专利名称：一类萘醌类化合物及药物组合物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类萘醌类衍生物的新用途，具体涉及该类化合物的抗幽门螺旋杆菌作用，以及含有该化合物的药物组合物在治疗和预防幽门螺旋杆菌感染疾病上的应用。
背景技术：
慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃MALT淋巴瘤和胃癌是严重危害人类健康及生命的疾病，病理学研究证实以上均与幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，简称Hp)感染有关。据报道全世界约50％以上的人口感染幽门螺旋杆菌，以发展中国家最为严重，成年人幽门螺旋杆菌感染率达60-80％。目前临床上大多采用抗内分泌药及抗生素联合疗法来治疗Hp的感染，但由于副作用大，病人耐受性差，又易产生耐药性，疗效及应用受到了影响。因此，寻找抗Hp感染和治疗与其相关的疾病的新药成了人们关注的研究课题。
梧桐Firmiana plantanifolia(L.f.)Masili[F.simplex(L.)W.F.Weight]属梧桐科，其种子、花、叶、树皮和根均入药。
文献考证梧桐具有顺气和胃，健脾消食的作用。主治胃脘疼痛，伤食腹泻。《食物考》和《本草求原》记载其有“舒脾开胃醒脾”的作用，《四川中药志》记载其可“顺气和胃”，广州部队《常用中草药手册》说其可以“健胃消滞”。
本发明在对中药进行抗幽门螺旋杆菌抑制活性的筛选中，发现梧桐(F.plantanifolia)根的提取物具有良好的抗幽门螺旋杆菌作用，经过活性跟踪分离得到萘醌类活性化合物成分。目前该萘醌类化合物的抗幽门螺旋杆菌活性尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一类从天然植物梧桐中提取，经分离纯化获得的萘醌化合物及其药物组合物作为幽门螺旋杆菌抑制剂，在制备治疗和预防各种与幽门螺旋杆菌感染相关疾病药物中的应用。
本发明所述的萘醌类化合物是通过对天然植物梧桐根进行分离提取，具体步骤采用乙醇提取、浓缩，提取物直接上大孔树脂柱，先用水洗、弃去，再用乙醇—水(30％，50％，95％)梯度洗脱，得到三个流分。经筛选发现95％洗脱馏分活性最强，经进一步的活性跟踪分离，得到结构如下的活性萘醌化合物 其中R1为H、羟基或烷氧基或酯基；R2为H、羟基或烷氧基或酯基；该类通式化合物来源广泛，既可以从植物中提取分离，也可利用工业原料有机合成。例如取梧桐根干燥根茎，粉碎后用乙醇提取、浓缩、浸膏上大孔树脂，乙醇—水梯度洗脱，经200-300目硅胶柱层析，石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱；再经Shephadex LH-20柱色谱分离纯化得到化合物A1，A2和A3。
Weinberg，M.L.；Gottlieb，O.R.；Oliveira，G.G.Phytochemistry 1976，15，570.Inouye，H.；Okuda，T.；Hayashi，T.Chem.Pharm.Bull.1975，23，384-391.Manners，G.D.；Jurd，L.；Wong，R.；Palmer，K.Tetrahedron 1975，31，3019-3024.
本发明进一步提供一种抗幽门螺旋杆菌感染或治疗及预防肠、胃溃疡相关性疾病方面的药物组合物，所述药物组合物包含治疗安全有效量的通式化合物和药学上可接受的载体。药物组合物包含0.1wt％-99.9wt％(重量百分比)的通式化合物。药学上可接受的载体指适用人体使用、具有足够纯度和低毒性的一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶。相容性指组合物中的各组份和通式化合物及其它们之间相互掺和而不明显降低化合物的药效。药学上可接受的载体可以包括糖、淀粉、纤维素及衍生物、明胶、滑石、固体润滑剂、硫酸钙、植物油、多元醇、乳化剂、着色剂、抗氧化剂、防腐剂等。本发明组合物对载体的选择取决于化合物的给药方式，可以制成一般的药用片剂、颗粒剂、胶囊、口服制剂或注射剂。
抗幽门螺旋杆菌抑制活性体外药理实验抗幽门螺旋杆菌抑制活性测试采用琼脂稀释法，按照文献方法进行。(胡伏莲、周殿元，“幽门螺杆菌感染的基础与临床”，中国科学技术出版社，2002年)测试原理检测化合物抑菌效果采用琼脂稀释法首先将不同剂量的化合物分别加入高温灭菌并冷却至45℃的定量琼脂培养基中，混匀后倾注成无菌平板，即含有化合物梯度减少的培养基。接种一定量的幽门螺旋杆菌于该培养基上，经培养后观察其生长情况，抑制细菌生长的最低化合物浓度即为最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，一般采用的单位为μg/ml。
观察指标实验中采用培养三天的幽门螺旋杆菌(标准菌株ATCC 43504和悉尼株SS1)，以适量生理盐水配成浓度约为108CFU/ml的菌悬液，分别取2.5μl菌液按照所含化合物浓度由低到高的顺序，接种到哥伦比亚琼脂培养基上，待接种点干燥后放入微需氧环境(85％N2、10％CO2、5％O2)37℃培养72h，不出现菌落的琼脂平板中所含的最低化合物浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。
针对幽门螺旋杆菌靶标体外酶学实验检测到化合物NPLC518和NPLC519有抑制幽门螺杆菌SS1菌株CGS酶的作用，检测采用吸光光度法，按照Luong TN，Kirsch JF.Analytical Biochemistry1997，253，46-49Aitken SM，Kim DH，Kirsch JF.Biochemistry 2003，42，11297-11306提供的方法进行。
测试原理CGS酶能催化L-OSHS产生α-ketobutyrate，α-ketobutyrate在NADH存在下被HO-HxoDH催化，使得NADH脱氢生成NAD+。本实验利用BIO-RAD酶标仪测量NADH在340nm光吸收值得到反应的各项参数。
观察指标在不同的抑制剂浓度下，CGS酶的催化活性不同。实验中测得抑制剂浓度梯度对应的催化反应初速度，同时测得没有抑制剂存在下酶反应初速度，得到抑制剂浓度对应的抑制率(即Vi/V0)，从而利用抑制率对对应抑制剂浓度的-log值作图得到抑制剂的IC50。
小鼠体内药理学实验体内抗菌活性实验采用幽门螺旋杆菌悉尼株(SS1)感染的SPF级C57BL/6小鼠模型。参考文献如下1.Lee A，O’Rourke J，De Ungria MC，Robertson B，Daskalopoulos G，DixonMF.Gastroenterology 1997，112，1386-13972.史彤，萧树东。胃肠病学2002，8，265-268动物实验方法实验分为治疗实验和预防实验两部分。治疗实验中将幽门螺旋杆菌感染后的小鼠随机分为三组第一组喂予通式化合物；第二组喂予阳性药物；第三组不予治疗。治疗实验结束后24小时和4周后分别处死各组小鼠，提取其胃组织检测幽门螺旋杆菌感染情况。预防实验中首先将小鼠随机分为两组第一组以化合物喂食小鼠一段时间；第二组不喂予化合物。然后以幽门螺旋杆菌感染小鼠，2周后处死小鼠检测其感染情况。
检查指标将实验鼠胃沿大弯纵向切成同样大小的三份一份直接进行快速尿素酶实验；一份放于无菌生理盐水中，用于细菌培养(培养条件同上)；另一份置于10％中性缓冲液福尔马林中固定，石蜡包埋、切片，用于组织病理学(革兰氏染色和苏木素染色)检查。三项检测全部呈现阴性的判定为幽门螺旋杆菌感染阴性。
本发明所述的萘醌类化合物及其药物组合物，在体内、外实验中均显示了良好的抗幽门螺旋杆菌作用，并对由于幽门螺旋杆菌感染引起的胃粘膜损伤具有修复作用和抑制幽门螺旋杆菌活性。
图1为NPLC518和NPLC519抑制CGS酶的IC50
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
1H-NMR用Varian MercuryAMX300型仪测定；所使用的硅胶，包括200-300目和GF254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产；所使用的ShephadexLH-20为E.Merck公司生产。
实施例一取梧桐根干燥根茎2Kg，粉碎后用95％的乙醇加热回流提取(5L×3)，回收乙醇得到浸膏。浸膏直接上大孔树脂柱，乙醇—水梯度洗脱，分为30％，50％，95％三个流分。95％部分经200-300目硅胶柱层析，石油醚—乙酸乙酯梯度洗脱；再经Shephadex LH-20(CHCl3/CH3OH 1∶1洗脱)柱色谱分离纯化得到化合物A1，A2和A3。
化合物A1黄色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(1H，d，J＝7.2Hz)，8.20(1H，d，J＝7.2Hz)，7.60(2H，t，J＝7.2Hz)，2.10(2H，m)，1.64(2H，m)，1.30(6H，s)。以上光谱数据与已知化合物α-lapachone[1]相比较，两者完全一致。故化合物A1鉴定为α-拉帕醌(α-lapachone)。
化合物A2黄色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.58(1H，d，J＝7.2Hz)，8.20(1H，d，J＝7.2Hz)，7.60(2H，t，J＝7.2Hz)，2.10(2H，m)，1.64(2H，m)，1.30(6H，s)。以上光谱数据与已知化合物9-hydroxy-α-lapachone[2]相比较，两者完全一致。故化合物A2鉴定为9-羟基—拉帕醌(9-hydroxy-α-lapachone)。
化合物A3黄色粉末，1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.22(2H，m)，8.17(2H，m)，7.52(2H，m)，7.49(2H，m)，5.91(2H，d，J＝9.9Hz)，5.61(2H，d，J＝9.9Hz)，1.52(6H，s，2×OMe)，1.47(6H，s，2×OMe)；13C NMR(75MHz，CDCl3)，δ145.6，142.5，131.1，126.9，1236.7，126.3，126.2，123.6，122.4，121.7，76.4。以上光谱数据与已知化合物tectol[3]相比较，两者完全一致。故化合物A3鉴定为太可酚(tectol)。
实施例二片剂的制备取A1化合物18克、羟丙纤维素120克、微粉硅胶30克、淀粉20克、硬脂酸镁适量混和均匀，用10％预胶化淀粉作为粘合剂，湿发制粒，烘干，加入硬脂酸镁混和，压制成1000片9.7％片剂。
实施例三颗粒剂的制备取A2化合物400克、蔗糖250克、羟丙纤维素120克、微粉硅胶30克、枸橼酸、碳酸氢钠适量混和均匀，以适量70％乙醇作湿润剂，湿法制粒，过筛，烘干，分装制成2000袋颗粒剂。
实施例四体外抗幽门螺旋杆菌实验将不同剂量的化合物分别加入高温灭菌并冷却至45℃的定量琼脂培养基中，混匀后倾注成无菌平板，接种2.5μl浓度为108CFU/ml处于对数生长的幽门螺旋杆菌于该培养基上，培养3天后观察其生长情况，抑制细菌生长的最低化合物浓度即为最低抑菌浓度(MIC)。
表1.萘醌类化合物的体外抗幽门螺旋杆菌作用
实施例五抑制靶标CGS酶实验在底物L-OSHS浓度为1.625mM时，通过测量反应产物α-ketobutyrate变化所对应的NADH在340nm光吸收值随反应时间变化得到0.4μM CGS酶在催化反应中的初速度以及不同抑制剂浓度对应的酶催化初速度，从而得到抑制剂IC50。NPLC518的IC50为10.53μM，NPLC519的IC50为8.86μM。
实施例六体内药效实验治疗实验以108CFU幽门螺旋杆菌经口灌胃感染60只C57BL/6小鼠，隔日1次，共3次。最后1次灌胃后2周，将小鼠随机分为3组，每组20只。A组经口灌胃喂予化合物(2000mg/kg)，B组喂予三联药物(阿莫西林50mg/kg、枸橼酸铋6.15mg/kg和甲硝唑22.5mg/kg)，每天1次，共15天。C组作为对照组不给予任何治疗。实验结束后24h分别处死各组小鼠检测幽门螺旋杆菌感染情况，计算清除率；实验结束后4周检测感染情况计算根除率。
表2.萘醌类化合物的体内治疗实验结果
预防实验取20只小鼠随机分成2组A组经口灌胃予化合物(1000mg/kg)，每天1次，共20天；B组不予化合物作为对照组。然后以108CFU幽门螺旋杆菌经口灌胃感染两组小鼠，隔日1次，共3次。预防实验结束后2周处死小鼠，提取其胃组织检测幽门螺旋杆菌感染情况，计算清除率。
表3.萘醌类化合物的体内预防实验结果
权利要求
1.含有一类如下结构通式的萘醌类化合物及药学上可接受的载体 其中R1为H、羟基或烷氧基或酯基；R2为H、羟基或烷氧基或酯基；组成的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于含有萘醌类化合物的有效量为0.1wt％-99.9wt％。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于药学上可接受的载体选自糖、淀粉、纤维素及衍生物、明胶、滑石、固体润滑剂、硫酸钙、植物油、多元醇、乳化剂、着色剂、抗氧化及、防腐剂。
4.如权利要求1所述的药物组合物的用途，在制备治疗、预防抗幽门螺旋杆菌与幽门螺旋杆菌感染相关性疾病药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的药物组合物的用途，其特征在于与幽门螺旋杆菌感染相关性疾病指所述胃炎、胃糜烂、胃溃疡。
6.根据权利要求4所述的药物组合物的用途，其特征在于所述与幽门螺旋杆菌感染相关性疾病指肠、十二指肠溃疡。
7.根据权利要求4所述的药物组合物的用途，其特征在于所述与幽门螺旋杆菌感染相关性疾病是为淋巴组织淋巴瘤。
8.如权利要求4所述的药物组合物的用途，其特征在于所述与幽门螺旋杆菌感染相关性疾病指中度肠腺化增生或不典型增生。
全文摘要
本发明涉及从植物梧桐根中提取、分离获得结构如通式(1)(2)所示的一类萘醌类化合物，具体涉及该类化合物的抗幽门螺旋杆菌作用，以及含有该化合物的药物组合物在治疗和预防幽门螺旋杆菌感染疾病上的应用。
文档编号A61P1/04GK1989959SQ200510112279
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者胡立宏, 沈旭, 蒋华良, 武大雷, 白海云 申请人:中国科学院上海药物研究所