专利名称：基质金属蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，进一步说，本发明涉及可在癌的转移、溃疡的形成、风湿性关节炎、骨质疏松症、牙周炎及皮肤老化等因MMP的亢进而引起的各种疾病的预防、抑制以及症状的改善等方面产生一定效果、同时具有高安全性的MMP抑制剂。
背景技术：
癌症几乎是所有先进国家的主要死亡原因之一，在日本，约有三成人是死于癌症的。近年来，随着外科疗法、放射性疗法的发展，几乎可除去癌症的原发病灶，但是，因为癌具有转移性，所以死亡率还是很高，并且在现阶段还很难治疗多发性转移的癌。因此，还应该在以往的治疗原发病灶方法的基础上制定抑制癌转移的方法来作为治疗癌症的主要目标之一。在这种情况下，癌转移机制在分子级别上已逐渐清楚，并且最近作为一种转移过程的细胞外基质的分解系统已引起人们的关注。
所谓癌的转移是指从原发部位脱离的癌细胞随着血液的流动散布到全身各处，并在其他器官上存活，进而在该组织内重新开始繁殖的过程。一般来说，因为肿瘤组织都是由致密的细胞外基质所包围，所以，癌细胞若要从原发部位移动，则需要进行细胞外基质的酶分解。细胞外基质由胶原、弹性蛋白、粘连蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖等多种大分子构成，而与这些细胞外基质的分解有关的主要酶群则是MMP。根据如下文献1所记载，在癌组织中血管形成时或者癌转移时，MMP的表达量上升，并引起酶的活化。因此，可知降低这些酶的表达量或者抑制其活性，可以抑制癌细胞的浸润性，从而可抑制转移。
文献1为“肿瘤浸润及基质金属蛋白酶合成的类维生素A介导抑制”(Schoenermark M P等，“Annals New York Academy of Sciences”Vol.878，第466-486页，1999年)。
在癌细胞向大分子群的浸润过程中，尤其以胶原的分解作为重要步骤。例如，当癌细胞要侵入到血管内或向血管外脱离时，需要分解血管基底膜中所存在的IV型胶原。如下述文献2中所公开，Liotta等人认为癌细胞分泌的IV型胶原分解酶的作用是决定癌转移能力的重要因素。属于MMP的明胶酶是由纤维母细胞、内皮细胞、癌细胞等产生的酶，能够分解IV型胶原、明胶、弹性蛋白等基质。因此，例如对明胶酶有抑制作用的物质具有抑制癌组织中的血管化和癌细胞的转移的效果，所以可用于癌疾病的预防及治疗。
文献2为“转移可能性与基底膜胶原酶分解的关系”(Liotta LA等，“Nature”，Vol.284，第67-68页，1980年)。
下述文献3中公开了MMP不仅对癌症疾病，也对溃疡的形成、风湿性关节炎、骨质疏松症、牙周炎等各种疾病中的细胞外基质的分解起很重要的作用。而且，在皮肤中，因紫外线等外部刺激而被激活的MMP将分解出维持皮肤结构的重要成分。因此，最近MMP作为通过紫外线激活的老化加速因子而受人们的关注。
文献3为“作为组织破坏性蛋白水解酶的基质金属蛋白酶”(中田光俊、冈田保典，“呼吸”，Vol.18，No.4，第365-371页，1999年)。
由于MMP的抑制剂有利于因MMP的亢进而引起的上述疾病的治疗及改善，因此正在各方面进行积极的筛选。关于这种抑制剂，在下述文献中有所记载日本专利特开平9-40552号公报；日本专利特开平11-147833号公报；日本专利特开2000-226311号公报。
发明内容
这里，本发明的目的是获得一种MMP抑制剂，所述MMP抑制剂对于高转移性恶性肿瘤细胞株产生的MMP具有抑制其活性的作用，并可预防及改善癌转移等因MMP的亢进而引起的疾病。
本发明的发明人将安全性高的植物提取物作为原料进行了MMP抑制活性的筛选。其结果发现了万年菇的溶剂提取物具有优异的MMP抑制效果，并且在使用实验性肺转移模型的动物实验中，也具有很高的癌转移抑制效果，从而完成了本发明。即，可通过其特征为以万年菇的溶剂提取物为其有效成分的MMP抑制剂来实现上述目的中的至少一种。
此外，本发明也适用于特征为含有万年菇溶剂提取物的、并以MMP亢进性疾病的预防、抑制或者病症的改善等为目的的医药品、准医药品、化妆品或者食品等。
发明的最佳实施方式下面，详细说明本发明的具体实施方式
。本发明所使用的万年菇是用于中草药“灵芝”中的担子菌，属于灵芝菌科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)，包括灵芝(赤芝)、黑灵芝(黑芝)、紫芝等。根据文献“Acta Microbiologica Sinica，19(3)，265-279，1979”，其可被分为灵芝(赤芝，学名Ganoderma lucidum)、黑灵芝(学名Ganoderma atrum)、紫芝(学名Ganoderma sinense)，但并不仅限于此。用于本发明的万年菇可以使用在中国和日本市场中广泛流通的万年菇。此外，在万年菇中，优选灵芝(赤芝)和黑灵芝，首选黑灵芝。
关于提取溶剂，例如可以列举水、低级单羟基醇(甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇等)、液态多羟基醇(1，3-丁二醇、丙二醇、丙三醇等)、酮类(丙酮、丁酮等)、乙腈、酯类(醋酸乙酯、醋酸丁酯等)、烃类(己烷、庚烷、液体石蜡等)、醚类(乙醚、四氢呋喃、丙基醚等)。比较好的是水、上述低级醇类及酮类等极性溶剂。也可以将上述溶剂中的一种或者两种混合使用。此外，当用于内服时，应从中选择适合内服的溶剂。
万年菇的溶剂提取物的混合量并没有特别的限制，在MMP亢进性疾病的预防改善医药品、准医药品、化妆品或者食品的总量中，干燥物占0.0005～10.0wt％，优选是0.005～5.0wt％。当小于0.0005wt％时，本发明难以充分发挥出效果，而即使混合10.0wt％以上，也很难看出效果有所增强，而且不经济。
万年菇的溶剂提取物可以直接使用所提取的溶液，也可以根据需要进行浓缩、稀释、过滤等处理及利用活性碳等进行除色、除味处理后使用。而且，也可以对提取的溶液进行浓缩干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等处理后，作为干燥物来使用。
本发明的MMP抑制剂可以用在以预防、抑制MMP亢进性疾病或者改善其症状为目的的医药品、准医药品、化妆品或者食物中，可以直接使用上述提取物，也可以在不影响提取物效果的范围内，混合添加通常的医药品、准医药品、化妆品、食品中所使用的成分，如定型剂、稳定剂、保存剂、结合剂、破坏剂、碳氢化合物、脂肪酸、醇、酯、表面活性剂、金属皂、pH调节剂、防腐剂、香料、保湿剂、粉剂、紫外线吸收剂、增稠剂、色素、抗氧剂、漂白剂、螯合剂、油脂、蜡等成分。
作为本发明的剂型，例如，可以使用粉剂、丸剂、片剂(锭剂)、注射剂、栓剂、乳剂、硬胶囊剂、颗粒剂、液剂(包括酊剂、流动提取剂、醇剂、悬浊剂及柠檬水剂等)、化妆水、乳膏剂、乳液、凝胶剂、气雾剂、面膜、净化剂、洗浴剂、粉底、痱子粉、口红、软膏、湿敷剂、膏剂、膏药、香精、片状食物、饮料等。
下面列举了用于对本发明进行详细说明的实施例，但本发明并不只局限于此。实施例中所示的混合量的“份”表示的是按重量计的份。
制造例一 黑灵芝的热水提取物向20g黑灵芝的干燥物中添加400ml的纯净水，在95～100℃下连续萃取两个小时后，进行过滤，然后，浓缩其滤液，冷冻干燥，得到黑灵芝的热水提取物1.4g。
制造例二 黑灵芝的50％乙醇提取物向100g黑灵芝的干燥物中添加900ml的50％乙醇，在常温下连续萃取七天后，进行过滤，然后，浓缩其滤液并干燥，得到黑灵芝的50％乙醇提取物1.9g。
制造例三 黑灵芝的乙醇提取物向100g黑灵芝的干燥物中添加900ml的乙醇，在常温下连续萃取七天后，进行过滤，然后，浓缩其滤液并干燥，得到黑灵芝的乙醇提取物1.5g。
制造例四 灵芝(赤芝)的热水提取物向20g灵芝(赤芝)的干燥物中添加400ml的纯净水，在95～100℃下连续萃取两个小时后，进行过滤，然后，浓缩其滤液，冷冻干燥，得到灵芝(赤芝)的热水提取物2.0g。
制造例五 灵芝(赤芝)的50％乙醇提取物向100g灵芝(赤芝)的干燥物中添加900ml的50％乙醇，在常温下连续萃取七天后，进行过滤，然后，浓缩其滤液并干燥，得到灵芝(赤芝)的50％乙醇提取物3.1g。
制造例六 黑灵芝的乙醇提取物向100g灵芝(赤芝)的干燥物中添加900ml的乙醇，在常温下连续萃取七天后，进行过滤，然后，浓缩其滤液并干燥，得到灵芝(赤芝)的乙醇提取物2.5g。
实施例一 粉剂1配方混合量1.黑灵芝的热水提取物(制造例一) 2.0份2.干燥玉米淀粉 38.03.微结晶纤维素 60.0[制法]将组分1～3混合，形成粉剂1。
实施例二 粉剂2在实施例一中，将黑灵芝的热水提取物替换成黑灵芝的50％乙醇提取物(制造例二)，得到粉剂2。
实施例三 粉剂3在实施例一中，将黑灵芝的热水提取物替换成灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)，得到粉剂3。
实施例四 粉剂4在实施例一中，将黑灵芝的热水提取物替换成黑灵芝的热水提取物(制造例一)和灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)的等量混合物，得到粉剂4。
比较例一 粉剂A(不含万年菇的溶剂提取物的粉剂)在实施例一中，将黑灵芝的热水提取物替换成干燥玉米淀粉，得到粉剂A。
实施例五 片剂配方 混合量1.黑灵芝的乙醇提取物(制造例三)5.0份2.干燥玉米淀粉25.03.羧甲基纤维素钙 20.04.微结晶纤维素40.05.聚乙烯吡咯烷酮 7.06.云母3.0[制法]将组分1～4混合，然后，添加组分5的水溶液作为结合剂而形成颗粒。向形成的颗粒内添加组分6并进行压片。得到1粒0.52克。
实施例六 片状食品配方 混合量1.灵芝(赤芝)的50％乙醇提取物(制造例五)2.0份2.干燥玉米淀粉50.03.丁四醇 40.04.柠檬酸 5.05.脂肪酸糖酯 3.0
6.香料 适量7.水适量[制法]将组分1～4及7混合，形成颗粒。在形成的颗粒内添加组分5及6并进行压片。得到一粒1.0g。
实施例七 饮料配方混合量1.灵芝(赤芝)的乙醇提取物(制造例五) 1.0份2.甜菊 0.053.苹果酸5.04.香料 0.15.使总量达到100份的水[制法]将组分2及3用少量的水溶解。然后，加入组分1、4及5进行混合。
下面，列举实验例对本发明的效果进行详细说明。
实验例-1 MMP抑制实验使用明胶酶图谱法，对万年菇的溶剂提取物对明胶酶活性的抑制作用进行实验。即，制造含有0.6mg/ml明胶的10％SDS-PDGE凝胶(1mm厚)，在非还原条件下电泳B16老鼠黑素瘤细胞培养液上层0.014ml。然后，在室温下、在30分钟内、使用2.5％TritonX-100(SIGMA公司制造)的溶液清洗凝胶两次以除去SDS，并且在37℃下，在含有200mM氯化钠、5mM氯化钙、0.01％brij-35(SIGMA公司制造)的30mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH7.6)中培养24小时。此时，将黑灵芝的热水提取物(制造例一)、灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)或者黑灵芝的热水提取物和灵芝(赤芝)的热水提取物的等量混合物添加到浸入凝胶的缓冲剂中。反应结束后，通过0.2％的考马斯亮蓝R(マクシ公司制)的溶液染色，通过5％的甲醇-7.5％醋酸溶液褪色。使用显像密度计(Atto公司制造的Atto Densitograph AE-6905)对作为在蓝色凝胶上未被染色的条块而被检测的明胶酶活性进行量化，算出抑制率。抑制率(单位是％)的计算是利用比重计的数值、根据下面的式子(1)来计算的。其结果如表1所示，万年菇的溶剂提取物以依赖于浓度的方式对B16老鼠黑素瘤细胞产生的明胶酶进行抑制。
抑制率＝{1-(A/B)}×100…(1)A添加万年菇的溶剂提取液时的比重计的数值B不添加万年菇的溶剂提取液时的比重计的数值表1
实验例-2 MMP抑制实验此外，可以使用灵芝(赤芝)的50％乙醇提取物(制造例五)、灵芝(赤芝)的乙醇提取物(制造例六)、黑灵芝的50％乙醇提取物(制造例二)及黑灵芝乙醇提取物(制造例三)来进行相同的实验。其结果如表2所示。同时，所述四个例子中提取物在各自反应液中的最终浓度都非常低，为0.03％。相对于万年菇的热水提取物，在这个较低浓度下，使用乙醇提取物能更有效地抑制B16老鼠黑素瘤细胞产生的明胶酶。
表2
实验例-2 癌转移抑制实验将黑灵芝的热水提取物(制造例一)、灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)或者黑灵芝的热水提取物和灵芝(赤芝)的热水提取物的等量混合物按照一日一次、每次以100mg/kg的浓度经腹腔连续一周输入给C57BL/6老鼠。向对照组的腹腔内输入生理盐水。实验动物的数目为一组八只。然后，从尾静脉向每一只老鼠注射B16老鼠黑素瘤细胞1×105个。在此之后，继续输入试样，并从癌细胞的接种开始三周后摘除肺，固定在10％福尔马林溶液中。将福尔马林固定的肺分成五片，计算在其表面上形成的转移巢的数量。其结果如表3所示，与对照组相比较，摄入万年菇的溶剂提取物可以显著地抑制转移巢的形成。即万年菇的溶剂提取物具有充分的抗转移效果。
表3
从上面可以看出，黑灵芝的热水提取物(制造例一)、灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)及黑灵芝的热水提取物与灵芝(赤芝)的热水提取物的等量混合物的MMP抑制作用和癌转移抑制效果都很优异。此外，还进行了黑灵芝和灵芝(赤芝)的50％乙醇提取物及乙醇提取物(制造例二、三、五及六)的实验，其MMP的抑制作用和癌转移抑制效果同样也很优异。
实验例-3 癌转移抑制实验在市售饲料(东方酵母工业制造，老鼠、鼠饲养用MF)中，分别以5.0％的浓度添加本发明的粉剂1～4(实施例一～四)来配制饲料，其中分别含有黑灵芝的热水提取物(制造例一)、黑灵芝的50％乙醇提取物(制造例二)、灵芝(赤芝)的热水提取物(制造例四)或者黑灵芝的热水提取物和灵芝(赤芝)的热水提取物的等量混合物。让实验老鼠自由摄取各自的饲料。同样的，配制添加有5.0％的不含万年菇提取物的粉剂A(比较例一)的饲料，让实验老鼠自由摄取(对照组)。实验动物的数目为一组八只。从使用添加了粉剂的饲料饲养开始两周后，与实验例-2的情况一样进行癌细胞的移植，三周后计算转移巢的数目。其结果如表4所示，与对照组(比较例)相比，在饲料内混合含有万年菇的溶剂提取物的粉剂，可以显著地抑制转移巢的形成，即可以有效地抑制癌的转移。
表4
对于实施例五的片剂及实施例六的片状食品，使用乳钵将其粉末化，然后对粉末试样进行与粉剂相同的实验。此外，对于实施例七的饮料，可以使用胃探针按照一日一次经口输入0.3mL试样的量，同样也进行它对癌转移效果的实验。结果，在实施例五～七中也得到同样的癌转移抑制效果。
工业实用性从上述内容可以看出，万年菇的溶剂提取物对于癌细胞产生的MMP具有抑制效果，对于因MMP而引起的癌的转移有抑制效果。本发明的MMP抑制剂可以用于癌的转移、溃疡的形成、风湿性关节炎、骨质疏松症、牙周炎及皮肤老化等因MMP的亢进而引起的各种疾病的预防、抑制及症状的改善等。
权利要求
1.一种基质金属蛋白酶抑制剂，其特征在于含有万年菇的溶剂提取物。
2.一种基质金属蛋白酶抑制剂，其特征在于含有黑灵芝的溶剂提取物。
3.根据权利要求1或2所述的基质金属蛋白酶抑制剂，其特征在于提取溶剂是从水、低级醇、液态多羟基醇中选出的一种或者两种以上溶剂的提取物。
4.一种医药品、准医药品、化妆品或者食品，其目的在于对与癌的转移、溃疡的形成、风湿性关节炎、骨质疏松症、牙周炎及皮肤老化等有关的基质金属蛋白酶亢进性疾病进行预防、抑制或者病症的改善，其特征在于含有万年菇的溶剂提取物。
全文摘要
一种含有万年菇溶剂提取物的基质金属蛋白酶(MMP)亢进性疾病的预防改善剂。本发明的万年菇溶剂提取物具有抑制MMP的作用，有利于癌的转移、溃疡的形成、风湿性关节炎、骨质疏松症、牙周炎及皮肤老化等因MMP的亢进而引起的各种疾病的预防和抑制及症状的改善等。
文档编号A61P43/00GK1561222SQ0281903
公开日2005年1月5日 申请日期2002年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者服部幸治, 水谷宏, 大隅和寿 申请人:有限会社野野川商事