病特点是精神不振，行动迟缓，食欲减退。发病初期，蛙的体表出现出血点， 头背部皮肤开始仅局部脱落腐烂，很快烂斑扩大，病势不断加重，有的指部及趾部充血、出血或溃烂。病重的蛙体形非常消瘦，解剖发现肠壁严重充血，肠内无食物，有的肝或胆囊肿大。此病病程短、漫延极快，死亡率可高达100％。
本发明的目的在于研制出高效、稳定、安全的蛙用病毒疫苗，以防治通过其它药物难以奏效的蛙病毒性致死综合症疾病的传播和流行。
对蛙病毒感染的细胞超薄切片进行电镜观察，结果表明病毒颗粒呈球形，有囊膜，大小约为150nm。病毒在感染的细胞内复制和增殖，有的病毒颗粒分散在细胞之中，也见有大量的病毒颗粒聚集在一起呈晶格状排列。根据对蛙病毒的核酸性质及基因组大小分析的结果，表明该病毒Wv9510属虹色病毒科蛙病毒属的成员。已保藏入中国典型培养物保藏中心(武汉)，保藏编号CCTCC—V96004。
用粗提的蛙病毒悬液直接接种到长成单层的细胞上，可引起CO9510(草鱼性腺细胞)等细胞产生病变。在不同温度下细胞产生病变所需的时间以及病毒的TCID50不同，蛙病毒的滴度随培养温度升高而增加，当温度相同时，不同的细胞对蛙病毒的敏感性亦不同。蛙病毒的回归感染试验结果及免疫保护试验结果分别见表1和见表2。
表1、蛙病毒的回接感染试验结果
由表1可见该病毒对蛙有很强的致死作用。在注射了病毒两周内，试验组蛙的死亡率就达到100％；而注射生理盐水对照组的蛙则全部正常。
表2、蛙病毒疫苗的免疫保护试验结果
表2显示未用疫苗保护的对照组蛙在注射病毒三周内死亡率达到100％，而用疫苗保护的试验组蛙死亡率仅为4％。
本发明有如下效果1、疫苗的保护力强，经此疫苗免疫的蛙群，对病毒攻击的保护率可达95％。
2、宿主细胞适于大量稳定增殖病毒的需要。细胞在感染病毒约24小时，80％的细胞出现病变。在普通光镜下可见细胞的形态、折光率等发生变化，出现坏死、脱落的现象，并在单层培养细胞中局部产生空斑。因此，普通光镜下直接观察即可判定病毒感染和增殖的情况。
3、生产周期短，工艺简单。
4、无毒、安全、不污染环境和水体。
实施本发明的方法与步骤A、制备疫苗所用的病毒Wv9510是虹色病毒科蛙病毒属的成员。
B、适于病毒复制的宿主细胞为CO9510细胞(草鱼性腺细胞)。
C、宿主细胞的培养基为199培养基+10％小牛血清D、培养条件为20-30℃，PH为7.0-7.2。
E、制备疫苗的工艺流程CO9510细胞用199培养基+10％小牛血清培养20-24小时，用0.1ml(含105TCID50)的Wv9510病毒液接种后，继续培养24-36小时。收集含有扩增病毒的细胞培养液，再用0.1-0.5％分析纯甲醛，在35-56℃条件下，灭活2-4小时，制备出蛙病毒疫苗，分装后冻存于-20℃冰箱中，有效期1-2年。整个制备过程均在无菌条件下进行。
疫苗接种方法腹腔或肌肉注射均可，接种量为0.1ml/只蛙。浸泡接种有一定效果，但疫苗的用量需增加数倍。疫苗免疫后的蛙群，对病毒攻击的保护率高达95％，且安全、无毒，不污染环境和水体。
权利要求
1.蛙病毒疫苗，其特征是由蛙病毒接种入草鱼性腺细胞内增殖，经甲醛灭活而成A、草鱼性腺细胞培养20-24小时；B、接种105TCID50滴度0.1ml的蛙病毒，继续培养24-36小时；C、收集含有扩增病毒的细胞培养液，用甲醛灭活。
2.根据权利要求1所述的蛙病毒，其特征是病毒颗粒呈球形，有囊膜，直径为150nm，在草鱼性细胞上单个分散存在，群体呈晶格状排列。
3.根据权利要求1所述的草鱼性腺细胞培养，其特征是在含有10％小牛血清的199培养基内进行培养，PH7.0-7.2，培养温度20-30℃。
4.根据权利要求1所述的甲醛灭活方法，其特征是浓度为0.1-0.5％，在35-56℃温度下灭活2-4小时。
全文摘要
本发明涉及名特优水产动物疾病防治的抗病毒疫苗。以蛙病毒CCTCC-V96004感染草鱼性腺细胞CO
文档编号C12N15/86GK1161862SQ9611971
公开日1997年10月15日 申请日期1996年12月27日 优先权日1996年12月27日
发明者张奇亚, 李正秋, 桂建芳 申请人:中国科学院水生生物研究所