新型微生物及酰胺化合物的制造方法

专利名称：新型微生物及酰胺化合物的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种用于由腈得到酰胺的有用的微生物、及利用该微生物的酰胺化合物的制造方法。
酰胺及其衍生物是一种用于各个领域的有用的化合物，例如，加水分解2-羟基-4-甲硫基丁酰胺而得到的2-羟基-4丁酸用作补充含硫氨基酸类不足的饲料添加剂在家畜、特别是家畜的饲养方面已被使用。
近年来，提出了利用微生物或由微生物中提取的酶的作用、由腈生产酰胺的方法。作为微生物有以下几类例如，属于杆菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、短杆菌属的微生物(特公昭62-21519号公报)；属于棒状杆菌(corgnebacterium)属、诺卡菌(Nocardia)属的微生物(特公昭56-17918号公报)；属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物(特公昭59-37951号公报)；属于红球菌属(Rhodococcus)、节细菌属(Arthrobacter)、微杆菌属(Microbacterium)的微生物(特开昭61-162193号公报)；属于镰孢菌属(Fusarium)的微生物(特开昭64-86889号公报)；属于不动杆菌属(Acinetobacter)的微生物(特开平2-154692号公报)等。
另外，众所周知，由腈生成酰胺的方法有如下几种利用黄色杆菌属(Xanthobacter)的方法(特开平2-154692号公报)；利用克雷白杆菌属(Klebsiella)的方法(微生物文集，(Arch．Microbiology，)Vol．156p．231-238(1991))；使用链霉菌属(Streptomyces)、沙雷菌属(Serratia)、欧文菌属(Erwinia)、冢村氏菌属(Tukamurella)菌属、戈登菌属(Gordona)、摩根菌属(Morganella)、变形杆菌属(ProTeas)、肠菌属、微子囊菌属、Camdida菌属、泛菌属(Pantoea)的方法(特开平5-15384号公报)；使用柠檬酸菌属(Citrobacter)的方法(特开平5-30983号公报)；使用根瘤菌属的方法(特开平5-236977号公报)；使用土壤杆菌属的方法(特开平6-14786号公报)等。但是，这些方法生产性都差，高效地工业化生产酰胺是困难的。
在特开平4-40899号公报中公开利用胭脂红分枝杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、节细菌属、产碱菌属(Alcaligenes)的微生物、由2-羟基-4-甲硫基丁腈制造2-羟基-4-甲硫丁酰胺的方法。在该文献的实施例中记载了胭脂红分枝杆菌ATCC 33278经40小时的反应使400mM的2-羟基-4-甲硫基丁腈生成最大253mM(浓度37．7g／L、收率63％)的2-羟基-4-甲硫丁酰胺。但是，该方法酰胺生产率速度极低为1g／L．hr以下，不能提高生产率及经济效率。
另外，在WO 98／3287中记载了红球菌属菌株(strain)52及56wt由2-羟基-4-甲硫丁腈生产2-羟基-4-甲硫丁酰胺，也记载了详细的生产方法。但是，该方法在反应开始后一小时以内，菌体的比活性极低，为每1g的干燥菌体为100μmol／min．g-drycell，也不能充分改善生产效率。
另外，一般地微生物的水合活性及对酰胺的转换效率随腈的结构复杂化而变小。因此使结构复杂的腈高效率、快速地生成酰胺是困难的。
所以，本发明的目的在于提供一种用于高效、高生产速度地由腈制造对应的酰胺的有用的新型微生物、及其利用该微生物的酰胺化合物的制造方法。
本发明的另一目的在于提供一种即使腈的结构复杂也能高生产速度地生成酰胺的新型微生物、及其利用该微生物的酰胺化合物的制造方法。
本发明者为了实现所述目的进行了深入地研究，结果发现了具有高生产性地由腈生成酰胺能力的新型的微生物，完成了本发明。
也就是，本发明的微生物为示于序列表的序列号1或者序列号2所示的含有16s rRNA基因的碱基序的新型的微生物。该微生物通常具有将腈转变为酰胺的能力。所述的微生物也可以是属于红球菌属的微生物菌株例如红球菌属sp．Cr4株(FERM BP-6596号(寄存日1998年12月8日))、红球菌属sp．Am8株(FERM BP-6595号(寄存日1998年12月8日))等。而且，在本发明中也含有使所述微生物或其处理物作用于腈转变为酰胺的酰胺化合物的制造方法。所述腈也可以是2-羟基-4-甲硫丁腈等的羟腈等。
附图的简要说明

图1为显示基于属于红球菌属的本发明的新型的微生物和基于16SrRNA基因碱基序列的类似物的系统树的图。
本发明的微生物只限于含有示于序列表的序列号1或序列号2的碱基序列的16S rRNA基因的碱基序列、并具有共同的机能(使腈生成酰胺的机能)，也可以是野生株、突变株、或利用细胞融合或者基因操作法等遗传工程而衍生得到的重组株等任何一种株。另外，本发明的微生物也包括含有和序列号1或2所示的碱基序列实质上均等或者等价碱基序列的微生物。
具有所述碱基序列的微生物可以通过从土壤中分离大量的腈分解菌株而得到。特别是作为使腈变为酰胺的转变能力高的菌株，可以例示红球菌属sp．Cr4株及红球菌属sp．Am8株。这些微生物分别以FERM BP-6596号(寄存日1998年12月8日)、FERM BP-6595号(寄存日1998年12月8日)寄存在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县市东汀目潘3号)。红球菌属sp．Cr株是从冈山县冈山市的旱田采取的土壤中分离得到的菌株。该菌株的分离方法是利用有选择培养基的富集培养法[选择培养基的组成戊腈0．1g、KH2PO40．4g、MgSO4·7H2O0．01g、维生素混合液0．1ml、CoCl2·6H2O0．1mg、FeSO40．1mg、蒸馏水100ml、pH6．0]。另外，所述维生素混合液的组成为1立升蒸馏水中，生物素100mg，泛酸钙20mg、肌醇100mg、烟酸20mg、吡哆醇B6 HCl20mg、P-氨基苯甲酸10mg、核黄素10mg、叶酸0．5mg。
另外，红球菌属sp．Am8株为从岐阜县岐阜市的水田采取的土壤中分离得到的菌株。该菌株的分离用和所述Cr4株同样的培养基组成的富集培养法。
所述两个菌株都是需氧革兰氏阳性的杆菌，并在细胞壁组成中含有内消旋二氨基庚二酸、其所含的霉菌酸组成为C40-48。根据所述的真菌性质，按Bergey＇s manual of determinative bacteriology，ninth edition 1994判定所述两菌株为属于红球菌属的微生物。
另外，对所述两菌株测定了16s核糖核蛋白体RNA(rRNA)基因的碱基序列。具体地为，从所述两菌株中提取DNA，利用惯用的聚合酶链式反应(PCR)法使16S rRNA对应的16S rDNA的碱基扩增，然后，由测序仪确定该碱基序列。从两菌株得到的碱基序列完全相同。将确定的碱基序列表示于序列表的序列号1及序列号2中。进而，对得到的碱基序列进行数据库检索，研究所述两菌株和其类似菌的相同性。将其结果示于表1及表2。
表1
表2
进而根据所述相同性的结果制成系统树。将结果示于图1。
如表1及表2所示，所述两菌株的碱基序列和红球菌属的其它种类显示99．3％以下的相同性。因而判定所述两菌株为完全新型的微生物。
所述微生物对于使腈生成酰胺化合物是有用的。
腈没有特别限定，可以从广范围的腈化合物中选择。代表性的腈可以用例如式RCN或RCOCN表示(式中，R表示脂肪族烃基、脂环族烃基、芳香族烃基或杂环基，这些基也可以有取代基)。在腈类中也包含聚腈类。也就是，所述脂肪族烃基、脂环式烃基、芳香族烃基或杂环基不限于单价的基，也可以是两价或以上的多价的基团。
在所述脂肪族烃基中含有饱和脂肪族烃基及不饱和脂肪族烃基，其中，饱和脂肪族烃基为例如烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、S-丁基、t-丁基、戊基、己基、辛基、癸基等C1-12烷基，优选C1-6烷基等)、所述烷基对应的烯烃基(如C1-12烯烃基等)等的不饱和脂肪族烃基为链烯基(如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、2-丁烯基等的C2-12链烯基等)。所述的链烯基对应的二价的基、炔基(如乙炔基、2-丙炔基等的C2-12炔基等)等。
在脂环烃基中包含饱和脂环族烃基和不饱和脂环族烃基，其中，饱和脂环族烃基为环烷基(例如，环丁基、环戊基、环己基、环辛基等的C3-10环烷基等)、所述环烷基对应的环烯基等；不饱和脂环族烃为环链烯基(如，环戊烯基、环己烯基等C3-10的环链烯基等)、所述的环链烯基对应的二价的基等。
芳香族烃基可以例示有苯基、萘基等的C6-14芳基、所述芳基对应的亚芳基等。
杂环基中包含含有选自氮原子、氧原子及硫原子中的至少1个杂原子的杂环基。杂环基也可以是芳香族杂环基、非芳香杂环基、稠合杂环基中的任一个。
所述杂环基对应的杂环例如有诸如，吡咯啉、吡咯、哌啶、哌嗪、吡啶、嘧啶、哒嗪、三唑、喹啉等含氮原子杂环；诸如四氢呋喃、呋喃、吡喃等含氧原子杂环；诸如四氢化噻吩、噻吩等含硫原子杂环；诸如噻唑啉、噻二唑啉、噻唑、噻嗪、吗啉等具有选自氮原子、氧原子及硫原子中的至少2个杂原子的杂环等。
用R所示的这些基团也可以进一步具有如下取代基如卤素原子、羟基、烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基等C1-5的烷基等)、芳基(如苯基、甲苯基、氯苯、萘基等C6-14的芳基等)、氧代基、烷氧基(如甲氧基、乙氧基等C1-5烷氧基等)、芳氧基(例如，苯氧基等)、巯基、烷硫基(例如，甲硫、乙硫等C1-5烷硫基等)、芳硫基(例如，苯硫基等C6-14芳硫基等)、羧基、酯基(例如，甲氧羰基等C1-6烷氧基-羰基；乙酸基等C2-12酰氧基等)、酰基(例如乙酰基、苯酰等C2-12酰基)、氨基、单或双取代的氨基(例如，甲氨基、二甲氨基等单或双取代的-C1-5烷基氨基)、硝基等。取代基的数可以是例如1-4左右。
脂肪族腈中含有例如2-6个碳的饱和或不饱和脂肪族腈(如乙腈、丙腈、丁腈、戊腈、异戊腈等饱和单腈类；丙二腈、己二腈等饱和二脂类；丙烯腈、甲基丙烯腈、烯丙基腈、丁烯腈等不饱和腈类)等。脂肪族腈中也可以含有例如3-8左右个碳的丙酮腈例如乙酰基腈、乙基腈等的C1-4的烷基-腈；乙烯基腈、烯丙基腈等的C2-5链烯基-腈等。
脂环族腈中含有例如约有4-10个碳的脂环族腈[如氰基C4-8环烷(氰基环戊烷、氰基环己烷等)等的饱和脂环族腈。如氰基C4-8环烯烃(如氰基环戊烯和氰基环己烯等)的不饱和脂环族腈。脂环族腈中也含有约4-12个碳的腈类、例如，C4-8环烷基腈(如环戊烷腈、环己烷腈等)、C4-8环链烯腈(如环戊烯腈、环己烯腈等)等。
在芳香族腈中含有例如苯甲腈、o-、m-及p-氯苯甲腈、o-、m-及p-氟苯甲腈、o-、m-及p-硝基苯甲腈、o-、m-及p-甲基苯甲腈、2，4-二氯苯甲腈、对甲氧基苯甲腈、α-萘腈、β-萘腈、苯基腈、萘基腈等的C6-14芳香族单腈；苯二甲腈、异苯二甲腈、对苯二甲腈和邻苯二甲酰二腈等的C6-14的芳香族二腈等。芳香族腈中也含有具有C7-14芳烷基的腈如苯基乙腈、P-羟基苯基乙腈、P-甲氧基苯基乙腈、苄基乙酰乙腈、苄基腈、苯乙基腈等。
杂环腈中含有具有包含杂原子的5或者6元杂环基的腈化合物，例如含硫原子作为杂原子的5-6元杂环腈，如，2-噻吩腈、氰基噻吩、氰基硫代吡喃、硫代吡喃腈等；含氧原子作为杂原子的5-6元杂环腈，如氰基呋喃、氰基吡喃、呋喃腈、吡喃腈等；含氮原子作为杂原子的5-6元杂环腈，如氰基吡啶、氰基吡嗪、氰基哌啶、烟酰腈和异烟酰腈等；含2个或以上杂原子的5-6元杂环腈如氰基噻唑、氰基二氧戊环(cyanodioxolane)、氰基吗啉、三吖嗪腈等。另外，所述杂环腈也可以是例如稠合到杂环的苯等的芳香族环的稠合环腈(例如，5-氰基吲哚、2-氰基苯并呋喃、2-氰基喹啉、2-氰基苯并吗啉等)。
优选的腈例如有以氨基、羟基等作为取代基的所述腈类。特别优选氨基腈(例如，氨基乙腈、α-氨基丙腈、α-氨基丁腈等的α-氨基腈；如，3-氨基丙腈等的β-氨基腈等)、羟腈。
醇腈(氰醇)可以用如下式(1)表示，(式中，R1表示烃基或杂环基，这些基团也可以具有取代基)。 所述R1是烃基、杂环基及这些基团可以具有取代基例如描述在对所述R说明的段节中，如脂肪族烃基、脂环式烃基、芳香族烃基、杂环基及可以具有这些基的取代基等。
优选的R1中含有例如，在描述R的段节中的含有约1-12个碳(优选1-6)左右的烷基、约2-12碳的烯基、约2-12碳的炔基、约3-10碳的环烷基、约6-14碳的芳基、及C7-10芳烷基(如苯甲基、2-苯基乙基、1-苯基乙基、3-苯基丙基、4-苯基丁基等)等。
羟腈的碳数例如为2～18，优选3-12，更优选3-8左右。羟腈中包含例如α-羟腈、β-羟腈、γ-羟腈等。
α-羟腈可表示为如下式(2)所示的化合物， (式中，R2、R3可相同或不同，表示氢原子、或者可以具有取代基的烃基，R2和R3可以和邻接的碳原子共同形成环，但是，R2和R3不同时为氢原子)。
所述R2、R3所示的烃基及可以具有烃基的取代基，可以列举的有，在说明R的段节中所述的脂肪族烃基、脂环式烃基、芳香族烃基及可以具有这些基团的取代基等。在优选的R2、R3中包含例如选自所述优选的R1等中的基团。
R2和R3与邻接的碳原子一起形成环时的所述环例如有约3-10个碳的环丁基、环己基、环庚基、环辛基环等的环烷环等。
α-羟腈的具体例如下如羟基乙腈、2-羟基丙腈、羟甲基硫代乙腈、丙酮合羟腈、2-甲基硫代乳腈、羟基二甲基硫代乙腈、2-羟基丁腈、2-羟基-4-甲基硫代丁腈、2-羟基-2-甲基丁腈、2-羟基-3-甲基丁腈、2-羟基-3-甲基硫代丁腈、2-羟基戊腈、2-羟基己腈、2-羟基-4-甲基硫代己腈、2-羟基硫代辛腈等的饱和脂肪族α-羟腈；如2-羟基-3-丁烯腈和2-羟基-4-甲基硫代-3-丁烯腈等的不饱和脂肪族α-羟腈；如2-羟基-环己烷腈、环戊酮羟腈、环己酮羟腈等的脂环式α-羟腈；1-氰基-1-羟基苯、苯乙醇腈、2-羟基-3-苯基丁腈、2-羟基-3-苯基-4-甲基硫代丁腈等的芳香族α-羟腈等。
β-羟腈可例示如下例如3-羟基丙腈、3-羟基-3-甲基硫代丙腈、3-羟基丁腈、3-羟基-4甲基硫代腈、3-羟基己腈、3-羟基-4-甲基硫己腈、3-羟基-3-苯基丙腈等的3-羟基C3-8链烷腈；如1-氰基-2-羟基环戊烷、1-氰基-2-羟基环己烷等的1-氰基-2-羟基C3-8环烷；如3-羟基环戊烷腈、3-羟基环己烷腈等的3-羟基C3-8环烷-腈；如O-氰基苯酚、2-氰基萘酚、3-羟基-3-苯基丙腈、3-羟基-4-苯基丁腈、3-羟基-4-甲硫基-4-苯基丁腈等的芳香族β-羟腈等。
γ-羟腈可例示如下例如4-羟基丁腈、4-羟基戊烷腈、4-羟基己烷腈等的4-羟基C3-8烷腈；如3-羟基己烷腈等的3-羟基C3-8烷腈；如4-羟基-4苯基丁腈等的芳香族γ-羟腈等。
优选的腈中含有α-羟腈(乙乳腈、丙酮羟腈等约3-8个碳的脂肪族α-羟腈等)、特别是，含有甲硫基的α-羟腈(如2-羟基-4-甲基硫代丁腈等)等。
所述腈可以用常用的方法得到。例如，脂肪族腈可以用使卤化烷或者二烃基硫酸盐和氰化钾等的碱金属的氰化物等反应而制得。芳香族腈可以用使胺进行重氮化后和氰化铜(Ⅰ)反应的方法而进行制造。
腈中，特别是α-羟腈可以用如下方法制得即，醛或酮和氰化氢作用的方法、或者醛或酮的亚硫酸氢钠的加成产物和氢化钾等的碱金属氰化物等作用的方法。另外，β-羟腈可以用环氧化合物和氰化氢进行反应而制得。
在本发明中，将所述微生物的菌体或者其处理物作用于所述腈而转变成对应的酰胺化合物。所述微生物优选例如采取在液体培养基或者平板培养基上培养的菌体，根据需要配制固定化菌体、粗酶、固定化酶等的菌体处理物，从而使其作用于腈化合物。
培养所述微生物的培养基可以使用含有选自通常滋养微生物的葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉等的糖类，甘油、山梨糖醇、乙醇等醇类，富马酸、柠檬酸、乙酸、丙酸等的有机酸类及其盐类，石蜡等烃类等中的至少一种碳源；如硫酸铵、硝酸铵等的氮源；含有硫酸镁、氯化亚铁(Ⅱ)、氯化钴等的无机营养素及金属的培养基、或者在这些培养基上添加有如酵母提取物、肉提取物等的天然有机氮源的培养基等。
根据需要在所述培养基中也可以添加促进微生物的繁殖的因素、有效地保持培养基的pH的缓冲物质、提高反应生成物酰胺的生成能力的因素(诱导源及金属)等。
所述诱导源例如有适于各种微生物的如乙腈、异戊腈、异丁腈、苯甲腈等的腈化合物，另外还有乙酰胺、丙酰胺等的酰胺化合物。
这些诱导源及金属可以使用一种，也可以两种以上混合而使用。另外，所述培养基也可以是液体培养基、固体培养基(平板培养基等)等。
微生物的培养只要是在可能生长的条件下就可以，例如培养基的pH通常为pH2～12，优选pH4～10，更优选pH5～8左右，培养温度例如通常的5～60℃，优选10～50℃，更优选20～40℃左右。培养只要是培养到微生物的活性为最大就可以，培养时间例如10小时～10天左右，优选1～4天左右。微生物的培养在厌氧或需氧哪一个条件下都可以，但优选在需氧条件下进行。
从所述微生物的培养物提取菌体可以利用惯用的方法，例如离心分离法进行。另外，菌体的破碎可以利用如均化器机械地进行，也可以使用超声波处理。
所述微生物可以作为原菌体使用，也可以作为菌体处理物使用。所述处理物只要是具有至少所述的碱基序列的处理物就可以，对菌体进行的各种处理包含如机械性处理(如菌体破碎物等)、溶剂处理(如丙酮处理物等)、冷冻(如冷冻干燥物等)、提取(如酶粗酶或精制酶等的菌体中得到的提取物等)。也可以是经过这些综合处理的处理物。这些菌体或其处理物可以通过例如聚丙烯酰胺凝胶法、含硫多糖凝胶法(carageenan gel immobilization)、藻酸凝胶法、琼脂凝胶法等常用的方法而固定化。
由腈转变为酰胺可以通过在含有得到的菌体或处理物的水或缓冲液等和含有菌体或处理物的基质(腈化合物)的有机溶剂(如n-己烷、乙酸乙酯等的非水溶性溶剂)溶液的两相体系中的反应进行，另外，也可以通过在含有菌体或处理物的水或缓冲液的悬浊液中直接添加基质(腈化合物)的缓冲溶液或水溶性有机溶剂(乙醇等)混合而得到的单相体系中的反应而进行。所述基质(腈化合物)也可以不完全溶解。
反应体系的所述菌体或菌体的处理物的浓度例如为0．01～70重量％、优选0．05～30重量％、更优选0．1～10重量％左右。基质浓度为0．1～80重量％、优选1-60重量％左右，更优选5～50重量％左右。
反应温度只要是反应能进行的程度就可以，例如，0～60℃、优选5～50℃、更优选10℃～40℃左右。例如在添加有水溶性有机溶剂的体系中，反应体系的温度可以为0℃以下。反应的pH例如为3～12、优选4-10、更优选5-8左右。反应时间例如为1分～100小时，优选5分～50小时、更优选30分～30小时左右。
利用所述的反应将所述RCN、RCOCN表示的腈化合物转变为对应的RCH2NH2、RCOCH2NH2(式中，R与所述相同)表示的酰胺化合物。例如，利用2-羟基-4-甲基硫代丁腈作为腈，可以得到2-羟基-4甲基硫代丁酰胺。
得到的酰胺化合物可以利用惯用的方法分离精制。例如，将反应液浓缩，离子交换、电渗析、提取、晶析、膜分离、离心分离等分离装置，利用离心分离、膜分离等将菌体从反应液除去，之后，通过所述分离装置，利用所述方法可以分离目的化合物酰胺化合物。
另外，由得到的酰胺化合物也能制得羧酸。例如，根据特开平10-179183号公报中记载的方法等将由本发明得到的2-羟基酰胺等酰胺化合物加水分解，这样可以制得2-羟基羧酸等的羧酸。在特开平10-179183号公报中公开如下使微生物作用于腈而生成对应的酰胺，在碱(如氢氧化钠等碱金属氢氧化物等)的存在下加水分解该酰胺而生成对应的羧酸盐，进而对该羧酸盐进行电渗析而生成羧酸和碱。将该方法和利用本发明的微生物的酰胺化合物的制造方法配合使用，不使用硫酸作为腈的水合催化剂，不伴有硫酸氢铵等副产物的产生也能得到羧酸。
本发明的新型的微生物由于具有特定的碱基序列，所以具有优良的将腈转变为酰胺的能力，相对的转换反应(反应活性及选择性)高。另外，腈化合物的结构即使复杂，也能以高速度生成对应的酰胺化合物。而且，将所述微生物作用于腈化合物时，能够高效、高生产性地制得酰胺化合物。
利用高效液相色谱[柱J＇sphere ODS-M80(4．6×250mm、YMC(株)公司制)]在下述条件下进行反应产物的定量测定。
流动相0．1重量％磷酸∶乙腈∶甲醇=8∶1∶1流速1．0mL／分检测波长210nm柱温40℃
(1)培养基组成(单位w／v)巴豆酰胺0．5％酵母提取物 0．2％胨 0．02％L-谷氨酸钠 1．5％硫酸镁5水合物 0．05％氯化钴6水合物 2×10-5％硫酸亚铁7水合物 2×10-5％去离子水剩余部分pH6．8(2)培养条件从斜面培养基上采取1铂环的红球菌属sp．Cr4株及红球菌属sp．Am8株的菌体，分别在坡口烧瓶中将这些菌体放入经灭菌的50ml的有所述组成的液体培养基中而接种，在37℃、需氧条件下振荡培养3天时间。培养结束之后，利用离心分离从液体培养基中集聚菌体，而得到湿菌体。
(B)反应将0．25g所述湿菌体和23．75g0．05M磷酸缓冲溶液(pH6．0)放入50mL烧杯中，边搅拌边将其冷却至10℃。在所述混合液到达10℃时，加入1．96g的2-羟基-4甲基硫代丁腈，反应120分钟。反应结束之后，任一种菌体都完全消耗反应液中的2-羟基-4-甲基硫代丁腈。另外，2-羟基-4-甲基硫代丁酰胺的生成物均为89．7g／L，收率几乎100％。另外，生成2-羟基-4-甲基硫代丁酰胺的速度为45g／L·hr，每1g干燥菌体的比活性为7800μmol／min·g-干细胞。序列号1为红球菌属sp．Cr4(FERM BP-6596号)的16S rRNA基因子的碱基序列。
序列号2为红球菌属sp．Am8株(FERM BP-6595号)的16S rRNA遗传因子的碱基序列。
序列表<110>Daicel Chemical Industries，Ltd．<120>新型微生物及用于制备酰胺化合物的方法<130>FP-99108PC<140>
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<150>JP P1998-356229<151>1998-12-15<160>2<170>PatentIn Ver．2．1<210>1<211>1480<212>DNA<213>未知生物体<220>
<223>未知生物体的描述红球菌属sp Cr4(FERM BP-6596)的16SrRNA基因<400>1cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc 60agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac 120ttcgggataa gcccgggaaa ctgggtctaa taccggatat gaccatgagc tgcatggctc 180gtggtggaaa ggtttactgg tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt 240aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga 300ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga 360aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420gcagggacga agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggccaac tacgtgccag 480cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg 540taggcggttt gtcgcgtcgt ctgtgaaaac ccgcagctca actgcgggct tgcaggcgat 600acgggcagac ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc 660agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg 720agcgaaagcg tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg 780ggcgctaggt gtgggtttcc ttccacggga tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc 840cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900cggcggagca tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatat 960accggatcgc ctcagagatg gggtttccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg 1020tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080gtgttgccag cacgtaatgt tggggactcg caggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa 1140
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<223>未知生物体的描述红球菌属sp．Am8(FERM BP-6595)的16SrRNA基因<400>2cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc 60agcttgctgg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccctgcac 120ttcgggataa gcccgggaaa ctgggtctaa taccggatat gaccatgagc tgcatggctc 180gtggtggaaa ggtttactgg tgcaggatga gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt 240aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga 300ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcga 360aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca 420gcagggacga agcgcaagtg acggtacctg cagaagaagc accggccaac tacgtgccag 480cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tactgggcgt aaagagctcg 540taggcggttt gtcgcgtcgt ctgtgaaaac ccgcagctca actgcgggct tgcaggcgat 600acgggcagac ttgagtactg caggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tgaaatgcgc 660agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggcagtaact gacgctgagg 720agcgaaagcg tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg 780ggcgctaggt gtgggtttcc ttccacggga tccgtgccgt agctaacgca ttaagcgccc 840cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900cggcggagca tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg tttgacatat 960accggatcgc ctcagagatg gggtttccct tgtggtcggt atacaggtgg tgcatggctg 1020tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080gtgttgccag cacgtaatgt tggggactcg caggagactg ccggggtcaa ctcggaggaa 1140ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgtccag ggcttcacac atgctacaat 1200ggccggtaca gagggctgcg ataccgtgag gtggagcgaa tcccttaaag ccggtctcag 1260ttcggatcgg ggtctgcaac tcgaccccgt gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca 1320gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcatgaaag 1380tcggtaacac ccgaagccgg tggcctaacc ccttgtggga gggagccgtc gaaggtggga 1440tcggcgattg ggacgaagtc gtaacaaggt agccgtaccg 1480
权利要求
1．一种微生物，其中，含有包含序列表所示的序列号1或序列号2所示的碱基序列的16s rRNA基因碱基序列。
2．如权利要求1所述的微生物，其中，具有将腈转变为酰胺的能力。
3．如权利要求1所述的微生物，其中，为属于红球菌属的微生物。
4．如权利要求1所述的微生物，其中，微生物为红球菌属sp．Cr4株(FERM BP-6596号)。
5．如权利要求1所述的微生物，其中，微生物为红球菌属sp．Am8株(FERM BP-6595号)。
6．一种酰胺化合物的制造方法，其中，使权利要求1所述的微生物或其处理物作用于腈，而转变为酰胺的。
7．如权利要求6所述的酰胺化合物的制造方法，其中，腈为下式(1)所示的羟腈。 式中，R1表示烃基或杂环基，这些基团也可以有取代基
8．如权利要求7所述的酰胺化合物的制造方法，其中，羟腈为具有甲硫基的α-羟腈。
9．如权利要求7所述的酰胺化合物的制造方法，其中，羟腈为2-羟基-4-甲基硫代丁腈。
1O．一种酰胺化合物的制造方法，其中，将16S rRNA基因的碱基序列和序列表的序列号1或序列号2所示的碱基序列具有99．4％或以上相同性的微生物或者其处理物作用于腈，使所述腈转变为酰胺化合物。
全文摘要
使用特定盐基序列的新型的微生物16srRNA基因的盐基序列,将结构复杂的腈化合物(2－羟基－4－甲基硫代丁腈等)以高生产效率转变成酰胺化合物。所述微生物使用红球菌属sp.Cr4株或红球菌属sp.Am8株等。
文档编号C12N15/09GK1290296SQ99802949
公开日2001年4月4日 申请日期1999年12月13日 优先权日1998年12月15日
发明者松山彰收, 河边正人, 长泽透 申请人:大赛璐化学工业株式会社