吡啶并咔唑类化合物及其应用的制作方法

专利名称：吡啶并咔唑类化合物及其应用的制作方法
吡啶并咔唑类化合物及其应用本发明涉及吡啶并咔唑类化合物作为药物的用途，更具体地涉及其在抗癌症化疗和其它类型疾病(精神病、病毒性疾病、寄生性疾病或真菌疾病)治疗中的应用；所述化合物对应于式(I)，其结构原型可与玫瑰树碱的相类比；本发明还涉及式(I)的具体化合物， 并还涉及包含式(I)化合物的药物组合物。考虑到有丝分裂纺锤体在细胞分裂中起关键作用，已长期将其认定为抗癌化疗中的重要靶标。微管功能的损伤可对细胞存活力产生巨大影响，导致细胞周期阻滞并且甚至可能诱导细胞凋亡。微管连同肌动蛋白微丝和中间丝形成真核细胞的细胞骨架。这些是由单一的二聚蛋白即微管蛋白构成的中空的管状聚集物。在哺乳动物细胞中，微管网络通常在组织中心 (中心体)成核。所述网络担当多个重要角色，例如胞质的组织、细胞器定位、细胞运动和细胞分裂。在有丝分裂期间，在细胞分裂成两个子细胞前，微管网络被重组织以形成有丝分裂纺锤体，所述有丝分裂纺锤体是细胞用以将二倍化的染色体分成两个相同组的工具。有丝分裂纺锤体的完整性由特定检验点控制。任何未检出的有丝分裂纺锤体功能异常都可能源自基因组的不稳定，并因此代表了肿瘤发生的潜在起源(Castillo et al. ,2007 ；Kops et al.，2005)。微管通过微管蛋白的α，β-二聚体的多聚化而组装。微管是高度动态的多聚物， 其能够由游离的微管蛋白二聚体快速多聚化并能够同样快速解聚。微管动力学是有丝分裂的关键(Jordan and Wilson, 2004 ；Niethammer et al.，2007)。微管动态行为网络在细胞内受到严格控制，其通过微管稳定化和微管去稳定化蛋白活性之间的平衡而调节，所述蛋白根据细胞类型包括以下的家族所谓的微管结合蛋白(MAP)STOP蛋白、tau蛋白、存活蛋白、stathmin/0pl8、Tog和微管解聚驱动蛋白、MCAK 和Kif2A。此外，微管生长尖端和诸如CLIP 170的一些蛋白的相互作用导致微管稳定化。 所有这些看似不相关的蛋白都具有共性，即它们沿微管网架或在微管末端结合微管蛋白二聚体。所述蛋白与微管蛋白的结合通过磷酸化/去磷酸化过程或通过诸如微管蛋白酪氨酸化循环(

图1)的微管蛋白翻译后修饰而受到严格调控，例如(Barra et al. , 1998 ； Lafanechere and Job, 2000 ；MacRae,1997 ；Peris et al.，2006 ；Peris et al.，2009)。所述后一修饰涉及未表征的微管蛋白羧肽酶(TCP)对α-微管蛋白链羧基末端酪氨酸残基的周期性移除和微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)在相同位置重新添加酪氨酸残基。近来已表明，微管蛋白酪氨酸化调节与诸如CLIP-170的CAP-Gly微管蛋白正端跟踪蛋白的微管相互作用(Peris et al.，2006)。催化微管蛋白酪氨酸化反应的酶TTL将酪氨酸添加至可溶的去酪氨酸化微管蛋白，并且一旦组装成微管便不与微管蛋白有效反应。对TCP的了解更少，这主要是因为它尚未被纯化至均一。间接证据表明，TCP可能偏爱多聚底物，并且其功能可能需要与微管的结合。TCP缓慢作用于微管，而在从微管释放后，TTL使得GlU-微管蛋白快速再装载(图1) (MacRae，1997)。作为TTL底物特异性以及TTL和TCP动力学差异的结果，酪氨酸化微管蛋白(Tyr-微管蛋白)由于是体外循环细胞中的主要微管蛋白变体而是动态微管的主要组分，然而Glu-微管蛋白是长时间的稳定微管蛋白的标志物(Gimdersen et al. , 1984 ； Gundersen et al.，1987 ；Wheland and Weber，1987)。依细胞类型，所述去酪氨酸化微管是不可检测的或代表所述细胞的小亚群。当效应物蛋白或诸如紫杉醇的药物将微管稳定时， 去酪氨酸化微管集聚(Fonrose et al. ,2007 ；Vassal et al. ,2006) 包括长春花生物碱、长春碱、长春新碱和长春瑞滨以及紫杉烷类(紫杉醇和多西紫杉醇)在内的数种临床上重要的抗癌药物特异性靶向微管蛋白并调整微管动力学。考虑到所述药剂在临床上的成功，微管蛋白代表了迄今所鉴定的最高效的癌症靶标之一。此外，除癌症之外，已描述微管细胞骨架参与大量疾病的病因学，所述疾病诸如精神病症(Andrieux et al.，2006 ；Andrieux et al.，2002 ；Begou et al.，2008)和神经退行性疾病(Dermaut et al. ,2005 ；Garcia et Cleveland, 2001)以及病毒性(Ruthel et al., 2005)、细菌性(Margalit et al.，2004)和寄生性(Morrissette and Sibley, 2002)感染。 因此，靶向微管细胞骨架及其多种效应物的药理学试剂可以对大量疾病的治疗展现出治疗优势(Lafanech6re，2008)。因此，抗癌化疗中使用的治疗以偏好方式靶向微管的动态行为，特别地，其可以被能够与微管蛋白的不同位点结合的许多药剂所阻断。现已获得关于所述不同药剂结合微管蛋白的结构数据。紫杉醇稳定化的微管蛋白原丝的锌诱导片层已被用于构建结合有紫杉醇的微管蛋白模型。在使该模型拟合电子密度微管图后，作者得出结论，认为紫杉醇结合面向微管腔的β-微管蛋白(Snyder et al.，2001)。在与蛋白stathmin的复合体中，与微管蛋白结合的长春碱的X射线结构已表明，长春碱在两个微管蛋白分子界面处引入楔形并因此干预微管蛋白组装(Gigant et al.，2005)。迄今为止，所述研究已形成对微管毒物在微管蛋白上的三个结合位点的表征位于两个α/β-微管蛋白二聚体间界面处的长春花生物碱结构域、位于β亚基上的紫杉类物质(taxoids)位点和位于α亚基和β亚基间界面处的秋水仙碱位点。所述多种药剂根据它们使微管去稳定化或稳定化而分类为-使微管去稳定化的药剂能够使微管解聚的长春花生物碱已被鉴定为能够使细胞阻滞在有丝分裂中并带来异常有丝分裂纺锤体的药剂。随后，在20世纪60年代引入长春新碱和长春碱作为临床药物，并仍广泛用在睾丸癌、霍奇金病或急性淋巴细胞性白血病的化疗中。还可能提及抑制微管多聚化的秋水仙碱或考布他汀(combretastatin)以及诺考达唑。-使微管稳定化的药剂紫杉烷类物质(taxanes)，且更具体的为紫杉醇以每摩尔微管蛋白约1摩尔紫杉烷类物质的化学计量特异且可逆地与微管相互作用。这种相互作用伴有对微管的稳定化， 所述微管随后可抵抗低温或存在的Ca2+离子在体外诱导的解聚。紫杉醇和其它紫杉烷类物质与其它抗微管蛋白毒物的主要区别在于其对微管的稳定化作用。之前认为诸如紫杉醇或长春花生物碱的癌症药物通过相反的机制发挥作用， 现在已经知晓其通过调整微管动力学而不是通过增加或减少总体微管量来发挥作用。紫杉烷类物质尽管具有抗肿瘤功效(尤其是在乳癌、卵巢癌和肺癌中)，但却由于其还作用于增殖中的非癌性细胞(造血细胞、粘液细胞等)的微管而极具毒性。最后，紫杉烷类物质可对于周围神经元产生不利作用并带来显著的副作用。显示微管稳定化性质的其它天然产物(例如埃博霉素类和圆皮海绵内酯 (discodermolide))因其抗肿瘤性质而现正处于人临床试验的研究中。紫杉醇在治疗上的成功己保持了搜寻靶向微管蛋白的治疗性药剂的优势。考虑到所述药剂在临床上的成功，微管蛋白现在是抗癌化疗中最为有效的靶标之一(Giarmakakou et al. , 2000 ； Jackson et al. , 2007 ；Zhou and Giannakakou,2005)。然而，尽管最有价值，但是现有技术的已知物质并不理想。这些物质具有数种副作用，主要是骨髓抑制和外周神经毒性。与微管蛋白药物相关的神经毒性副作用并不令人惊讶，因为微管蛋白不仅是细胞分裂的主要参与者，还是独立于有丝分裂的细胞骨架功能的主要参与者。此外，许多癌症本身对所述药物具有抗性或在长期治疗过程中变得对所述药物具有抗性。这通常是P-糖蛋白(其功能是药物外排泵)或诸如乳癌抗性蛋白BCRP的其它药物外排泵的过表达造成的多药抗性的结果。抗性的其它来源包括微管蛋白同种型(特定药物与以较低效率与之结合)的表达提高以及微管蛋白结构的改变(通过翻译后修饰或突变，所述改变降低结合)。为开发潜在更为有效且较低毒的药物，己提出了数种策略。一种策略是改良现有药物或寻找靶向微管蛋白的新药。另一种途径在于靶向诸如有丝分裂检验点蛋白的仅在分裂中的细胞表达且其抑制也导致有丝分裂阻滞的其它蛋白。当前正研究不同蛋白家族(激酶和驱动蛋白)的成员。 因为这些蛋白中的许多都被认为在分离期有丝分裂具有专门化的特定功能，因而认为对所述蛋白的抑制可能潜在地可相对靶向微管蛋白的现有抗有丝分裂疗法而具有改善的治疗指数。然而，搜寻具有潜在较小副作用的有丝分裂纺锤体特定抑制剂而非新的微管蛋白药剂的基本原理越来越弱。一方面，诸如Aurora A(己知其在有丝分裂中的特定作用)的激酶近来已显示作用于间期微管骨架。另一方面，原因是微管毒物的抗肿瘤作用中的一些可能也归因于与微管蛋白细胞骨架的间期相互作用(Pan and Snell，2007 ；Pugacheva et al.， 2007)。搜寻直接靶向微管蛋白(或微管)或靶向能够调节微管动力学的蛋白的破坏微管动力学的药剂(Bhat and Setaluri, 2007 ；Muller et al.，2007)仍是癌学的重要问题。本申请人已惊讶地发现，本发明的式⑴的化合物相比现有技术已知的化合物具有数点优势-它们能够生成Glu-微管蛋白并诱导微管网络对诺考达唑诱导的解聚的抗性。在体外，它们不直接作用于微管蛋白。因此，它们稳定微管但具有不同于其它已知微管稳定化化合物的作用模式，所述其它已知微管稳定化化合物诸如紫杉烷类物质或埃博霉素能够附着至微管蛋白；-它们相比现有技术已知的化合物毒性显著较小，并且即使在使用现有技术化合物观察到的高抗性情况下仍具有活性；-此外，它们还对肌动蛋白细胞骨架具有作用。肌动蛋白细胞骨架被重组织并在某种程度上对拉春库林(latrimculine)诱导的解聚更具抗性。细胞运动受到抑制。因此，通过抑制细胞运动，所述化合物可减少肿瘤的远程散播，因而具有额外的抗转移性质；
-它们因而构成有利的可选择性治疗，尤其是观察到例如出现对其它治疗(紫杉烷类物质)的抗性时。本发明的一个主题因而是作为药物的式(I)的化合物。因此，本发明的第一主题涉及作为药物的对应于下式(I)的四环化合物及其药学上可接受的盐
权利要求
1.作为药物的四环化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述化合物对应于下式
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于R1是氢原子。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的化合物，其特征在于&是甲基基团。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其特征在于民是甲基基团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于所述-OR4基团是-OH基团或甲氧基基团。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于所述-OR4基团是式-O-CH2-C6H5的苯甲基醚基团或式-OC(O)C6H5的苯甲酸酯基基团，后者可在邻位、间位或对位被选自-NO2、-NH2、-N (CH3) 2、-CN、-CH2NH2或-CH2N(CH3)2基团的取代基任选地取代。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于所述&基团是氢原子或二甲基氨甲基基团。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，其特征在于所述&基团是通过双键与环 D结合的氧原子。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其特征在于所述&基团是氢原子。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的化合物，其特征在于所述化合物对应于下式
11.化合物，其特征在于所述化合物对应于下式(I)
12.药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含作为活性成分的至少一种根据权利要求1-11中任一项所述的化合物和至少一种药学上可接受的载体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于所述组合物还包含另一抗癌活性成分。
14.评价权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物的抗癌活性的方法，其特征在于所述方法包括1).在用待测试化合物孵育真核细胞后，用保护微管网络但可清除解聚微管蛋白的缓冲液透化所述细胞；2).在固定所述细胞后，用抗酪氨酸化微管蛋白一抗和在波长λ1发射的二抗标记 Tyr-微管蛋白，用抗去酪氨酸化微管蛋白一抗和在波长λ 2发射的二抗标记Glu-微管蛋白，随后在所述各波长下进行荧光定量，目的在于鉴定对所述解聚试剂最为敏感的动态微管和稳定化的微管；3).补充标记细胞核，以评价所述细胞层的状态；4).在与步骤1)相同的条件下，将HeLa细胞与待测试化合物孵育，如果在所述波长 λ 2观察到荧光，则排除所述化合物；5).用线粒体标记物对所孵育细胞的样品染色，用叠氮化钠对孵育细胞的样品染色，并比较所述叠氮化钠和所述待测试化合物对线粒体的作用，如果所述化合物显示对线粒体染色的调整与叠氮化钠相似，则排除所述化合物；6).将HeLa细胞与待测试分子孵育，任选地用诺考达唑处理，随后分析微管网络的免疫荧光标记，并使用检测仪定量；和7).用待测试化合物孵育所述HeLa细胞，随后任选地与拉春库林B共孵育，并用偶联有荧光团(λ2下发射)的毒蕈肽标记F-肌动蛋白，以分析所述待测试化合物对肌动蛋白网络的作用，当所述化合物未调整肌动蛋白网络形态时，排除所述化合物。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于预防和 /或治疗神经退行性病变的药物。
16.根据权利要求15所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于预防和/或治疗阿尔茨海默氏病和精神分裂症的药物。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于预防和 /或治疗寄生虫病的药物。
18.根据权利要求17所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于预防和/或治疗疟疾的药物。
19.根据权利要求1-11中任一项所述的式(I)的化合物，所述化合物用作用于预防和 /或治疗青光眼的药物。
20.体外筛选易于抑制或稳定LIMKl活性的分子的方法，所述方法包括(i)使LIMKl与任选具有标记的权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物接触；( )加入所述待测试化合物，和(iii)评价所述待测试化合物对式(I)化合物的置换。
21.体内筛选直接或间接的LIMKl活化剂或磷酸酶抑制剂的方法，所述方法包括 (i)使权利要求1-11中任一项所述的式(I)化合物与真核细胞、优选人细胞接触， ( )通过测定LIMKl底物例如丝切蛋白的磷酸化的降低，评价所述式(I)化合物的抑制作用，(iii)加入所述待测试化合物，和(iv)测定所述待测试化合物在抑制LIMKl底物磷酸化中的作用。
全文摘要
本发明涉及对应于以下通式(I)的吡啶并咔唑类化合物作为药物的用途，更具体地，涉及其在抗癌症化疗中的应用本发明的另一主题是式(I)的具体化合物以及包括本发明式(I)化合物的药物组合物。本发明还涉及式(I)化合物在制备旨在用于预防和/或治疗诸如阿尔茨海默氏病和精神分裂症的神经退行性病变的药物，制备旨在用于预防和/或治疗诸如疟疾的寄生虫病的药物或制备旨在用于预防和/或治疗青光眼的药物中的用途。
文档编号A61K31/475GK102395587SQ201080017070
公开日2012年3月28日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月20日
发明者克里斯蒂安·里瓦勒, 劳伦斯·拉法内谢尔, 卡罗琳·巴雷特, 吉亨·源, 埃米莉亚·瓦萨尔, 雷诺·普吕当 申请人:原子能与替代能源署, 国家科学研究中心, 居里研究所