白介素－22的医药用途的制作方法

专利名称：白介素－22的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白介素-22(Interleukin-22)的医药用途。具体涉及白介素-22在制备治疗高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖及糖尿病的药物中的用途。
背景技术：
代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、高脂蛋白血症、高血糖症、高胰岛素血症等，严重影响人类的健康。目前对这些疾病的发病机制尚不完全清楚，但一般认为遗传因素，环境因素以及人类的生活习惯导致了这些疾病的发生。
肥胖病(Obesity)是一种社会性慢性疾病，是指机体内热量的摄入大于消耗，造成体内脂肪堆积过多，导致体重超常。西方国家肥胖的定义为“体重指数”(Body Mass Index，BMI)体重(kg)/身高2(m2)≥30kg/m2。BMI 30.0～34.9kg/m2为轻度肥胖，BMI 35.0～39.9kg/m2为中度肥胖；BMI≥40kg/m2为重度肥胖。我国诊断肥胖的标准为BMI≥28kg/m2。根据肥胖的成因不同，通常分为“单纯性肥胖”和“继发性肥胖”二大类。“单纯性肥胖”又可分为“体质性肥胖”和“获得性肥胖”。其中，“体质性肥胖”与遗传有关，此类患者体内的脂肪细胞增生肥大，故又名“遗传性肥胖”；“获得性肥胖”(过食性肥胖)是指因为多食或运动量减少而引起的肥胖。而“继发性肥胖”则多由机体的某些内分泌疾病继发引起。
Leptin是1994年Friedman研究小组在ob/ob老鼠身上发现的(Zhang Y，et al.Nature 1994；372425-32.)。ob/ob老鼠是一种先天性肥胖的老鼠，他们在ob/ob老鼠身上发现一种由ob基因(肥胖基因)控制合成的蛋白质，他们把这种蛋白质激素称之为“Leptin”。Leptin是目前公认的一个调节体内能量代谢的重要激素。Leptin含有146个氨基酸残基，分子量16kDa的单链蛋白质。它主要由脂肪组织产生，在食欲控制、脂肪代谢和体重调节中发挥重要作用。Leptin主要作用在中枢神经系统的下丘脑的Leptin受体来影响食物摄取。在人类，除先天性Leptin基因缺陷、突变的病人外，Leptin的水平和人体体重指数(BMI)以及个体脂肪百分比成正比。研究表明，大多数肥胖患者对Leptin具有抵抗性。近年来的研究还发现，Leptin在造血、血管生成、淋巴器官的稳定平衡(Homeostasis)以及T细胞功能方面也有重要作用。
过多的脂肪堆积可导致肥胖病人的心脏负荷增大，进而使循环、呼吸、内分泌、免疫功能等方面发生改变。因此肥胖病人常伴有心血管系统疾病、II型糖尿病、肺病、关节炎及癌症等。同时，肥胖者体内的脂肪代谢障碍可导致其体内的胆固醇和脂肪酸过多。血中游离脂肪酸和胆固醇增高对细胞免疫、网状内皮系统和巨噬细胞的功能均有抑制作用。因而肥胖者多伴有机体免疫功能的降低，巨噬细胞吞噬能力、T细胞功能的低下。免疫功能低下与肥胖相关，在人和动物实验中都得到证实，与正常人相比，肥胖者更易发生感染(Lamas O，Eur J Clin Nutr.2002Aug；56 Suppl 3S42-5.)。肥胖病人T细胞，包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+、CD45、RO+的细胞对植物血凝素和ConA的反应明显降低，同时细胞分裂素诱导的淋巴细胞增殖反应也明显下降(Tanaka S，Clin Endocrinol(Oxf).2001 Mar，54(3)347-54；Nieman DC，J Am Diet Assoc.1999 Mar；99(3)294-9.)。近年来虽然有研究表明肥胖与免疫功能的密切关系，但是肥胖病人的免疫功能下降的分子机理尚无定论。
目前临床上的肥胖治疗药物主要分为两类减少脂肪吸收的药物(脂肪酶抑制剂)和抑制食欲的药物(食欲抑制剂)。美国FDA已批准的抗肥胖药物有奥美司他(Orlistar，Xenical)一脂肪酶抑制剂，该药物能够抑制消化道中的酶把饮食中的脂肪分解为人体能吸收的小分子；苯叔丁胺(Phentermine)—食欲抑制剂，通过改变5-羟色胺在大脑中的水平，进而减少食欲；西布曲明(Sibutramine，Meridia)—口服食欲抑制剂，可抑制大脑中的5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺的再吸收，进而提高人的新陈代谢率。此外，其他一些药物如丁氨苯丙酮(Bupropion，Wellbutrin)、二氮嗪(Diazoxide，Procyglem)等也已用于抗肥胖。
糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合征。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素的敏感性降低，导致糖、脂、蛋白质、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要标志，久病可引起多系统损害。病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。糖尿病有I型和II型之分I型糖尿病又叫“青年发病型糖尿病”，这是因为它常常在35岁以前发病，占糖尿病的10％以下。I型糖尿病是依赖胰岛素治疗的，也就是说患者从发病开始就需使用胰岛素治疗，并且终身使用。原因在于I型糖尿病患者体内产生胰岛素的胰腺细胞已经遭到破坏，从而失去了产生胰岛素的能力。在体内胰岛素缺乏的情况下，导致血糖水平持续升高，出现糖尿病。II型糖尿病也叫“成人发病型糖尿病”，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。II型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至产生过多，但胰岛素的作用效果却大为削弱，这主要是由于患者体内胰岛素的靶器官(组织细胞)对胰岛素的敏感性降低所致，故此类患者体内的胰岛素是一种相对缺乏状态，可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌或设法提高靶器官对胰岛素的敏感性来达到治疗目的。
重组或纯化的胰岛素主要用来治疗I型糖尿病。但对于II型糖尿病患者，由于其体内存在胰岛素抗性，故胰岛素的治疗效果不佳，目前主要通过口服药物治疗，这些药物包括磺脲类如格列本脲(Glibenclamide)、双胍类如二甲双呱(Metformin)、糖苷酶抑制剂如拜糖平(Acarbose)、胰岛素增敏剂如罗格列酮(Rosiglitazone)等。
高脂血症(Hyperlipidemia)是指各种原因导致的血浆中胆固醇和/或甘油三脂水平升高的一类疾病。所有脂蛋白都含有脂质，因此只要脂蛋白过量(高脂蛋白血症)，就会引起血脂水平升高(高脂血症)。故高脂血症与高脂蛋白血症看似两个不同的概念，但由于血脂在血液中是以脂蛋白的形式进行运转的，因此高脂血症实际上也可认为是高脂蛋白血症。
对高脂血症的治疗目前主要有四种方法第一种是抑制患者体内胆固醇的合成，如它丁(statin)类药物；第二种是树脂类的药物，这类药物能结合胆酸进而阻断胆酸的重吸收，以加快胆固醇向胆汁的转化过程；第三种是尼克酸(NicotinicAcid)，它降低外周游离脂肪酸，从而降低肝脏甘油三酯的合成和VLDL的分泌；第四种药物如Fibrate，增加肝脏和肌肉的脂肪酸氧化。这些药物都是小分子化合物并具有不同程度的临床副作用。至今尚没有将重组的蛋白质应用于降低血脂，以及与高脂血症相关的糖尿病和肥胖症的报道。
白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一种T细胞分泌的糖蛋白，又名白介素10诱导的T细胞因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)。它由179个氨基酸残基组成，Dumoutier等最先报道了克隆小鼠和人的白介素-22基因(Dumoutier，et al，JI，1641814-1819，2000)。此外，Dumoutier还取得了IL-22的专利(US专利号6,359,117和6,274,710)。Gumey也取得了IL-22在治疗人胰腺病变方面的应用专利(US专利号6,551,799)。
白介素-22主要在胸腺、大脑、活化的T细胞和肥大细胞、lectin刺激后的脾细胞(Duroutier JI 2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK细胞(Wolk，K JI2002)，以及LPS刺激后的多个器官和组织中表达(Dumoutier PNAS paper)。

发明内容
本发明的目的旨在提供一种白介素-22的新的医药用途。
本发明的一个方面是提供了一种治疗高脂血症的方法，包括给予需要治疗高脂血症的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种降低哺乳动物血甘油三酯含量的方法，包括给予需要降低血甘油三酯的哺乳动物有效量的白介素-22；本发明还提供了白介素-22在降低哺乳动物血甘油三酯含量中的用途以及白介素-22在制备降低哺乳动物血甘油三酯含量的药物中的用途。
本发明的另一个方面是提供了一种治疗肥胖的方法，包括给予需要治疗肥胖的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种降低哺乳动物体重的方法，包括给予需要降低体重的哺乳动物有效量的白介素-22；本发明还提供了白介素-22在降低哺乳动物体重中的用途以及白介素-22在制备降低哺乳动物体重的药物中的用途。
本发明的另一个方面是提供了一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要治疗糖尿病的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种提高哺乳动物葡萄糖耐量的方法，包括给予需要提高葡萄糖耐量的哺乳动物有效量的白介素-22；本发明还提供了白介素-22在提高哺乳动物葡萄糖耐量中的用途以及白介素-22在制备提高哺乳动物葡萄糖耐量的药物中的用途。
本发明还提供了一种包含白介素-22的药物组合物，它包含治疗有效量的白介素-22。
本发明的白介素-22包括，但不限于人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。


图1重组白介素-22降低正常小鼠血总甘油三酯浓度。8-12周龄C57BL6小鼠，雌，体重20-25g，每组10只，对照组注射溶剂(0.1％BSA，BovineSerum Albumin，PBS，Phosphate Buffered Saline，pH7.0)。用药组注射重组小鼠白介素-22 100ug/kg/d，每天1次，体积0.1ml/10g体重，连续皮下注射7天)。
图2重组白介素-22降低获得性肥胖小鼠血总甘油三酯浓度。18-24月龄C57BL6小鼠，雌性，每组10只，体重30-40g，分为两组。对照组皮下注射(0.1ml/10g体重)溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组皮下注射重组小鼠白介素-22 300ug/kg/d，每天1次，连续注射9天，取血清测定甘油三酯浓度。虚线表示对照组、实线表示用药组。结果显示平均值+/-标准误。
图3重组白介素-22使小鼠脂肪细胞缩小。18-24月龄C57BL6小鼠，雌，每组10只，体重30-40g，分为两组。对照组皮下注射(0.1ml/10g体重)溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组皮下注射重组小鼠白介素-22300ug/kg/d，每天1次，连续注射21天。动物处死，取腹膜后侧脂肪组织称重，并进行组织学分析(H+E染色)。图中显示具有代表性的一只对照组小鼠和一只用药组小鼠在相同放大倍数下的脂肪组织大小。同时，用药组平均腹膜后侧脂肪组织的重量(110+/-10mg)显著低于对照组腹膜后侧脂肪组织的重量(175+/-15mg)(p＜0.01)。
图4重组白介素-22降低遗传性肥胖小鼠的体重。8-12周龄ob/ob小鼠，雌性，每组10只，体重35-50g，分为两组。对照组皮下注射(0.1ml/10g体重)溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组皮下注射重组小鼠白介素-22300ug/kg/d，每天1次，连续注射14天。虚线表示对照组，实线表示用药组。
图5重组白介素-22降低遗传性肥胖小鼠血总甘油三酯浓度。取8-12周龄ob/ob小鼠，雌性，每组10只，体重35-50g，分为两组。对照组皮下注射(0.1ml/10g体重)溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组皮下注射重组小鼠白介素-22 300ug/kg/d，每天1次，连续注射14天。虚线表示对照组，实线表示用药组。
图6重组白介素-22提高小鼠对葡萄糖的耐受性。8-12周龄C57BL6小鼠，雌性，体重20-25g，每组10只，对照组注射溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组注射重组小鼠白介素-22 300ug/kg/d，每天1次，体积0.1ml/10g体重，连续皮下注射14天。14天后进行耐糖实验，实验结果如图所示。虚线为对照组，实线为用药组。*表示p＜0.01。
图7重组白介素-22提高小鼠对胰岛素的敏感性。取8-12周龄C57BL6小鼠，雌，体重20-25g，每组10只，对照组注射溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。用药组注射重组小鼠白介素-22 300ug/kg/d，每天1次，体积0.1ml/10g体重，连续皮下注射14天。14天后进行胰岛素敏感性实验，实验结果如图所示。虚线为对照组，实线为用药组。*表示p＜0.01。
具体实施例方式
本发明的问世是基于这样一个发现白介素-22能有效降低哺乳动物血甘油三酯含量、降低哺乳动物体重、提高哺乳动物糖耐量。
如本发明所用，“白介素-22”是指一种蛋白质，该蛋白质(a)具有与Dumoutier等人在US Patent No.359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列和(b)具有与天然白介素-22相同的生物学活性。本发明的白介素-22包括，但不限于人白介素-22、重组人白介素、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
术语“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变(缺失、增加、取代)引起的不同，但这种改变基本上不降低其生物学活性，即可以通过结合IL-22靶细胞受体而发生生物学功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-22均包括在本发明内，无论它是糖基化的(即来源于天然的或来源于真核生物表达系统的)或是非糖基化的(即来源于原核生物表达系统或化学合成的)。
术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素-22。
术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。
术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的白介素-22的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随白介素-22的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
本发明所引用参考资料的技术内容就其整体一并引入本文作为参考。
本发明人研究发现，白介素-22能有效降低哺乳动物血甘油三酯含量、降低哺乳动物体重、提高哺乳动物糖耐量。
进而，本发明提供了一种治疗高脂血症的方法，包括给予需要治疗高脂血症的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种降低哺乳动物血甘油三酯含量的方法，包括给予需要降低血甘油三酯的哺乳动物有效量的白介素-22；术语“有效量”是指足以引起哺乳动物血甘油三酯含量降低的白介素-22的量；本发明还提供了白介素-22在降低哺乳动物血甘油三酯含量中的用途以及白介素-22在制备降低哺乳动物血甘油三酯含量的药物中的用途。
本发明还提供了一种治疗肥胖的方法，包括给予需要治疗肥胖的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种降低哺乳动物体重的方法，包括给予需要降低体重的哺乳动物有效量的白介素-22；术语“有效量”是指足以引起哺乳动物体重降低的白介素-22的量；本发明还提供了白介素-22在降低哺乳动物体重中的用途以及白介素-22在制备降低哺乳动物体重的药物中的用途。
本发明的第三个方面是提供了一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要治疗糖尿病的对象治疗有效量的白介素-22；本发明还提供了一种提高哺乳动物葡萄糖耐量的方法，包括给予需要提高葡萄糖耐量的哺乳动物有效量的白介素-22；术语“有效量”是指足以引起哺乳动物葡萄糖耐量提高的白介素-22的量；本发明还提供了白介素-22在提高哺乳动物葡萄糖耐量中的用途以及白介素-22在制备提高哺乳动物葡萄糖耐量的药物中的用途。
本发明还提供了一种含有白介素-22的药物组合物，它包含治疗有效量的白介素-22。
可用于表达或克隆本发明的白介素-22的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。适用的原核宿主细胞包括，但不限于G+或G-菌，如大肠杆菌E.coli.，能够通过公共途径得到的E.coli.菌株包括K12 MM294(ATCC31,446)、X1776(ATCC 31,537)、W3110(ATCC 27,325)和K5 772(ATCC53,635，JM109，DH5□，B株系列，B834，BL21，BLR等。其他可用的原核细胞包括但不限于欧式杆菌(Erwinia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、沙门杆菌(Salmonella)如鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)、沙雷菌属(Serratia)如粘质沙雷菌(Serratia marcescans)、志贺菌属(Shigella)、枯草杆菌.(B.subtilis)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如绿脓杆菌(P.aeruginosa)、链球菌(Streptomyces)。E.coli.W3110因其常被用作重组DNA产品的发酵宿主而被推荐为优选。
除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母菌(yeast)等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素-22。酿酒酵母菌(Saccharomyces)就是一种常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature，290140 ；EP139,383)；克鲁维酵母菌(Kluyveromyces hosts)(U.S.Pat.No.4,943,529；Flee et al.，Bio/Technology，9968-975(1991))如K.lactis(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J.Bacteriol.，154(2)737-742 )，K.fragilis(ATCC 12,424)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906；Van den Berg et al.，Bio/Technology，8135(1990))，K.thermotolerans，K.marxianus；yarrowia(EP402,226)；巴氏毕赤酵母菌(Pichia Pastoris)(EP 183.070；Sreekrishna et al.，J.BasicMicrobiol.，28265-278 )；念珠菌(Candida)；Trichoderma reesia(EP244,234)；脉胞菌(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263 )；施万异样霉菌(schwanniomyces)如Schwanniomycesoccidentalis(EP 394,538)；丝状真菌(filamentous fungi)如Neurospora，青霉菌(Penicillium)，Tolypocladium(WO 91/00357)，曲霉菌(Aspergillus)如A.nidulans(Balance et al.，Biochem.Biophys.Res.Commum.，112284-289 ；Tilburm et al.，Gene，26205-221 ；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474 )和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.，4475-479 )。甲基营养酵母菌(Methylotropic yeasts)同样可用于表达本发明的白介素-22，包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，毕赤酵母菌(Pichia)，酿酒酵母菌(Saccharomyces)，球拟酵母菌(Torulopsis)，红酵母菌(Rhodotorula)。属于甲基营养酵母菌类的典型菌种参见C.Anthony，TheBiochemistry of Methylotrophs，269(1982)。
用于表达糖基化的本发明的白介素-22的宿主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如Drosophila S2和Spodoptera Sf9，植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞。特别是，经SV40转化的猴肾CV1细胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞株293(Graham et al.，J.Gen Virol.，3659(1977))；CHO/-DHFR(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；小鼠睾丸滋养细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺细胞(WI38，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL5 1)。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。
上述宿主细胞经白介素-22表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基(nutrient media)中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子(promoter)、选择性转化体(selecting transformant)或者扩增白介素-22编码基因序列。培养条件如培养基、温度、pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见Mammalian Cell Biotechnologya Practical Approach，M.Butler，ed.(IRL Press，1991)and Sambrook et al.，supra.。
本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法，例如CaCl2法、磷酸钙沉淀法、脂质体媒介法或电穿孔法。根据使用的宿主细胞的不同，本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术，例如CaCl2法(Sambrooket al.，supra.)或电穿孔法通常用于原核细胞；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染主要用于某些植物细胞的转化(Shaw et al.，Gene，23315(1983)and WO 89/05859)；对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，则可以使用磷酸钙沉淀法(Graham and van der Eb，Virology，52456-457(1978))；有关哺乳动物宿主细胞转染的全面描述可参见U.S.Pat.N..4,399,216。有关如何转化酵母细胞可参见VanSolingen et al.，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979).。其他将DNA引入细胞的方法，如核酸微量注射、电穿孔、完整细菌细胞原生质体融合(bacterial protoplast fusion with intact cells)、或者聚阳离子法(polycations)如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鸟氨酸(polyornithine)等皆可用于本发明中。有关各种哺乳动物细胞转化技术的描述可参见Keown et al.，Methods in Enzymology，185527-537(1990)和Mansour etal.，Nature，336348-352(1988)。
编码本发明的白介素-22的核苷酸序列(即cDNA或基因组DNA)可被插入一可复制载体(replicable vector)进行基因克隆(DNA扩增)或者表达。各种载体如质粒、粘粒(cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。运用本领域的公知技术，可将本发明的白介素-22的编码核苷酸序列按常规步骤插入可复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。一个可复制载体通常包括但不限于以下部件一条或多条信号序列(signal sequence)，一个复制起点(originof replication)，一条或多条标记基因(marker gene)，一个增强子元件(enhancerelement)，一个启动子(promoter)，以及一段转录中止序列(transcriptiontermination sequence)。本领域的普通技术人员可运用本领域标准的连接技术(ligation techniques)构建含有一个或多个上述部件的合适的可复制载体。
本发明的白介素-22不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种多肽形成融和多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。通常情况下，这段信号序列是上述可复制载体的一部分，或者它也可以是插入可复制载体的本发明的白介素-22编码核苷酸序列的一部分。所述信号序列可以是原核信号序列，例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者热稳定肠毒素II前导序列。在酵母分泌系统(yeast secretion)中，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列(yeast invertase leader)，α因子前导序列(包括酿酒酵母菌和克鲁维酵母菌α因子前导序列，参见U.S.Pat.No.5,010,182)，或酸性磷酸酶前导序列，C.albicans葡萄糖淀粉酶前导序列(EP 362,179)。在哺乳动物表达系统中，哺乳动物信号序列可直接用于分泌目标蛋白质，此类序列包括来源于相同或相近物种哺乳动物分泌蛋白的信号序列以及病毒分泌前导序列。
表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列，该序列使载体能够在一个或多个相应的宿主细胞内复制。与各种细菌、酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒pBR322的复制起点适用于大多数G-细菌，2.mu.质粒复制起点适用于酵母细胞，而各种病毒复制起点(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因，又名“选择标记”。典型的选择基因编码产生的蛋白质(a)对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四环素等具有抗性；(b)能弥补营养缺陷型缺乏(auxotrophic deficiencies)(c)补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的D-丙氨酸消旋酶的编码基因。
适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的白介素-22编码基因的宿主细胞区分出来，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。适用的以野生型DHFR为选择基因的宿主细胞是无DHFR活性的CHO细胞株，该细胞株的制备及繁殖方法可参见Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980)。适用于酵母细胞的选择基因是在酵母质粒Yrp7中表达的trpl基因(Stinchcomb etal.，Nature，28239(1979)；Kingsman et al.，Gene，7141(1979)；Tschemperet al.，Gene，10157(1980))。trpl基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如ATCC No.44047或PEP4-1(Jones，Genetics，8512(1977))。
表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码核苷酸序列上的启动子，以指导mRNA的合成。与各种宿主细胞对应的启动子为本领域普通技术人员所公知。适用于原核宿主细胞的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature，275615(1978)；Goeddel et al.，Nature，281544(1979))，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，NucleicAcids Res.，84057(1980)；EP 36,776)，杂合启动子如tac启动子(deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发明的白介素-22编码基因序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主细胞的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzeman etal.，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其他糖酵解酶的启动子(Hess et al.，J.Adv.Enzvme Reg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡糖磷酸异构酶，和葡糖激酶。
还有一些可诱导的酵母启动子，它们能更好地根据生长情况来调节转录，包括醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，氮素代谢相关降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸，麦芽糖和半乳糖代谢酶等的启动子。有关适用于酵母表达系统的载体和启动子的进一步描述参见EP 73,657。
启动子可以控制哺乳动物宿主细胞内可复制载体上本发明的白介素-22编码基因序列的转录。所述启动子包括来自于多形瘤病毒，禽痘病毒(UK 2,211,504)，腺病毒，牛乳头(状)瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒(SV40)等病毒基因组的启动子，来自于异种哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及来自于热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子同宿主细胞表达体系相容。
通过在可复制载体中插入增强子可增强本发明的白介素-22的编码核苷酸序列在高等真核生物表达体系中的转录。增强子是一种DNA分子的顺式作用元件，通常为10到300个bp，通过作用于启动子而增强DNA分子的转录。目前已知很多增强子序列来自于哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰岛素)。而使用较多的是来自于真核病毒细胞的增强子，如位于复制起点下游(late side)的SV40增强子(100-270bp)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点下游的多形瘤病毒增强子，腺病毒增强子。增强子可被剪切插入位于可复制载体上的本发明的白介素-22的编码核苷酸序列的5’端或3’端，优选位于启动子的5’端。
真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞，或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞)中的表达载体同样含有中止转录和稳定mRNA所需的核苷酸序列。此类序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端，有时也可取自3’端。所述“非翻译区”包含的核苷酸片段可转录产生位于本发明的白介素-22mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。
其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的白介素-22的方法、载体和宿主细胞可参见Gething et al.，Nature，293620-625(1981)；Mantei et al.，Nature，28140-46(1979)；EP 117,060；以及EP 117,058。
本发明的白介素-22的编码核苷酸序列可被应用于基因治疗中。在基因治疗过程中，基因被导入细胞中以期在体内合成具有治疗效果的基因表达产物，比如替代原有的缺陷基因。“基因治疗”包括传统的基因疗法，即通过一次治疗而长期有效；也包括给予基因治疗药物，后者包括一次或者多次地给予有效的DNA或者mRNA。反义RNA和DNA亦可被用作基因治疗药物以阻断体内某些基因的表达。业已证实，尽管反义寡核苷酸短片段被细胞膜吸收有限，导致其胞内浓度降低，它仍然可以在细胞内发挥抑制剂的作用(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146 ))所述寡核苷酸片段经修饰例如用不带电荷的基团取代其带负电荷的磷酸二酯基团后，可提高其细胞膜吸收度。
本发明的白介素-22可被用作治疗药物。本领域的普通技术人员可按本领域的常规方法将其制备成各种药学上有效的制剂(formulation)，其中包含有效量的白介素-22和可药用载体。
当制成冻干制剂或溶液剂时，本发明的药物组合物中还需要加入其他一些生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂等以便于储存(Remington’s PharmaceuticalSciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980))。所述“生理上可接受”的载体、赋形剂、稳定剂等其药用剂量和浓度应对给药对象(人、鼠及其他哺乳动物)无毒，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸(Vit C)；低分子量(少于10个氨基酸残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，氨基酸如氨基乙酸、谷氨酸盐、天冬酰胺酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂如EDTA；糖醇(sugar alcohols)如甘露醇、山梨醇；成盐抗衡离子(counterions)如钠离子；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN.TM.，PLURONICS.TM.或PEG等。
含有本发明的白介素-22的制剂在体内给药前必须经过灭菌。该步骤可在冻干和再组成(reconstitution)之前或之后借助灭菌过滤膜(sterile filtrationmembranes)过滤完成。
本发明的药物组合物通常被置于一配备有“灭菌入口”(sterile access port)的容器中，例如，一个有瓶塞的静脉溶液瓶，所述塞子可被皮下注射针穿透。
本发明的药物组合物可按本领域的常规途径给药，包括但不限于静脉注射或输注、腹腔注射、脑内注射、肌内注射、眼内注射、动脉注射或输注、局部给药或者通过缓释系统(sustained release systems)给药。
本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。本发明人所做的动物实验已为白介素-22在人体的用量范围提供了一个可信的指导，例如，重组鼠白介素-22在剂量大于30ug/kg/d时可见显著的降血脂效果，并呈量效关系(实施例3)。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见Mordenti，J.and Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”InToxicokinetics and New Drug Development，Yacobi et al.；Pergamon Press，New York1989，pp.42-96.。
当本发明的白介素-22体内给药时，其通常剂量范围为每天1ng/kg～100mg/kg哺乳动物体重，优选范围10ug/kg/d～100ug/kg/d，根据给药途径的不同而有所不同。对于某些特定剂量和给药方法的指导参见U.S.Pat.Nos.4657760；5206344；或5225212。可以预见的是，不同的白介素-22制剂将对不同的病种有效；当药物作用靶点(器官或组织)发生变化时，给药方式也需要做相应的调整。
含有本发明的白介素-22的微胶囊可用于本发明的白介素-22的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnson et al.，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther 271221-1223(1993)；WO 97/03692，WO 96/40072，WO96/07399；U.S.Pat.No.5654010。
本发明的白介素-22的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis，“Controlled release of bioactive agents form lactide/glycolidepolymer，”inM.Chasin and R.Langer(Eds.)，Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(Marcel DekkerNew York，1990)，pp.1-41))。
本发明的白介素-22还可用各种活化的分子量为5,000～100,000的聚乙二醇(PEG)修饰以使之高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见Greenwald et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Caliceti et al.，IL Farmaco，1993，48，919；Zalipsky and Lee，《聚乙二醇化学生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，Plenum Press，N.Y.，1992。优选使用多臂树杈型活性PEG(CN ZL02101672.0，WO9932139，PCT/US95/0755，PCT/US94/13013，US Pat4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192，4,179,337)。
本发明的白介素-22还可以做成“嵌合分子”(Chimeric Molecule)或融合蛋白(Fusion Protein)，从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因(Fc)相连进行表达。“嵌合分子”中白介素-22的部分可以用整个或部分白介素-22cDNA序列。生产表达Fc融合蛋白可见US Pat5,428,130。本发明的白介素-22基因可以放在Fc的N-末端，也可以放在Fc的C-末端进行表达。
共价修饰的白介素-22蛋白质也包括在本发明内。化学共价修饰包括改变N-末端或C-末端或其他氨基酸加上一个化学分子。这种修饰也包括改变白介素-22的氨基酸序列。改变白介素-22本身的糖基化状态(Glycosalytion)，包括增加糖基化或减少糖基化，或者直接通过化学反应改变糖基化状态，比如WO 87/05330。
其他制剂技术如纳米制剂(US60/544,693)、喷雾剂(CN00114318.2，PCT/CN02/00342)、吸入剂等同样包括在本发明的保护范围之内。
以下结合具体实施例以对本发明做出进一步说明，但并不意味着本发明仅限于此。
实施例1人和小鼠白介素-22基因克隆人白介素-22基因的克隆取正常人的外周血单核细胞，用anti-CD3mAb刺激并培养过夜。提取tRNA的方法采用超速离心法。cDNA通过用dT为引物合成。人白介素-22基因用引物包括有意义链(5’-GCAGAATCTGAACAGGTTC-3’)和反意义链(5’-GGCATCTAATTGTTATTTCTAG-3’)，进行PCR扩增。扩增后的人白介素-22的DNA再克隆到大肠杆菌表达载体。
小鼠白介素-22基因的克隆C57BL/6雌性小鼠，注射LPS(5mg/kg，sc)，20小时后取脾，抽取RNA。CDNA通过用dT引物合成。小鼠白介素-22用引物包括有意义链(5’-CTCTCACTTATCAACTGTTGAC-3’)和反意义链引物(5’-GATGATGGACGTTAGCTTCTCAC-3’)，进行PCT扩增后再克隆到大肠杆菌表达载体pET21(+)。
人和小鼠白介素-22基因通过DNA测序确认无误。
实施例2人和鼠白介素-22蛋白的表达大肠杆菌BL21(E.Coli)用来表达重组蛋白。大肠杆菌在高压下用匀浆破坏。含白介素-22的包含体以离心方法获得。包含体在缓冲液体(含50mM Tris-HCl pH 8.0，NaCl 100mM，EDTA 1mM，DTT 1mM，Sodium Deoxycholate 0.5％)中充分洗涤。包含体进一步在8M尿素，50mM Mes，10mM EDTA和0.1mM DTT，PH6.5中溶解。溶解后的包含体在100mM Tris HCL，2mM EDTA，0.5m L-arginine，1mM还原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，PH8.0还原复位20小时4次。然后经过浓缩，并进一步在Superdex75(Amersham)柱层析纯化。重组后的蛋白质用Tris-HCl 20mM、NaCl 50mM PH 7.0洗脱。白介素-22的纯度用SD3-PAGE胶染色(纯度＞95％)。并定量分装在-80℃保存。
实施例3重组白介素-22降低正常小鼠血清总甘油三酯(TG)水平正常小鼠C56BL/6，雌性，8～12周，体重20～25克(n＝10)。每天皮下注射重组小鼠白介素-22蛋白，浓度范围0，3，30，100，300ug/kg/d。白介素-22溶解在0.1％BSA，Bovine Serum Albumin，PBS，Phosphate Buffered Saline，pH7.0，每天注射一次，连续注射7天。对照组注射相同体积的溶剂0.1％BSA，Bovine Serum Albumin，PBS，Phosphate Buffered Saline，pH7.0。
用药处理后的不同时间分别从眼眶取血100ul，让血凝固，取血清用生理盐水稀释，在自动生化分析仪上测定总甘油三酯的含量。
结果显示重组鼠白介素-22可显著降低小鼠血总甘油三酯的浓度。剂量大于30ug/kg/d时可见显著的降血脂效果，并呈量效关系。图1显示用药7天后100ug/kg/d组的甘油三酯变化。
实施例4重组白介素22降低获得性肥胖小鼠(正常小鼠)的血清总甘油三酯水平及体重取正常小鼠C56BL/6，雌性，18～24个月(n＝10)，体重30～40g。每天皮下注射重组白介素-22，浓度范围为0，30，100，300ug/kg/d，白介素-22溶解在0.1％BSA，PBS，pH7.0，每天注射一次，连续注射9天。对照组注射相同体积的溶剂0.1％BSA，PBS，pH7.0。
用药处理后的不同时间分别取血100ul，制备血清并用生理盐水稀释，在全自动生化分析仪上测定血甘油三酯的含量。每三天测定体重变化。
结果显示给药组小鼠血清总甘油三酯浓度显著降低(图2)，并伴有显著的体重减轻，呈剂量依赖关系。组织学切片显示给药组处理3周后可见脂肪细胞显著缩小(图3)，同时腹膜后脂肪组织重量明显降低。
实施例5重组白介素22降低遗传性肥胖小鼠(基因变异小鼠)血糖、血甘油三酯、血胰岛素浓度及体重取8～12周的肥胖小鼠ob/ob，体重范围35～50g，连续注射重组白介素-22，300ug/kg/d，14天，对照组小鼠注射相同体积的载体溶液(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。隔天记录体重，并在第15天时将实验动物处死，抽血测定血糖、血甘油三酯及血胰岛素浓度。结果显示经重组白介素-22注射的ob/ob小鼠体重明显低于对照组(图4)；同时其血甘油三酯(图5)、血糖以及血胰岛素浓度亦明显降低。
实施例6重组白介素-22提高小鼠对葡萄糖的耐受性，提高小鼠对葡萄糖的敏感性取8～12周的正常雌性C57BL/6小鼠，分为两组，每组10只。对照组每天注射对照溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。给药组每天注射300ug/kg/d重组小鼠白介素-22，连续14天，饥饿过夜。两组动物分别进行耐糖实验。D-葡萄糖用生理盐水稀释后2mg/g腹腔注射，在0、30、60、120分钟用Accu-chek glucometer(RocheDiagnostic Co.)测定血糖浓度，结果如图6所示。
取8～12周的正常雌性C57BL/6小鼠，分为两组，每组10只。对照组每天注射对照溶剂(0.1％BSA，PBS，pH7.0)。给药组每天注射300ug/kg/d重组小鼠白介素-22，连续14天，饥饿5小时，进行胰岛素耐受性实验。两组动物分别腹腔注射胰岛素0.5U/kg(Eli lily Co.)。在注射后0、30、60、90、120分钟分别测定其血葡萄糖浓度。结果如图7所示。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域技术人员可对其进行等同变换和修饰。它们的范围也包括在所附的权利要求中。
权利要求
1.一种治疗高脂血症的方法，包括给予需要治疗高脂血症的对象治疗有效量的白介素-22。
2.权利要求1的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
3.一种降低哺乳动物血甘油三酯含量的方法，包括给予需要降低血甘油三酯含量的哺乳动物有效量的白介素-22。
4.权利要求3的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
5.白介素-22在降低哺乳动物血甘油三酯含量中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
7.白介素-22在制备降低哺乳动物血甘油三酯含量的药物中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
9.一种治疗肥胖的方法，包括给予需要治疗肥胖的对象治疗有效量的白介素-22。
10.权利要求9的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
11.一种降低哺乳动物体重的方法，包括给予需要降低体重的哺乳动物有效量的白介素-22。
12.权利要求11的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
13.白介素-22在降低哺乳动物体重中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
15.白介素-22在制备降低哺乳动物体重的药物中的用途。
16.权利要求15的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
17.一种治疗糖尿病的方法，包括给予需要治疗糖尿病的对象治疗有效量的白介素-22。
18.权利要求17的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
19.一种提高哺乳动物葡萄糖耐量的方法，包括给予需要提高葡萄糖耐量的哺乳动物有效量的白介素-22。
20.权利要求19的方法，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
21.白介素-22在提高哺乳动物葡萄糖耐量中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
23.白介素-22在制备提高哺乳动物葡萄糖耐量的药物中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
25.一种药物组合物，包含治疗有效量的白介素-22。
26.权利要求25的药物组合物，其中所述白介素-22为人白介素-22、重组人白介素-22、鼠白介素-22和/或重组鼠白介素-22。
全文摘要
本发明涉及白介素－22(Interleukin－22)的医药用途，特别是涉及白介素－22在治疗高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖和/或糖尿病中的用途。本发明还涉及白介素－22在制备治疗高脂血症、高甘油三酯血症、肥胖和/或糖尿病的药物中的用途。本发明的白介素－22为人白介素－22、重组人白介素－22、鼠白介素－22和/或重组鼠白介素－22。
文档编号A61P3/10GK1679918SQ20051002310
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月4日 优先权日2005年1月4日
发明者陈旭文 申请人:健能隆医药技术(上海)有限公司