专利名称：一种单克隆抗体涂层生物支架的制备方法
技术领域：
本发明属于生物支架制备领域，具体地说，涉及一种单克隆抗体 涂层生物支架的制备方法。
背景技术：
1976年德国学者安德里亚'格隆茨戈首次提出了动脉内安装支架 的设想，到90年代冠状动脉支架已广泛地应用于临床治疗。血管支 架是心血管及外周血管阻塞病变进行介入治疗的主要手段，其特点是 能通过细小管道进入预定的部位，释放后能膨胀至设定的直径大小， 对管腔起到支撑作用，使管腔保持通畅。血管支架按照表面状态可分 为裸支架、药物洗脱支架、聚合物包被支架、金属涂层支架、放射性 支架和人造血管覆盖支架，最先使用的支架基本为裸支架。由于支架 相对血管或其它肌体管道来说是一种异源性物质，安放后刺激血管内 膜引起反应性增生，使血管发生再狭窄。再狭窄的发生率高达 30%-35%,尤其是病变较长的血管和直径较小的血管。为解决再狭窄 的问题，人们随后开发出放射性支架和药物洗脱支架，其中药物洗脱 支架已被公认为在冠心病的介入治疗中，是能够解决冠脉血管内再狭 窄问题的最有效的方法。
现有的药物洗脱支架多釆用聚合物作为载体来携带药物并控制 其释放，典型的作法是将活性药物和聚合物混合涂覆在裸支架部分 或全部表面上，聚合物一般最少要占涂层质量的70%以上才能起到载 体的作用，支架本体上涂覆一层包含活性药物的聚合物涂层，聚合物 涂层上又涂覆一层多聚物涂层。这种含有聚合物涂层的药物支架在临 床应用中可以将再狭窄发生率降低到10%以下，这种支架在植入人体 后，由于药物的不断减少而聚合物浓度相应的不断增高，可能导致血
栓的形成。
现有的药物洗脱支架的药物多釆用雷帕霉素或者紫杉醇作为支 架上所携带药物，但该种带有聚合物涂层的药物洗脱支架，但仍不能 从根本上很好的解决支架内血栓形成和再狭窄问题，存在手术后再狭 窄率高、血栓源性强等缺陷，远期效果不理想，目前研究表明这种药 物洗脱支架的还存在10%左右再狭窄率，为了减少再狭窄率，本发明 研究人员开发了一种单克隆抗体生物支架。该生物支架具有很好的促 进血管内皮化和抑制血栓形成，以及抑制血管平滑肌的生长和增值的 作用，单克隆抗体或单克隆抗体和其它药物治疗剂联合支架具有二种 药物的优点，在预防血管再狭窄，血栓形成，促进内皮化和抑制平滑 肌再生都具有优良的性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体涂层生物支架的制备方法。 本发明所提供的单克隆抗体涂层生物支架的制备方法，以支架本 体为阳极，通过静电喷涂或阳极极化的方式使得抗#^溶液带负电，在 电场力的作用下，向阳极移动，均匀地涂覆在生物支架的表面。所述
支架本体的表面还可制成有直径100-800nm的孔洞。
上述釆用静电喷涂的方式涂覆生物支架，其包括如下步骤
(1) 支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 28-100 KHz，清洗时间为5-15min;使用去离子水进行清洗三次；
(2) 抗体涂覆液的配制以纯水或者浓度为0.01-1.0mo1/1、 pH 值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.01-1.0mg/ml的抗体
(3) 静电喷涂以抗体溶液为阴极，接上电源负高压，以支架 本体为阳极，接地，两极形成高压静电场，由于在阴极产生电暈放电， 使喷出的抗体溶液介质带电，并进一步雾化，沿电力线定向地流向带 正电的被涂物支架本体表面，中和沉积成一层均匀、附着牢固的抗体 涂层。
静电喷涂的原理以抗体溶液作为阴极，接上电源负高压，而支 架接地，这样在两极就形成了高压静电场。由于在阴极产生电暈放电， 可使喷出的抗体溶液介质带电，并进一步雾化。按"照同性相斥，异 性相吸"的原理，已带电的溶液介质受电场力(F-qE)作用，沿电力线 定向地流向带正电的被涂物支架表面，就可中和沉积成一层均匀、附 着牢固的抗体涂层。
上述釆用阳极极化的方式涂覆生物支架，其包括如下步骤
(1) 支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 28匪100KHz,清洗时间为5-15min;使用去离子水进行清洗三次；
(2) 抗体涂覆液的配制以纯水或者浓度为0.01-1.0mo1/1、 pH 值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.01-1.0mg/ml的抗体
(3) 阳极极化以支架本体作为阳极，溶液中釆用单克隆抗体 溶液时，该抗体电离变为阴离子，通电后抗体向阳极支架本体处移动， 使单克隆抗体与支架本体表面牢固均匀地结合，附着牢固的抗体涂 层。
阳极极化的原理电化学中的极化现象是指极化作用一经开始， 在阳极，电子流走了，溶液中的阴离子向阳极移动；在阴极，电子流 入快，溶液中的阳离子向阴极移动。当把支架作为阳极，溶液中采用 单克隆抗体溶液时，该抗体电离变为阴离子，通电后抗体向阳极支架 处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使单克隆抗 体与支架表面牢固均匀的结合，与电镀的原理基本相同。
所述支架本体可先经过表面清洗和防腐处理后，进行静电喷涂或 阳极极化的涂覆处理；所述涂覆后的生物支架自然晾干，经预冷冻后， 放入真空冷冻干燥机干燥。
支架本体的表面清洗过程为
(1) 用砂带打磨支架本体表面，用于去除表面的氧化物，调整
表面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为28-100 KHz，清洗时间为5-15 min;
(3) 将支架本体放入15-60 g/L、 70-100。C的氢氧化钠溶液中浸 泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在 30-40°C，干燥30-60min后取出。
支架本体的防腐处理釆用化学氧化处理或阳极氧化处理的方法 进行。
化学氧化处理的过程为将支架本体浸入含重铬酸钾15-20 g/L、 硝酸15-25g/L、氯化钠0.75-L25g/L的混合溶液中，在70-8(TC下，氧 化0.5-2.0min,在支架本体表面生成氧化膜。
阳极氧化处理的过程为釆用交流电氧化，在两电极上分别安装 完全相同的支架本体，阳极氧化处理用槽液为高锰酸钾15-20 g/L、磷 酸三钠15-55g/L、氟化钾25-55 g/L、氢氧化钾65-165 g/L、氢氧化钼 15-65 g/L的混合液，在20-60'C下，电流密度为O.l-lO A/dm2,交流电 压为50-90V下，氧化10-50min，支架本体表面生成氧化膜。
除上方法外，还可釆用离子注入、激光表面处理、热扩散、金属 镀层、气相沉积、有机涂层等方式中的一种或多种对支架本体表面进 行防腐处理。
此外，在支架本体表面涂覆抗体前，可先涂覆治疗性药物，涂覆 的治疗性药物与抗体的比例为50:1-100:1。所述治疗性药物为肝素、 阿司匹林、水蛭素、秋水仙碱、抗血小板GPIIb/IIIa受体结抗剂、白 甲氨蝶呤、嘌呤类、嘧啶类、植物碱类和埃坡破霉素(Epothilone) 类、雷公藤系列化合物、抗生素、激素、抗体治癌药物、环孢霉素、 他克莫司及同系物(FK506)，脱精胍菌素(15-deoxyspergualin),霉 酚酸脂(MMF),雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物，FR900520， FR 900523, NK 86-1086,戊酰胺(depsidomycin)， 康乐霉素C (kanglemycin C )， 斯博格埃林 (spergualin )， 灵菌红素 25c(prodigiosin25-c)，曲尼斯特(tranilast)，多球壳菌素(myriocin ) ， FR 651814， SDZ214-104,环孢霉素C，布雷青霉素(bredinin)，麦考酴 酸、布雷菲得菌素A， WS9482,糖皮质类固醇、替罗非班(tirofiban)、 埃替非巴肽(eptifibatide)、紫杉醇、放线菌素-D等中的一种或多种。 上述治疗性药物溶液的涂覆处理，其过程为以甲醇作溶剂，加 入浓度为l-15ng/ml的上述治疗性药物的溶液对支架本体表面进行 定向超声喷涂，匀速旋转支，根据支架本体表面药物含量要求喷涂 1-15次；
上述治疗性药物的涂覆处理，其过程也可为以四氢吹喃作有机 溶剂，加入浓度为l-15jug/ml的药物，将支架本体浸泡在上述溶液中 5-10分钟，重复浸涂4次。
本发明的单克隆抗体涂层生物支架的制备方法中，所述支架本体 釆用316医用不锈钢材质或钴络合金材质；所述单克隆抗体为单克隆 抗体CD34、单克隆抗体CD133、单克隆抗体CD105、单克隆抗体 CD117、单克隆抗体CD123、单克隆抗体CD9+、达利珠单抗 (daclizumab )、或阿昔单抗等中的一种或多种。
本发明所提的单克隆抗体涂层生物支架的制备方法，其具有如下 有益效果
1. 在支架本体原材料的表面，即直接与人体病变组织接触的表 面上制备有孔洞或者没有孔洞分布。无需额外制备载药涂层，无明显 界面，能够在支架本体全部或者部分表面通过静电作用均勾包被一层
抗体；
2. 支架本体全部或者部分表面包被抗体后，支架本体上抗体包 被量稳定性较好，经过直接或者超声清洗生物支架，生物支架上抗体
量均没有损失，这预示着该抗体支架能够耐受更长时间的血液冲刷， 抗体主要是通过静电吸附作用或者特殊的孔洞结构结合到支架本体
表面；
3. 使用安全，满足临床需要。抗体包被所使用的药品器材都是比 较安全的医用级药品和器材，本身产品就比较安全，所使用的抗体为 治疗性抗体，能够直接作用于人体；
4. 工业实用性强。该种抗体包被方式能够进行大规模的工业化 生产，且操作简单，成本较低。
图1为本发明支架本体的扫描电镜图。
图2为本发明表面带有纳米孔的支架本体表面的扫描电镜图。 图3为本发明表面带有纳米孔的支架本体上的抗体分布扫描电 镜图。
图4为静电喷涂设备示意图中1、储液器；2、泵；3、喷嘴；4、高压发生器；5、导电 杆；6、喷液室；7、雾滴；8、电极板。 图5为阳极极化涂覆过程示意图中A、操控电脑B、阳极极化仪C、储液容器D、电极。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步 骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
图1所示的支架本体是医用316不锈钢，也可以为钴络合金材质， 通过激光雕刻或机械加工而成的，除可制成血管支架外，还可制成骨 缝合线、骨钉、骨连接件，脊推骨盘，缝合用锚，止血钳、止血螺丝、 止血板、止血夹，以及组织粘合剂、密封剂，人造骨等医疗设备。
图2所示的表面带有纳米孔的支架本体是医用316不锈钢合金，
也可以为钴络合金材质，经抛光后，用激光雕刻成血管支架；支架表 面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮化等 方法或这些方法的结合。并且在器械本体原材料的局部表面直接制备 形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为100-800nm。 实施例l
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步骤制得单克隆抗体CD34涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为lOOKHz,清洗时间为10min;
(3) 将支架本体放入30g/L、 8(TC的氢氧化钠溶液中浸泡10min， 去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 °C,干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理将支架本体浸入到重铬酸钾15 g/L、硝酸15g/L、氯化钠1.0g/L溶液中，在8(TC下氧化1 min,支 架本体表面即可生成氧化膜。
3、 支架本体表面单克隆抗体CD34溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 100KHz,清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳 酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD34溶液；
(3) 、静电喷涂如图4所示，将电极板8接上高压静电负极， 电压为0-10KV,连续可调。将配制好的抗体涂覆液注入静电喷涂装 置的抗体溶液储存容器l中，抗体溶液容器1与泵2相连，泵将溶液增 压，增压后的溶液经溶液输送管送至喷嘴3处，溶液从喷嘴急速喷出，
瞬间降压，剧烈膨胀雾化成极细小的雾滴7，并由静电发生器4放电而 带上电荷，在电极板8与血管支架之间形成静电场，支架穿到接地的
可以转动的金属导杆5上，支架与喷嘴的距离是5cm，带电涂料在电 场引力和高压推力的共同作用下，吸附于血管支架内外表面上，并形 成一层均匀的抗体涂层，喷涂的时间为6秒，抗体涂层的量为1/4000 的支架重量；
(4)、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4h。 实施例2
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步骤制得单克隆抗体CD133涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为28KHz,清洗时间为15min;
(3) 将支架本体放入60g/L、 70。C的氢氧化钠溶液中浸泡5min, 去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在30 。C,干燥60min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理釆用交流电氧化，在两电极上安 装完全相同的图l所示的支架本体或者图2所示的支架本体，阳极氧 化处理用槽液成份为高锰酸钾15g/L、磷酸三钠15g/L、氟化钾25 g/L、氢氧化钾65g/L、氢氧化铝15g/L;在25'C，氧化10min,电流 密度为0.1A/dm2,交流电压为50V，支架本体表面即可生成氧化膜。
3、 支架本体表面单克隆抗体CD133溶液的涂覆处理
(1)、支架本体的预处理用四氢^^喃超声清洗，超声波频率为
28KHz,清洗时间为15min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳 酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD133溶液；
(3) 、静电喷涂如图4所示，将电极板8接上高压静电负极，电 压为0-10KV,连续可调。将配制好的抗体涂覆液注入静电喷涂装置 的抗体溶液储存容器l中，抗体溶液容器1与泵2相连，泵将溶液增压， 增压后的溶液经溶液输送管送至喷嘴3处，溶液从喷嘴急速喷出，瞬 间降压，剧烈膨胀雾化成极细小的雾滴7，并由静电发生器4放电而带 上电荷，在电极板8与血管支架之间形成静电场，支架穿到接地的可 以转动的金属导杆5上，支架与喷嘴的距离是5cm，带电涂料在电场 引力和高压推力的共同作用下，吸附于血管支架内外表面上，并形成 一层均匀厚度的抗体涂层，喷涂的时间为6秒，抗体的量为l/4000的 支架重量；
(4) 、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4h。
实施例3
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧
氧化、微弧氣化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表 面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为
100-800 nm。按照如下步骤制得单克隆抗体CD105涂层生物支架 1、支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为50KHz，清洗时间为13min;
(3) 将支架本体放入15g/L、10(TC的氢氧化钠溶液中浸泡8min，
去除油脂和氧化皮；
(4)将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在35 °C，干燥50min后取出。
2、支架本体表面的防腐处理将支架本体浸入到重铬酸钾20 g/L、硝酸25g/L、氯化钠1.25g/L溶液中，在70°C下氧化0.5min，
支架本体表面即可生成氧化膜。
3、支架本体表面单克隆抗体CD105溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 50KHz,清洗时间为13min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳 酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD105溶液；
(3) 、静电喷涂如图4所示，将电极板8接上高压静电负极，电 压为0-10KV,连续可调。将配制好的抗体涂覆液注入静电喷涂装置 的抗体溶液储存容器l中，抗体溶液容器1与泵2相连，泵将溶液增压， 增压后的溶液经溶液输送管送至喷嘴3处，溶液从喷嘴急速喷出，瞬 间降压，剧烈膨胀雾化成极细小的雾滴7，并由静电发生器4放电而带 上电荷，在电极板8与血管支架之间形成静电场，支架穿到接地的可 以转动的金属导杆5上，支架与喷嘴的距离是5cm，带电涂料在电场 引力和高压推力的共同作用下，吸附于血管支架内外表面上，并形成 一层均匀的厚度的抗体涂层，喷涂的时间为6秒，抗体的量为1/4000 的支架重量；
(4) 、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4h。
实施例4
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为
100-800 nm。按照如下步骤制得单克隆抗体CD117涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为5min;
(3) 将支架本体放入30g/L、 8(TC氢氧化钠溶液中浸泡10min,
去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 °C，干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理釆用交流电氧化，在两电极上安 装完全相同的图l所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用 槽液成份为高锰酸钾20g/L、磷酸三钠35g/L、氟化钾55 g/L、氢氧 化钾100g/L、氢氧化销30 g/L;在40'C，氧化25min，电流密度为 5A/dm2，交流电压为70V,支架本体表面即可生成氧化膜。
3、 支架本体表面单克隆抗体CD117溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 100KHz,清洗时间为5min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳 酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD117溶液；
(3) 、静电喷涂如图4所示，将电极板8接上高压静电负极，电 压为0-10KV，连续可调。将配制好的抗体涂覆液注入静电喷涂装置 的抗体溶液储存容器l中，抗体溶液容器1与泵2相连，.泵将溶液增压， 增压后的溶液经溶液输送管送至喷嘴3处，溶液从喷嘴急速喷出，瞬 间降压，剧烈膨胀雾化成极细小的雾滴7，并由静电发生器4放电而带 上电荷，在电极板8与血管支架之间形成静电场，支架穿到接地的可
以转动的金属导杆5上，支架与喷嘴的距离是5cm，带电涂料在电场 引力和高压推力的共同作用下，吸附于血管支架内外表面上，并形成 一层均勾的厚度的抗体涂层，喷涂的时间为6秒，抗体的量为1/4000 的支架重量；
(4)、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4 h。 实施例5
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步骤制得单克隆抗体CD123涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为lOOKHz，清洗时间为10min;
(3) 将支架本体放入30 g/L、 80 'C的氢氧化钠溶液中浸泡10 min，去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 。C，干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理釆用交流电氧化，在两电极上安 装完全相同的图l所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用 槽液成份为高锰酸钾18g/L、磷酸三钠55g/L、氟化钾40g/L、氢氧 化钾165g/L、氢氧化铝65 g/L;在60°C,氧化50min，电流密度为 10A/dm2，交流电压为90V,支架本体表面即可生成氧化膜。
3、 支架本体表面单克隆抗体CD123溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 lOOKHz，清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳
酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD123溶液；
(3) 、阳极极化涂覆如图5所示，将支架本体串联到阳极极化 仪的阳极4上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器3 中，调节阳极电压为400mv，进行极化，极化时间为600s,通电后抗 体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面 张力，使单克隆抗体与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成 一层均勻的抗体涂层，抗体的量为l/4000的支架重量；
(4) 、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4h。
实施例6
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表 面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为
100-800 nm。按照如下步骤制得单克隆抗体CD9+涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为lOOKHz，清洗时间为10min;
(3) 将支架本体放入30g/L、 80 。C氢氧化钠溶液中浸泡10min,
去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 。C,干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理采用交流电氧化，在两电极上安 装完全相同的图l所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用 槽液成份为高锰酸钾15g/L、磷酸三钠15g/L、氟化钾25g/L、氢氧
化钾65g/L、氢氧化铝15 g/L;在25°C,氧化10min，电流密度为 0.1A/dm2，交流电压为50V，支架本体表面即可生成氧化膜。 3、支架本体表面单克隆抗体CD9+溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 lOOKHz，清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳 酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1mg/ml单克隆抗体CD9+溶液；
(3) 、阳极极化涂覆如图5所示，将支架本体串联到阳极极化 仪的阳极4上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器3 中，调节阳极电压为400mv，进行极化，极化时间为600s,通电后抗 体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面 张力，使单克隆抗体CD9+与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表 面形成一层均勾的抗体涂层，抗体的量为l/4000的支架重量；
(4) 、生物支苹干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4h。
实施例7
选用316不锈钢合金或者钴络合金材质经抛光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表 面直接制备形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为
100-800 nm。按照如下步骤制得达利珠单抗涂层生物支架 1、支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75°/。的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为lOOKHz,清洗时间为10min;
(3) 将支架本体放入30g/L、 80 。C氢氧化钠溶液中浸泡10min，
去除油脂和氧化皮；
(4)将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 。C,干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理釆用交流电氧化，在两电极上安 装完全相同的图l所示的支架或者图2所示的支架，阳极氧化处理用 槽液成份为高锰酸钾15g/L、磷酸三钠15g/L、氟化钾25g/L、氢氧 化钾65g/L、氢氧化铝15 g/L;在25°C,氧化10min,电流密度为 0.1A/dm2，交流电压为50V，支架本体表面即可生成氧化膜。
3、 治疗性药物溶液的涂覆处理以四氢呋喃作溶剂，加入浓度 为15ng/ml的雷帕霉素对支架表面进行定向超声喷涂，匀速旋转支， 喷涂4次，使支架表面药物含量达到1/80支架重量。
4、 支架本体表面达利珠单抗溶液的涂覆处理
(1) 、支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 lOOKHz，清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) 、抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH为9.6的碳酸 盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.1 mg/ml达利珠单抗溶液；
(3) 阳极极化涂覆如图5所示，将支架本体串联到阳极极化仪 的阳极4上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的抗体储存容器3中， 调节阳极电压为400mv，极化时间为600s，通电后抗体离子向阳极支 架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使单克隆 抗体与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的抗体 涂层，抗体的量为l/4000的支架重量；
(4) 、生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放 入真空冷冻干燥机中干燥4 h。
权利要求
1、一种单克隆抗体涂层生物支架的制备方法，其特征在于，通过静电喷涂或阳极极化的方式，以支架本体为阳极，在电场力的作用下，带负电的抗体离子向阳极移动，均匀地涂覆在生物支架的表面。
2、 如权利要求l所述的制备方法，其特征在于，所述支架本体表 面制成有直径100-800nm的孔洞。
3、 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，釆用静电喷涂的方式涂覆生物支架，其包括如下步骤(1) 支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为28-100KHz,清洗时间为5-15min;使用去离子水进行清洗三次；(2) 抗体涂覆液的配制以纯水或者浓度为0.01-1.0mo1/1、 pH 值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.01-1.0mg/ml的抗体(3) 静电喷涂以抗体溶液为阴极，接上电源负高压，以支架 本体为阳极，接地，两极形成高压静电场，由于在阴极产生电暈放电， 使喷出的抗体溶液介质带电，并进一步雾化，沿电力线定向地流向带 正电的被涂物支架本体表面，中和沉积成一层均句、附着牢固的抗体 涂层。
4、 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，釆用阳极极 化的方式涂覆生物支架，其包括如下步骤(1) 支架本体的预处理用四氢吹喃超声清洗，超声波频率为 28-100 KHz,清洗时间为5-15min;使用去离子水进行清洗三次；(2) 抗体涂覆液的配制以纯水或者浓度为0.01-1.0mo1/1、 pH 值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，加入浓度为0.01-1.0mg/ml的抗体 溶液；(3) 阳极极化以支架本体作为阳极，溶液中釆用单克隆抗体 溶液时，该抗体电离变为阴离子，通电后抗体向阳极支架本体处移动，使单克隆抗体与支架本体表面牢固均匀地结合，附着牢固的抗体涂 层。
5、 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述支架本体经过表面清洗和防腐处理后，进行静电喷涂或阳极极化的涂覆处理；所述涂覆后的生物支架自然晾干，经预冷冻后，放入真空冷冻干燥机干燥。
6、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述支架本体的 表面清洗过程为(1) 用砂带打磨支架本体表面，用于去除表面的氧化物，调整 表面粗糙度；(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为28-100 KHz,清洗时间为5-15 min;(3) 将支架本体放入15-60 g/L、 70-100。C的氢氧化钠溶液中浸 泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在 30-40°C，干燥30-60min后取出。
7、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述支架本体的 防腐处理釆用化学氧化处理或阳极氧化处理的方法进行。
8、 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化学氧化处 理的过程为将支架本体浸入含重铬酸钾15-20 g/L、硝酸15-25g/L、 氯化钠0.75-1.25 g/L的混合溶液中，在70-80。C下，氧化0.5-2.0min; 所述阳极氧化处理的过程为釆用交流电氧化，在两电极上分别安装 完全相同的支架本体，阳极氧化处理用槽液为高锰酸钾15-20g/L、磷 酸三钠15-55g/L、氟化钾25-55 g/L、氢氧化钾65-165 g/L、氢氧化铝 15-65 g/L的混合液，在20-6(TC下，电流密度为O.l-lO A/dm2,交流电 压为50-90 V下，氧化10-50 min。
9、 如权利要求l或2所述的制备方法，其特征在于，在支架本体表面涂覆抗体前，先涂覆治疗性药物，并且所涂覆的治疗性药物与抗体的比例为50:1-100:1。
10、如权利要求l或2所述的制备方法，其特征在于，所述支架 本体釆用316医用不锈钢材质或钴络合金材质；所述单克隆抗体为单 克隆抗体CD34、单克隆抗体CD133、单克隆抗体CD105、单克隆抗 体CD117、单克隆抗体CD123、单克隆抗体CD9+、达利珠单抗、或 阿昔单抗中的一种或多种。
全文摘要
本发明涉及一种单克隆抗体涂层生物支架的制备方法，通过静电喷涂或阳极极化的方式，以支架本体为阳极，在电场力的作用下，带负电的抗体离子向阳极移动，均匀地涂覆在生物支架的表面。本发明所提供的制备方法，无需额外制备载药涂层，无明显界面，能够在支架本体全部或者部分表面通过静电作用均匀包被一层抗体，包被抗体量稳定性好，不易洗脱，并且使用安全，适于工业上大规模的生产，操作简单，成本低。
文档编号A61L31/08GK101337093SQ200810118078
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月7日 优先权日2008年8月7日
发明者余占江, 张正才, 蒲忠杰, 陈永强 申请人:乐普(北京)医疗器械股份有限公司