专利名称：脉络宁注射制剂及其制备方法和它的质量控制方法
技术领域：
本发明是一种脉络宁注射制剂及其制备方法和它的质量控制方法，属于药品的技术领域。
背景技术：
脉络宁注射液以传统中药金银花、牛膝、玄参、石斛为原料制成，具有养阴清热、补益肝肾、活血化瘀的功效，是治疗脉管炎、脑血栓及其后遗症等血栓闭塞性疾病的中药复方静脉注射剂，目前临床上还用于治疗冠心病心绞痛、动脉硬化症、糖尿病足坏死、新生儿硬肿症、突发性耳聋等疾病。虽然脉络宁注射液具有良好的临床应用效果，然而目前市售的脉络宁注射液存在着疗效不够好、稳定性欠性，久置易出现混浊等缺点。究其原因，主要是由于工艺不够成熟、缺乏一定的科学性所致。中国专利公报公开了“脉络宁静脉注射液的工艺方法”，申请号92107848.X，在使用过程中发现注射液贮存过程中药物的有效成分不稳定，特别是在光线照射的情况下，产品有效成分会发生变化、影响正常的使用；“注射用脉络宁及口服固体制剂的制备方法”申请号03119593.8为粉针注射制剂，但其制备方法比较落后，采用了毒性较大的甲醇、氯仿作为提取溶剂，所以得到的产品质量不理想；以牛膝、玄参、石斛、金银花四味药材制成的中药注射剂脉络宁注射制剂对治疗心脑血管疾病有很好的疗效，为了更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，迫切需要研究控制该注射制剂质量的方法；目前，以牛膝、玄参、石斛、金银花四味药材制成的中药注射剂仅仅用薄层扫描法控制石斛中滨蒿内酯的含量，方法落后，检测指标单一，不能全面反应产品的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脉络宁注射制剂及其制备工艺，这种产品可以在保证治疗效果的前提下，使产品质量更加稳定，可以长期存储，不会发生变质现象，这样方便运输、储存、使用等，通过对制备方法的调整以及对制备过程中填充剂的选择，得到的产品其起效迅速、疗效确切、安全性及稳定性好；本发明的另外一个目的还在于提供一种脉络宁注射制剂的质量控制方法，包括性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定等项目，检测指标合理，检测方法简单易行，以便更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地。
本发明是这样实现的脉络宁注射制剂，按照重量组分计算它由金银花10-80、牛膝15-85、玄参15-80、石斛20-85加适量填充剂制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。准确的说，它由金银花50g 牛膝50g 玄参50g 石斛50g加适量填充剂制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。加入的辅料是甘露醇、葡聚糖、乳糖或甘氨酸其中的一种或两种以上的混合物。本发明的制备方法是将处方中的四味药物粉碎，加4-8倍量水浸泡1-4小时，煎煮1-3次，每次0.5-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60-70％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为70-90％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，充分搅拌，在10℃以下冷藏5-20小时，减压滤过，取其澄清液，加入填充剂甘露醇、葡聚糖、乳糖、甘氨酸其中的一种或两种以上混合物1-20mg/ml，用NaOH溶液调节PH值4-9，然后将精配液经0.1-0.45μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。准确的说，将四味药物粉碎加6倍量水浸泡2小时，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为80％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，，充分搅拌，在0℃冷藏14小时，减压滤过，取其澄清液，加入甘露醇5mg/ml，用NaOH溶液调节PH值9，然后将精配液经0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。脉络宁注射制剂的质量控制方法，该质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定等项目，它将牛膝对照药材、齐墩果酸、蜕皮甾酮、玄参对照药材、哈巴俄苷、肉桂酸、石斛对照药材、金银花对照药材、绿原酸中全部或部分品种作为质量控制的检测指标、鉴别方法的检测指标、含量测定方法的检测指标及制剂指纹图谱研究的检测指标。该方法应包括以下具体项目的全部或部分内容性状该注射制剂应为无色至黄棕色澄明液体或粉末。
鉴别牛膝 方法1采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以牛膝对照药材、蜕皮甾酮、齐墩果酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的蜕皮甾酮或齐墩果酸，检测波长在203～350nm范围内。
玄参方法1采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以玄参对照药材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的哈巴俄苷或肉桂酸，检测波长在203～350nm范围内。
石斛采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以石斛对照药材作为对照，样品前处理包括先以水或乙醇或醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法。
金银花方法1采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以金银花对照药材、绿原酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。展开剂可以为醋酸丁酯、氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的绿原酸，检测波长在203～400nm范围内。
检查包括pH值、装量差异、澄明度、无菌、不溶性微粒、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、重金属、砷盐、农药残留等项目或部分项目，具体检测方法与中国药典附录收载的保持一致，另外关于钾离子、重金属、砷盐的检测方法还包括以微波消解法处理样品，进而采用原子吸收法、等离子发射光谱(ICP-AES)或电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法进行测定的方法。
有关项目的限度要求如下(1)pH值在4～9之间，或其中部分范围；(2)重金属不得过百万分之二十；(3)砷盐不得过百万分之二；(4)有机氯农药残留总量不得过百万分之一。
指纹图谱采用高效液相色谱法，样品前处理包括直接滤过取样、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再浓缩等方法，使用C8或C18类型填料的色谱柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，以梯度洗脱的方法分离，检测波长在205～450nm范围内，流速0.5～1.5ml/min，以齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸中部分品种作为特征指纹峰或内标物峰，标示出该品种注射液合计约8～12个共有峰，并分别说明了其药材归属。
含量测定方法1采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中蜕皮甾酮或齐墩果酸的含量，检测波长在203～350nm范围内。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中哈巴俄苷或肉桂酸的含量，检测波长在203～350nm范围内。
方法3采用高效液相色谱法，样品前处理同上。一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的绿原酸，检测波长在203～400nm范围内。
准确的说脉络宁注射制剂的质量控制方法，包括以下具体项目的全部内容性状本品应为无色至黄棕色澄明液体或粉末。
鉴别 牛膝方法1采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul，蜕皮甾酮作为对照品，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩。展开剂为氯仿-甲醇(11∶34)，氨气熏后再置紫外光灯254下检视，喷以2～30％硫酸乙醇，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
玄参方法1采用薄层色谱法，一般使用硅胶G为薄层板，点样量为0.7ul，以肉桂酸作为对照品，样品前为直接点样，展开剂为丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上，C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，以肉桂酸作为对照品，检测波长278nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
石斛采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为1.0ul，以石斛对照药材作为对照，样品前处理为乙醇提取后再浓缩，展开剂可以为氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
金银花方法1采用薄层色谱法，用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul之间某一体积，以绿原酸为对照品，直接点样，展开剂为醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上。使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm范围内供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
检查包括pH值、装量差异、澄明度、无菌、不溶性微粒、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、重金属、砷盐、农药残留等项目或部分项目，具体检测方法与中国药典附录收载的保持一致，另外关于钾离子、重金属、砷盐的检测方法还包括以微波消解法处理样品，进而采用原子吸收法、等离子发射光谱(ICP-AES)或电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法进行测定的方法。
有关项目的限度要求如下(1)pH值在4～9之间，或其中部分范围；(2)重金属不得过百万分之二十；(3)砷盐不得过百万分之二；(4)有机氯农药残留总量不得过百万分之一。
指纹图谱 采用高效液相色谱法，样品前处理包括直接滤过取样、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再浓缩等方法，使用C8或C18类型填料的色谱柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，以梯度洗脱的方法分离，检测波长在205～450nm范围内，流速0.5～1.5ml/min，以齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸中部分品种作为特征指纹峰或内标物峰，标示出该品种注射液合计约8～12个共有峰，并分别说明了其药材归属。
含量测定 方法1采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，测定供试品中蜕皮甾酮含量。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上，C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，检测波长278nm，以肉桂酸作为对照品，测定供试品中，测定对照品肉桂酸的。
方法3采用高效液相色谱法，样品前处理同上。使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm，测定供试品中绿原酸的含量。
与现有技术相比，本发明针对现有技术，采用水提，两次醇沉法，可明显提高有效成分的收率和产品的疗效。另外将脉络宁注射液冷冻干燥为冻干粉针，有效解决了注射液贮存过程中的稳定性问题。申请人在实验过程中分别采用微波提取法、超声波提取法、水提醇沉法提取药物中的有效成分，并以每100g原药材中滨蒿内酯的含量为检测指标，结果发现微波法提取法为0.053mg；超声提取法为0.071mg；水提醇沉法为0.088mg。尽管微波法提取的有效成分和其它方法相比有一点差距，但是并不影响产品质量和产量也容易实施；超声提取法的问题在于不容易实施；所以申请人认为采用水提醇沉法提取技术具有提取时间短的优点，能够降低生产成本、也比较适合药品工业化生产的需要；本发明中冻干前在溶液中加入填充剂，是因为脉络宁注射制剂中的有效成分滨蒿内酯在水中的溶解性不高，在冷冻干燥时会与水蒸气一起飞散，或干后变成绒毛状的松散结构；因此在冻干前在溶液中加入填充剂，可使之形成团块结构；本发明采用0.1-0.45μm的微孔滤膜过滤，可有效滤除药液中的细菌。采用冷冻干燥对药液进行干燥，是因为用喷雾干燥法与冷冻干燥法两种方法相比较，发现冷冻干燥方法从分散度、溶解性、热原去除等方面优于喷雾干燥法。与现有技术相比本发明提供的制剂具有养阴清热、补益肝肾、活血化瘀的功效，可以治疗脉管炎、脑血栓及其后遗症等血栓闭塞性疾病；临床上还用于治疗冠心病心绞痛、动脉硬化症、糖尿病足坏死、新生儿硬肿症、突发性耳聋等疾病；其起效迅速、疗效确切、安全性及稳定性好。本发明提供的制备方法和质量控制方法能更好的控制这种中药注射制剂的产品质量，保证用药的安全性，使用这种质量控制方法后，能够保证药物制成品的质量，从生产开始、选用原材料，到每一个生产过程的工艺步骤均必须严格按照工艺规程执行，否则产品就有可能不满足质量要求；我们在进行试验时发现执行这种方法，要求选用优等的道地药材，否则制成品会出现不合格的情况；更有利于指导生产，使工艺控制更加严格合理，让消费者全面认识产品品质、放心使用这类药品。本发明选取的齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸是这类药物中重要的有效活性成分，对控制药品质量是十分必要的。蜕皮甾酮具促进RNA和蛋白质的合成；影响糖代谢；促进脂类代谢；免疫调节；影响中枢神经系统作用等，具有较高的药用价值，齐墩果酸具有护肝、降糖、降脂、抗炎、抗氧化作用，两者是牛膝的主要活性成分。哈巴俄苷为玄参中含量较高的成分，具有抗慢性炎症、降压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒及免疫促进作用，是玄参的特征性有效成分之一。金银花是常用中药，其主要有效成分为绿原酸，具有抗炎、抗病毒、降血脂、免疫调节、保肝利胆之功效等。以牛膝、玄参、石斛、金银花四味药材制成的中药注射液主要功能是清热养阴，活血化瘀，抗炎解毒，用于血栓闭塞性脉管炎，静脉血栓形成，动脉硬化性闭塞症，脑血栓形成及后遗症等心脑血管疾病。检测以上成分对控制产品质量有重大意义，直接关系到临床药效，所以本发明选定了一系列的成分作为检测的指标，通过性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定等项目的检测全面合理控制产品质量，采用这样的技术手段，达到了发明的目的。
申请人进行了一系列实验，以证明利用本发明提供的药物具有比较好的治疗效果实验例1稳定性实验金银花的主要成分为绿原酸，对热不稳定，特别是在光线照射的情况下，发生分解变化影响疗效。将脉络宁水针和粉针剂置于37℃恒温箱中，放置3和个月后分别测定绿原酸的含量。
绿原酸含量mg/ml0月3月 6月水针0.365 0.2570.118粉针 0.368 0.3540.342由实验1可知，脉络宁粉针比水针稳定。
实验例2赋形剂的筛选为使结晶均匀，色泽一致，质地良好，具有理想的物理强度和较快的溶解度，进行了赋形剂的筛选。
赋形剂 用量％ 外观 溶解性甘露醇 0.2洁白，结构强度好加入溶媒后10秒即溶解氯化钠 0.2洁白，结构强度好加入溶媒后振摇1分钟溶解磷酸氢二钠 0.2有硬壳，脆散加入溶媒后振摇1分钟不能完全溶解甘氨酸 0.2粉粒粗，脆散加入溶媒后振摇2分钟溶解申请人还进行了一系列实验，可以证明利用本发明提供的质量控制方法能更好的控制这种中药注射制剂的产品质量，得到的药物具有有效的效果；实验例3蜕皮甾酮对小鼠脑缺氧的保护作用1、动物与试剂 昆明种小鼠，♂，18-22g；蜕皮甾酮，纯度95％，用时用蒸馏水配至所需浓度。
2、小鼠急性脑缺氧实验小鼠30只随机分组，ip蜕皮甾酮各剂量或等容量蒸馏水连续3d，末次给药8h后各组均sc亚硝酸钠800mg/kg，记录注射后至呼吸停止的时间。另取小鼠30只，分组及给药同上。末次给药8h后各组均ip氰化钾4.5mg/kg，记录注射后各组小鼠昏睡潜伏期及持续时间。
实验结果蜕皮甾酮14.4mg/kg，延长亚硝酸钠致缺氧小鼠的生存时间，使氰化钾致小鼠昏睡持续时间缩短，对昏睡潜伏期无影响(表1)。
药物生存时间 昏睡潜伏期昏睡持续时间蒸馏水对照组8.2±0.9 5.1±5.2 6.4±4.6蜕皮甾酮7.2mg/kg9.4±1.6 4.8±5.2 4.5±3.5蜕皮甾酮14.4mg/kg 9.8±1.2 8.7±6.5 1.6±1.73、小鼠脑组织内丙二醛含量测定方法将氰化钾致脑缺氧小鼠断头处死，取小鼠大脑，采用硫代巴比妥酸比色法，测定每克组织丙二醛生成量。
实验结果氰化钾4.5mg/kg显著提高脑组织丙二醛含量，表明脑缺氧能促进脑组织过氧化脂质的生成。蜕皮甾酮7.2mg/kg，14.4mg/kg均能对抗由氰化钾引起的脑组织丙二醛含量的升高，表明蜕皮甾酮抑制脑缺氧致脑组织过氧化脂质的生成(表2)。
Drug(mg/kg)n Content of MDA(nmol/g)Control10140.5±14.1PC 10254.6±44.9Ecd(7.2)+PC(4.5) 9 204.7±45.8Ecd(14.4)+PC(4.5) 9 162.7±55.7Control对照组 PC氰化钾Ecd蜕皮甾酮通过实验1的结果表明蜕皮甾酮对小鼠脑缺氧的保护作用。
实验例4哈巴俄苷对阴虚小鼠免疫功能的影响动物6～8周龄的LACA雄性小鼠，体重(22±3)g供试品Hps(哈巴俄苷)由玄参中提取、分离得到。整体给药用生理盐水配成所需浓度，皮下注射。体外给药用完全RPMI-1640培养液配成10g/L，微孔滤器过滤除菌，-20℃保存，使用前用完全RPMI-1640培养液稀释至所需浓度。
主要试剂(1)RPMI-1640、MTT(四甲基偶氮唑盐)、ConA(刀豆蛋白A)、POPO[(1，4双-苯基口恶唑基-2)-苯](2)CAMP、CGMP试剂盒，-20℃冻存备用。
(3)甲状腺素动物分组与模型 将动物随机分为对照组(Control)、阴虚模型组(YD)、给药组(Hps组)，每组动物数目见表。对照组小鼠每只每日灌服0.6ml自来水，皮下注射0.1ml生理盐水；阴虚模型组小鼠每只每日灌服0.6ml甲状腺素(30mg/L)，皮下注射生理盐水0.1ml；给药组小鼠每只每日灌服0.6ml甲状腺素(30mg/L)，Hps(3g/L)，持续5d，第6天处死动物。
结果1、体内给药对阴虚小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的影响阴虚小鼠脾淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应与正常对照组比较显著下降[阴虚组SI(刺激因子＝刺激孔A值/对照孔A值)值2.04±0.46，正常组SI值3.48±1.09，P＜0.05]。小鼠皮下注射Hps后，Hps可促进阴虚小鼠T淋巴细胞增殖(注射Hps组SI值3.01±0.81，P＜0.05)。
2、体内给药对阴虚小鼠脾淋巴细胞产生IL-2能力的影响从表1可见阴虚小鼠脾淋巴细胞产生IL-2水平降低P＜0.05)。小鼠皮下注射Hps后，Hps可促进阴虚小鼠脾淋巴细胞产生IL-2(P＜0.05)，并恢复正常水平。
表1 化合物Hpd、Hps对阴虚小鼠脾淋巴细胞上清中IL-2活性的影响(x±s，n＝8)DilutiionGroups 1∶2 1∶4 1∶8Control 0.33±0.02 0.24±0.010.14±0.03YD 0.24±0.01 0.16±0.020.08±0.04YD+Hps 0.33±0.01 0.23±0.030.14±0.013、体内给药对阴虚小鼠血浆CAMP、CGMP含量的影响从表2可见阴虚小鼠CAMP、CGMP的含量升高，CAMP/CGMP的值也升高(P＜0.05)。Hps可降低阴虚小鼠CAMP、CGMP的含量及CAMP/CGMP的值(P＜0.05)，并可恢复正常水平。
表2 Hps对阴虚小鼠血清CAMP、C(MP的影响(x±s，n＝10)C(nmol/L)Groups CAMP CGMPCAMP/CGMPControl44.51±3.408.07±0.35 5.26±0.21YD169.40±5.2121.95±0.367.74±0.12YD+Hps58.21±6.25 10.21±0.355.70±0.16由实验4可证明哈巴俄苷为玄参产生滋阴作用的物质基础之一。
实验3、4表明蜕皮甾酮、哈巴俄苷均具有很强的药理活性，是药材的特征性有效成分之一。
实验例5不同产地的牛膝中齐墩果酸、蜕皮甾酮的含量选用不同产地的牛膝(n＝5)，用高效液相色谱法测定其齐墩果酸、蜕皮甾酮含量的平均值，结果见表。
产地 蜕皮甾酮％齐墩果酸％河南武胜0.196 1.84山东泰安0.090 1.48河北安国0.053 1.72
实验例6玄参不同加工品中哈巴俄苷、肉桂酸的含量选用玄参(n＝5)不同加工品，用高效液相色谱法测定其哈巴俄苷、肉桂酸含量的平均值，结果见表。
部位 哈巴俄苷％肉桂酸％主根(切片晒干) 0.021 0.013须根(晒干) 0.238 0.008根茎(切片晒干) 0.111 0.011地上部分(晒干) 未检出未检出实验例7不同产地的金银花中绿原酸的含量选用不同产地的金银花(n＝3)，用高效液相色谱法测定其绿原酸的含量，结果见表。
绿原酸％品种 产地 123忍冬科植物忍冬 山东日照 7.077.56 6.01山东平邑 5.505.12 4.87山东蒙阴 3.893.56 3.01山东沂南 7.417.58 7.69实验5、6、7表明不同产地、不同加工品的药材有效成分含量差异很大，如果不对其检测，就无法防止用劣质低等药材投料，不能从根本控制产品质量。
实验例8该方制剂对血小板聚集的作用动物wistar大鼠，♂兼用，体重(264±44)g仪器MPG-30型血小板聚集仪实验1组除石斛外其余三位采用三等药材制成的注射液，经检测滨蒿内酯含量合格实验2组四味药材均采用一等品制成的注射液，经检测齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸含量合格血小扳聚集实验♂大鼠，禁食12h，戊巴比妥钠(40mg/kg)ip麻醉后，由股静脉恒速给药(0.001mL/g/min)，给药停止后5min由腹主动脉取抗凝血，按常规方法制备PRP(富血小板血浆)和PPP(贫血小板血浆)，血小板浓度调为2.2×105-2.5×105个·mL-1，分别以ADP，凝血酶或胶原为诱导剂，进行血小板聚集实验，ADP终浓度为0.5×106-1×106mol·mL-1，凝血酶终浓度为0.05-0.07U·mL-1，胶原终浓度为0.05-0.15mL贮备液/mL。
血小扳聚集率组别 剂量/gnADP 凝血酶 胶原生药·kg-1溶媒对照组 -- 1067.1±7.1 76.5±7.2 70.1±5.51组 108 58.0±5.9 69.7±6.8 67.2±4.92组 109 41.0±12.5 51.9±25.4 54.2±12.0阿司匹林组 20mg/kg1041.9±16.1 52.0±22.3 55.1±13.9实验8表明仅仅检测滨蒿内酯的含量不能有效的控制产品的质量。
具体的实施方式本发明的实施例1取金银花50g 牛膝50g 玄参50g 石斛50g，将处方中的四味药物粉碎，加4倍量水浸泡1小时，煎煮1次、3小时，过滤得滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60-70％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为70-90％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，充分搅拌，在10℃以下冷藏5小时，减压滤过，取其澄清液，加入填充剂0.2％甘露醇，用NaOH溶液调节PH值4-9，然后将精配液经0.1-0.45μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。使用方法肌注，每日一次，15天为一疗程。
本发明的实施例2取金银花80g 牛膝85g 玄参80g 石斛85g将处方中的四味药物粉碎，加8倍量水浸泡4小时，煎煮3次，每次0.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60-70％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为70-90％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，充分搅拌，在10℃以下冷藏20小时，减压滤过，取其澄清液，加入填充剂甘氨酸，用NaOH溶液调节PH值4-9，然后将精配液经0.1-0.45μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。
本发明的实施例3取金银花10g 牛膝15g 玄参15g 石斛20g将处方中的四味药物粉碎加6倍量水浸泡2小时，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为80％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，，充分搅拌，在0℃冷藏14小时，减压滤过，取其澄清液，加入葡聚糖和甘氨酸的混合物，用NaOH溶液调节PH值9，然后将精配液经0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。
本发明的质量控制方法的实施例脉络宁注射制剂的质量控制方法的内容为[性状]本品应为无色至黄棕色澄明液体或粉末。
牛膝方法1采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul，蜕皮甾酮作为对照品，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩。展开剂为氯仿-甲醇(11∶34)，氨气熏后再置紫外光灯254下检视，喷以2～30％硫酸乙醇，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
玄参方法1采用薄层色谱法，一般使用硅胶G为薄层板，点样量为0.7ul，以肉桂酸作为对照品，样品前为直接点样，展开剂为丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上，C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，以肉桂酸作为对照品，检测波长278nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
石斛 采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为1.0ul，以石斛对照药材作为对照，样品前处理为乙醇提取后再浓缩，展开剂可以为氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
金银花 方法1采用薄层色谱法，用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul之间某一体积，以绿原酸为对照品，直接点样，展开剂为醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上。使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm范围内供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰。
包括pH值、装量差异、澄明度、无菌、不溶性微粒、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、重金属、砷盐、农药残留等项目或部分项目，具体检测方法与当时现行版的中国药典附录收载的保持一致，另外关于钾离子、重金属、砷盐的检测方法还包括以微波消解法处理样品，进而采用原子吸收法、等离子发射光谱(ICP-AES)或电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法进行测定的方法。
有关项目的限度要求如下(1)pH值在4～9之间，或其中部分范围；(2)重金属不得过百万分之二十；(3)砷盐不得过百万分之二；(4)有机氯农药残留总量不得过百万分之一。
采用高效液相色谱法，样品前处理包括直接滤过取样、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再浓缩等方法，使用C8或C18类型填料的色谱柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，以梯度洗脱的方法分离，检测波长在205～450nm范围内，流速0.5～1.5ml/min，以齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸中部分品种作为特征指纹峰或内标物峰，标示出该品种注射液合计约8～12个共有峰，并分别说明了其药材归属。
方法1采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，测定供试品中蜕皮甾酮含量≥5mg/ml。
方法2采用高效液相色谱法，样品前处理同上，C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，检测波长278nm，以肉桂酸作为对照品，测定供试品中，测定肉桂酸的≥0.5mg/ml。
方法3采用高效液相色谱法，样品前处理同上。使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm，测定供试品中绿原酸的含量≥0.3mg/ml。
临床药效脉络宁治疗冠心病的疗效观察一、对象与方法1、药物脉络宁冻干粉针按照本发明的方法制备。
脉络宁注射液按照常规工艺制备。
2、对象30例患者随机分为两组，脉络宁冻干粉针组15例，其中男性9例，女性6例，年龄44-81岁；脉络宁注射液组15例，男性8例，女性7例，年龄46-80岁。冠心病诊断均符合1979年全国冠心病防治诊断标准。
3、方法30例患者均卧床休息和对症治疗(如强心、利尿、扩血管)。各组分别给予脉络宁注射液或脉络宁冻干粉针，每日一次，15天为一疗程。
4、观察指标及评定标准记录两组患者治疗心电图、超声心动图变化；心率、血压及自觉症状；心功能指标变化。心电图疗效按《卫生部一类药物临床研究指导原则》评价；心功能分级按美国纽约心脏协会分级标准。
二、结果1、一般症状及临床疗效头昏、胸闷、心悸、胸痛、气急5项中3项以上有明显改善者为显效1项以上明显改善者为有效；其余为无效。脉络宁冻干粉针组显效4例，有效10例，无效1例，总有效率为93.3％。脉络宁注射液组显效2例，有效9例，无效4例，总有效率为73.3％。
2、心电图变化治疗前脉络冻干粉针宁组中11例和脉络宁注射液组中10例有ST-T改变及心率失常。治疗后脉络宁冻干粉针组显效4例，有效5例，总有效率81.8％；脉络宁注射液组显效2例，有效5例，总有效率70％。
3、超声心动图指标变化两组超声心动图检测指标变化见表1。
表1超声心动图疗效检测指标冻干粉针组注射液组治疗前 治疗后 治疗前 治疗后SV50.12±3.570.26±4.71 50.56±3.658.13±4.12CO3.34±1.135.12±1.25 3.21±1.324.54±1.17CI2.81±1.303.68±1.05 2.70±1.223.12±1.13EF47.40±2.12 69.71±1.81 46.46±1.36 57.15±2.104、心动功能改善情况治疗后脉络宁冻干粉针组心功能改善I级以上患者为10例，总有效率66.7％；脉络宁注射液组心功能改善I级以上患者为6例，总有效率为40％；两组之间有明显差异。
三、讨论本发明得到的脉络宁冻干粉针对冠心病患者心功能、心电图特征及其临床症状的治疗作用优于现有的脉络宁注射液。
权利要求
1.一种脉络宁注射制剂，其特征在于按照重量组分计算它由金银花10-80、牛膝15-85、玄参15-80、石斛20-85加适量填充剂制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。
2.按照权利要求1所述的脉络宁注射制剂，其特征在于它由金银花50g牛膝50g 玄参50g 石斛50g加适量填充剂制备成粉针制剂或者是冻干粉针制剂。
3.按照权利要求1或2所述的脉络宁注射制剂，其特征在于加入的辅料是甘露醇、葡聚糖、乳糖或甘氨酸其中的一种或两种以上的混合物。
4.如权利要求1所述的脉络宁注射制剂的制备方法，其特征在于将处方中的四味药物粉碎，加4-8倍量水浸泡1-4小时，煎煮1-3次，每次0.5-3小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60-70％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为70-90％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，充分搅拌，在10℃以下冷藏5-20小时，减压滤过，取其澄清液，加入填充剂甘露醇、葡聚糖、乳糖、甘氨酸其中的一种或两种以上混合物1-20mg/ml，用NaOH溶液调节PH值4-9，然后将精配液经0.1-0.45μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。
5.按照权利要求4所述的脉络宁注射制剂的制备方法，其特征在于比较准确的制备方法是将处方中的四味药物粉碎加6倍量水浸泡2小时，煎煮2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.16，加乙醇至含醇量为60％，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.36，加乙醇至含醇量为80％，静置，取上清液，回收尽乙醇，加注射用水，，充分搅拌，在0℃冷藏14小时，减压滤过，取其澄清液，加入甘露醇5mg/ml，用NaOH溶液调节PH值9，然后将精配液经0.22μm的微孔滤膜过滤，灌装，冷冻干燥，即得成品。
6.如权利要求1或2所述的脉络宁注射制剂的质量控制方法，该质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定等项目，其特征在于将牛膝对照药材、齐墩果酸、蜕皮甾酮、玄参对照药材、哈巴俄苷、肉桂酸、石斛对照药材、金银花对照药材、绿原酸中全部或部分品种作为质量控制的检测指标、鉴别方法的检测指标、含量测定方法的检测指标及制剂指纹图谱研究的检测指标。
7.按照权利要求6所述的脉络宁注射制剂的质量控制方法，其特征在于该方法应包括以下具体项目的全部或部分内容性状该注射制剂应为无色至黄棕色澄明液体或粉末；鉴别牛膝采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以牛膝对照药材、蜕皮甾酮、齐墩果酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法；玄参采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以玄参对照药材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法；石斛采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以石斛对照药材作为对照，样品前处理包括先以水或乙醇或醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，展开剂可以为氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法；金银花采用薄层色谱法，一般使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以金银花对照药材、绿原酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，展开剂可以为醋酸丁酯、氯仿、丙酮、甲酸、水、甲醇、二氯甲烷、醋酸乙酯、冰醋酸中某些种类试剂按照一定比例配制而成，检视条件包括日光下、紫外光灯(254或365nm)下检视、氨气熏后再置紫外光灯(254或365nm)下检视、或喷以2～30％硫酸乙醇、或喷以磷钼酸试液等溶液显色的方法；检查包括pH值、装量差异、澄明度、无菌、不溶性微粒、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、重金属、砷盐、农药残留等项目或部分项目，具体检测方法与中国药典附录收载的保持一致，另外关于钾离子、重金属、砷盐的检测方法还包括以微波消解法处理样品，进而采用原子吸收法、等离子发射光谱(ICP-AES)或电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法进行测定的方法；其中(1)pH值在4～9之间，或其中部分范围；(2)重金属不得过百万分之二十；(3)砷盐不得过百万分之二；(4)有机氯农药残留总量不得过百万分之一；指纹图谱采用高效液相色谱法，样品前处理包括直接滤过取样、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再浓缩等方法，使用C8或C18类型填料的色谱柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，以梯度洗脱的方法分离，检测波长在205～450nm范围内，流速0.5～1.5ml/min，以齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸中部分品种作为特征指纹峰或内标物峰，标示出该品种注射液合计约8～12个共有峰，并分别说明了其药材归属；含量测定采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中蜕皮甾酮或齐墩果酸的含量，检测波长在203～350nm范围内。
8.按照权利要求6或7所述的脉络宁注射制剂的质量控制方法，其特征在于该方法中对于牛膝的鉴别可以采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的蜕皮甾酮或齐墩果酸，检测波长在203～350nm范围内；对于玄参的鉴别方法可采用高效液相色谱法，使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以玄参对照药材、哈巴俄苷、肉桂酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的哈巴俄苷或肉桂酸，检测波长在203～350nm范围内；对于金银花的鉴别方法可以采用高效液相色谱法，使用硅胶G或硅胶GF254或硅胶H为薄层板，点样量为0.5～30ul之间某一体积，以金银花对照药材、绿原酸中全部或部分品种作为对照品(药材)，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的绿原酸，检测波长在203～400nm范围内；对于含量测定可以采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中哈巴俄苷或肉桂酸的含量，检测波长在203～350nm范围内；对于含量测定还可以采用高效液相色谱法，样品前处理包括先以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或乙醚或石油醚或正丁醇提取后再浓缩等方法，一般使用C8或C18类型填料的色谱柱，以甲醇、乙腈、水、某比例(0.1～10％)的冰醋酸或磷酸、庚烷磺酸钠、二甲基甲烷等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，测定本品中的绿原酸，检测波长在203～400nm范围内。
9.按照权利要求6或7所述的脉络宁注射制剂的质量控制方法，其特征在于该方法应包括以下具体项目的全部或部分内容性状本品应为无色至黄棕色澄明液体或粉末。鉴别牛膝采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul，蜕皮甾酮作为对照品，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，展开剂为氯仿-甲醇(11∶34)，氨气熏后再置紫外光灯254下检视，喷以2～30％硫酸乙醇，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；玄参采用薄层色谱法，一般使用硅胶G为薄层板，点样量为0.7ul，以肉桂酸作为对照品，样品前为直接点样，展开剂为丙酮-二氯甲烷-醋酸乙酯(2∶54∶13)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；石斛采用薄层色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为1.0ul，以石斛对照药材作为对照，样品前处理为乙醇提取后再浓缩，展开剂可以为氯仿-丙酮-甲酸(5∶27∶10)紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；金银花采用薄层色谱法，用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul之间某一体积，以绿原酸为对照品，直接点样，展开剂为醋酸丁酯-氯仿-水(20∶13∶2)，供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；检查包括pH值、装量差异、澄明度、无菌、不溶性微粒、蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐、钾离子、重金属、砷盐、农药残留等项目或部分项目，具体检测方法与中国药典附录收载的保持一致，另外关于钾离子、重金属、砷盐的检测方法还包括以微波消解法处理样品，进而采用原子吸收法、等离子发射光谱(ICP-AES)或电感耦合等离子质谱(ICP-MS)法进行测定的方法；其中(1)pH值在4～9之间，或其中部分范围；(2)重金属不得过百万分之二十；(3)砷盐不得过百万分之二；(4)有机氯农药残留总量不得过百万分之一；指纹图谱采用高效液相色谱法，样品前处理包括直接滤过取样、以醋酸乙酯或氯仿或二氯甲烷或正丁醇提取后再浓缩等方法，使用C8或C18类型填料的色谱柱，以某比例(0.1～5％)的甲酸甲醇溶液、某比例(0.1～5％)的甲酸水溶液、甲醇、乙腈、水、等其中部分品种溶剂在合适比例条件下为流动相，以梯度洗脱的方法分离，检测波长在205～450nm范围内，流速0.5～1.5ml/min，以齐墩果酸、蜕皮甾酮、哈巴俄苷、肉桂酸、绿原酸中部分品种作为特征指纹峰或内标物峰，标示出该品种注射液合计约8～12个共有峰，并分别说明了其药材归属；含量测定采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，测定供试品中蜕皮甾酮含量。
10.按照权利要求6或7所述的脉络宁注射制剂的质量控制方法，其特征在于对于牛膝的鉴别方法采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(23∶14)为流动相，蜕皮甾酮作为对照品，检测波长为243nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰；对于玄参的鉴别方法采用高效液相色谱法，使用硅胶G为薄层板，点样量为1.0ul，以石斛对照药材作为对照，样品前处理为乙醇提取后再浓缩，C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，以肉桂酸作为对照品，检测波长278nm，供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰；对于金银花的鉴别方法采用高效液相色谱法，用硅胶G为薄层板，点样量为0.5ul之间某一体积，以绿原酸为对照品，直接点样，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm范围内供试品色谱中，与对照品色谱相同时间处，出相同色谱峰；在进行含量测定中可以采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-乙腈(32∶17)为流动相，检测波长278nm，以肉桂酸作为对照品，测定供试品中，测定肉桂酸的含量；或者采用高效液相色谱法，样品前处理为醋酸乙酯提取后再浓缩，使用C18类型填料的色谱柱，以甲醇-水(10∶21)为流动相，以绿原酸为对照品，检测波长324nm，测定供试品中绿原酸的含量。
全文摘要
本发明是一种脉络宁注射制剂及其制备方法和它的质量控制方法，脉络宁注射制剂由金银花、牛膝、玄参、石斛制备成，与现有技术相比，本发明将脉络宁注射液冷冻干燥为冻干粉针，有效解决了注射液贮存过程中的稳定性问题，本发明具有养阴清热、补益肝肾、活血化瘀的功效，可以治疗脉管炎、脑血栓及其后遗症等血栓闭塞性疾病；临床上还用于治疗冠心病心绞痛、动脉硬化症、糖尿病足坏死、新生儿硬肿症、突发性耳聋等疾病；本发明提供的质量控制方法能更好的控制这种中药注射制剂的产品质量，保证用药的安全性。
文档编号A61P9/00GK1679648SQ200410022289
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月9日 优先权日2004年4月9日
发明者于文勇 申请人:北京奇源益德药物研究所