专利名称：一种重组腺病毒的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒，具体地说是涉及一种重组腺病毒的制备方法及其用途，该重组腺病毒包含hITF全长基因序列，属生物医学技术领域。
背景技术：
严重烧伤不仅可导致大面积的皮肤及皮下组织损毁，各脏器也都存在不同程度的损害，其中胃肠道损害尤为严重，肠道已被视为“烧(创)伤应激的中心器官之一”。烧伤后胃肠粘膜屏障功能受损是引发肠源性感染、肠源性高代高、全身炎症反应综合症(S^S)， 乃至多器官功能障碍(MODS)的重要原因。因此，如何减轻严重烧伤后胃肠粘膜损伤，加速胃肠粘膜修复是目前烧伤救治中的重要问题。肠三叶因子(intestinal trefoil factor, ITF)是由肠杯状细胞特异分泌的小分子多肽，它的59个氨基酸序列中有一段特殊的核心结构域，其间的6个半胱氨酸按特定(1-5，2-4和3-6)的顺序，依次以二硫键两两相接，形成3个环状结构，整个肽链由此发生弯曲和折叠，形如“三叶草”，故名肠三叶因子(ITF)。 ITF 一经发现便受到广大学者的广泛关注，大量的研究表明，ITF在肠粘膜的自我保护及修复机制中占据重要地位。作为一个具有广泛应用前景的药物前体，却因为复杂的制备过程、 较低的产量限制了它的应用。基因治疗是近年来出现的崭新的治疗手段，是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用， 从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。若通过基因治疗的途径将ITF基因导入体内， 可以使ITF在体内大量表达，有望简化繁琐的操作程序、降低昂贵的生产成本。腺病毒作为目前使用最为广泛的基因传递载体，具有众多优点宿主范围广、安全、滴度高、多基因表达、稳定、外源基因容量大、可高水平介导外源基因表达、可感染增殖和非增殖细胞、与人类基因同源性以及免疫途径简便。经检索，目前国内外尚未发现关于构建包含hITF基因的腺病毒载体的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种重组腺病毒的制备方法及其用途，该重组腺病毒为包含hITF全长基因序列的腺病毒，将hITF基因与穿梭质粒 (pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hlTF ；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒PAdEasy-I在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hlTF ； 该重组腺病毒可以高效感染肠上皮细胞，表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移， 作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。本发明是以如下技术方案实现的一种重组腺病毒的制备方法，它包含人肠三叶因子基因(hITF)的腺病毒，其特征是将hITF基因与穿梭质粒(pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hlTF ；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒pAdEasy-1 在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hlTF。所述的一种重组腺病毒的制备方法，其特征是包括如下步骤
(l)hITF基因的获得肠粘膜组织中总RNA的提取以及引物的设计；(2)重组穿梭质粒的构建含有hITF的信号肽与成熟肽序列，与腺病毒穿梭质粒 PAdTrack-CMV具有相同的内切酶位点BglII、Not I，经相同的两种内切酶酶切后，两种质粒分别产生互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下，目的基因hITF与腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV 相连；(3)重组穿梭质粒与骨架质粒同源重组线性化的重组穿梭质粒加入到BJ5183感受态细菌，37°C过夜培养，挑阳性克隆摇菌、提质粒，Pac I酶切鉴定；(4)重组腺病毒的包装脂质体介导pAd-hlTF质粒转染HEK293细胞，腺病毒的收集与扩增以及腺病毒的滴度测定(TCID50法)；所述的重组腺病毒可以高效感染肠上皮细胞，表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移，作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。所述的重组腺病毒在烧伤小鼠基因治疗胃肠粘膜损伤中的应用，首先制备30% TBSA ΙΙΓ烧伤小鼠模型；重组腺病毒灌胃，观察治疗作用。本发明的优点是传统的hITF治疗方法为，通过基因重组技术在体外制备hITF， 其制备过程复杂、纯化手段繁琐、保存条件严格，且产量低下；本发明通过制备含有hITF基因的重组腺病毒，口服该腺病毒后hITF可以在胃肠道内源源不断的产生，无需制备、纯化及保存hITF，而且产量高。
图1为RT-PCR产物电泳图；图2为重组质粒酶切鉴定示意图其中1:DL2000 Marker ；2，3 :Bgl II 和 Not I 双酶切；4 λ DNA/Hind III ；图3为重组腺病毒感染HEK293细胞(第一代)；图4为重组腺病毒感染HEK293细胞(第二代)；图5为腺病毒AchhITF感染HT-四细胞；图6为HT-四细胞RT-PCR产物电泳图；其中1:HT-29cell ；2 :Ad_EGFP感染细胞；3 :Ad_hITF感染细胞；M :DL2000marker图为 7hITF 的 Western-blot 鉴定；其中(A)细胞总蛋白(B)上清蛋白；1 :Ad-hITF感染；2 =Ad-EGFP感染；3 :HT_29 细胞；图8为AchhITF对HT-四细胞迁移的影响；其中A:Ad-hITF (Oh) ；B :Ad-hITF (24h) ；C =DMEM(Oh) ；D =DMEM (24h)图9为各组小鼠肠粘膜病理切片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明实施例1、重组腺病毒的构建(1)目的基因的获得组织中总RNA的提取
4
引物的设计hITF的信号肽+成熟肽cDNA编码区的大小为219bp，编码73个氨基酸。根据在 GenBank检索得到的hITF mRNA序列(NM003226)，使用I^rimer 5. 0软件设计以下引物弓丨物 1 5 ‘ -GAGACTCGAGATGCTGGGGCTGGTCCTGG-3 ‘，引物 2 5 ‘ -TTTAGAATTCGGAAGGTGCATTC TGCTTC-3'。上游和下游引物分别引入)(h0I、EC0RI酶切位点(下划线)，为了阅读框正确， 引物2添加碱基G (加粗)。反应条件94°C预变性5min后进入循环；94°C变性30sec，6rC退火30sec，72°C 延伸30sec，共30个循环；循环完成后72°C继续延伸lOmin。结果PCR扩增出与预计长度一致的240bp片段(图1)。(2)重组穿梭质粒的构建含有hITF的信号肽与成熟肽序列，与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV具有相同的内切酶位点Bglll、Not I，经相同的两种内切酶酶切后，两种质粒分别产生互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下，目的基因hITF与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV相连。重组穿梭质粒经Bgl II, Not I双酶切后，切出996bp大小的片段，证实为阳性克隆(图2)。(3)穿梭质粒与骨架质粒同源重组重组穿梭质粒I^c I线性化后加入到BJ5183感受态细菌，37°C过夜培养，挑阳性克隆摇菌、提质粒，Pac I酶切鉴定(4)重组腺病毒的包装第一轮(脂质体转染)线性化的腺病毒载体在lipofectamine2000介导下转染HEK293细胞，2天后出现发绿色荧光细胞，此时光镜下部分细胞形态没有明显改变；5天左右发光细胞大量增加，视野内荧光密集、明亮，成团出现；10天之后全部细胞变成绿色，光镜下可观察大量到细胞出现肿胀、变圆等典型的细胞病变效应(CPE)，部分细胞呈葡萄串样聚集，部分细胞变圆后漂浮(图3)。4. 2 第二轮将第一轮包装病毒的上清液，继续感染HEK293细胞，以进一步提高滴度。若病毒包装不成功，后续感染HEK293细胞则不会出现荧光；若包装成功，则会出现荧光，而且随收集病毒代数的增加，滴度不断提高，感染效率逐步提高，即HEK293细胞荧光的出现时间会越早，数量会越多。如图4所示，第二轮感染后1天，出现较多的绿色细胞，此时细胞形态没有明显变化；2天后，绿色细胞大量、成团出现，部分细胞肿胀、变圆；3天后，几乎所有细胞变绿，荧光强度高，大量细胞变圆、漂起(图4)。(5)重组腺病毒滴度测定取病毒液200 μ 1，将病毒液用DMEM培养液稀释至10—1倍，病毒液的体积变为2ml ； 从其中取出200 μ 1，将这200 μ 1再稀释10倍，此时病毒液的体积为anl，而病毒液的浓度为原液的10_2倍；依次类推，直至稀释至10_1(1，共10管，各管有病毒液1.8ml ；消化HEK293细胞，用DMEM培养液等细胞密度为1 XlO5Ail ；在96孔培养板中每孔加入此细胞悬液100 μ 1， 置于37°C、5%C02细胞培养箱中培养M小时；弃去培养液，滴加稀释后的病毒液。滴加情况如下第一行滴加10,的病毒液，第二行滴加10_9，依次类推，到第8行时病毒液的稀释倍数为10_3，每行的第11、12列不加病毒液，以作对照用；置于细胞培养箱中培养，于培养后第5天加入5% FCS-DMEM培养液50 μ 1/孔，继续培养并于第8天再加入培养液50 μ 1/孔；于培养后第10天显微镜下观察各孔，以培养孔中出现CPE现象为阳性，计数阳性细胞孔数。根据 Karbers公式计算所测样本病毒载体滴度腺病毒载体滴度=101+1(rattS_°_5)+1TCID50/ml = 10l+l(Ktt -0.5)+l-0.7pfu/ml (注培养孔中只要出现一点CPE现象或绿色荧光，即可认为阳性；
阳性数计算从KT1至10,，IO-1和10_2阳性比例均为1 ；最低稀释度100%阳性、最高稀释度 100%阴性方可视为有效)。本方案在293细胞接种腺病毒后10天，观察到在10_3，IO-4稀释度的样本中全部293细胞出现CPE现象，而10,稀释度则没有出现CPE现象。按Karbers 公式计算扩增所得腺病毒的滴度为=io1+1(1+1+1+1+1+1+1+1+0-5+0-°5)+1TCID50/ml = 1010TCID50/ml 或者=1093pfu/ml = 2X109pfu/ml实施例2、重组腺病毒促进肠上皮细胞迁移的实验(1)肠上皮细胞的培养HT-四细胞采用含10% FCS的DMEM培养液，青霉素、链霉素各100U/ml，37°C 5% CO2培养，细胞隔天换液一次，每3-4天进行传代，传代比例为1 3，选取形态好的细胞用于实验研究。(2)重组腺病毒感染肠上皮细胞HT-29细胞接种于6孔板细胞，密度5 X IO5个细胞/孔，放置于37°C培养箱内培养过夜，确保第二天的细胞密度达到80%，而且细胞状态良好、细胞密度适中；选取1孔细胞消化计数，以MOI值50计算所需病毒载体量；以新鲜培养液漂洗6孔板的细胞2次，将病毒加入至6孔板中，新鲜培养液补足至anl，37°C 5% CO2的培养箱培养。结果显示HT49细胞在MOI = 50条件下感染重组腺病毒，粗略估计感染率接近100% (任一视野，计数表达 GFP的细胞占细胞核的比例)，而细胞形态光镜下没有变化(图5)；(3) RT-PCR 检测重组腺病毒感染肠上皮细胞后2天收集细胞，提取总RNA，行RT-PCR检测。图6显示，感染了重组腺病毒的肠上皮细胞可以扩出目的条带，未感染及空病毒感染的细胞均未扩出条带，说明重组腺病毒感染的肠上皮细胞能转录出hITF基因(图6)。(4) Western blot 检测重组腺病毒感染细胞6- 后改用无血清培养基，3天后提取细胞及上清，上清蛋白予TCA (三氯乙酸)沉淀浓缩，并经SDS-PAGE电泳后行flfestern blot检测病毒感染细胞。图7结果显示，重组腺病毒感染后细胞内及上清均可以出现一条显色带，而未感染组则没出现显色带，表明表达产物能与抗hITF的单克隆相结合，具有抗原性(图7)。(5)Ad-hITF感染对结肠癌细胞迁移能力的影响收集对数期HT-四细胞，接种于M孔板，调节细胞数5 X IO5/孔，置37°C、5% CO2 温箱培养；细胞培养过夜后，以MOI值为50的病毒感染细胞，370C 5% CO2培养2_3天；待全部细胞表达GFP后，用10 μ 1吸头于M孔板底部勻速划一直线，造成约300 μ m宽的线性机械损伤；用无血清培养液冲洗细胞表面两次以去除细胞残骸和碎片；加入无血清的DMEM 溶液继续孵育，24h后观察细胞移行情况，测量划痕宽度变化。如图8所示，实验造成宽度约 300 μ m的划痕，重组腺病毒感染HT-四细胞M小时后划痕宽度明显缩小，空载病毒组和无血清DMEM组划痕宽度缩小不显著。(图8)。实施例3、重组腺病毒对烧伤小鼠的胃肠粘膜损伤的治疗作用
(1)制备30% TBSA III0烧伤小鼠模型烧伤小鼠伤前禁食12h，l%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，背部电推剃毛后8%硫化钠脱毛，3%固体汽油烧伤12sec，伤后立即腹腔注射50ml/kg的乳酸林格氏液抗休克，伤后予动物专用饲料喂养，自由进水。实验分烧伤后天(post burn days，PBD)l、3、5、 7,四个时相点，每个时相点包括B和Ad-hlTF两组，每组每时相点至少6只小鼠。Ad-hlTF 组于伤前2天予第一次重组腺病毒灌胃，烧伤小鼠麻醉清醒后给予第二次灌胃，剂量均为 2X 108pfu/只，B组给予等量生理盐水灌胃2次。(2)重组腺病毒灌胃，观察治疗作用肠组织病理学观察肠组织置10%福尔马林液中固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察、照相。 如图9所示烧伤后3d，病理切片显示，正常小鼠肠绒毛排列整齐，上皮细胞层完整，表面平滑，黏膜上附有薄层粘液(正常值)。烧伤组肠绒毛排列紊乱、断裂，上皮细胞水肿、变性、坏死，甚至部分脱落以致固有层裸露(烧伤组)。Ad-hlTF组则上述病理变化减轻，主要以上皮细胞充血和水肿为主，中央乳糜管轻度扩张，肠黏膜上皮基本保持完整，未见肠黏膜大面积出血、坏死和脱落(治疗组)。
权利要求
1.一种重组腺病毒的制备方法，它包含人肠三叶因子基因(hITF)的腺病毒， 其特征是将hITF基因与穿梭质粒(pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒 pAdTrack-CMV-hlTF ；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒pAdEasy-Ι在大肠杆菌 BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hITF。
2.根据权利要求1所述的一种重组腺病毒的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)hITF基因的获得肠粘膜组织中总RNA的提取以及引物的设计；(2)重组穿梭质粒的构建含有hITF的信号肽与成熟肽序列，与腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV具有相同的内切酶位点Bglll、Not I，经相同的两种内切酶酶切后，两种质粒分别产生互补的粘性末端，在T4DNA连接酶的作用下，目的基因hITF与腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV 相连；(3)重组穿梭质粒与骨架质粒同源重组线性化的重组穿梭质粒加入到BJ5183感受态细菌，37°C过夜培养，挑阳性克隆摇菌、提质粒，Pac I酶切鉴定；(4)重组腺病毒的包装脂质体介导pAd-hlTF质粒转染HEK293细胞，腺病毒的收集与扩增以及腺病毒的滴度测定(TCID50法)；
3.—种重组腺病毒的用途，其特征是所述的重组腺病毒可以高效感染肠上皮细胞， 表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移，作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。
4.根据权利要求3所述的一种重组腺病毒的用途，其特征是所述的重组腺病毒在烧伤小鼠基因治疗胃肠粘膜损伤中的应用，首先制备30% TBSA ΙΙΓ烧伤小鼠模型；重组腺病毒灌胃，观察治疗作用。
全文摘要
本发明涉及一种重组腺病毒，具体地说是涉及一种重组腺病毒的制备方法及其用途，该重组腺病毒包含hITF全长基因序列的腺病毒，属生物医学技术领域。本发明将hITF基因与穿梭质粒(pAdTrack-CMV)相连接，构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF；再将重组穿梭质粒线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组，构建重组腺病毒载体Ad-hITF；该腺病毒可以高效感染肠上皮细胞，表达出分泌型hITF，显著地促进肠上皮细胞迁移，作为药物对胃肠粘膜损伤具有治疗作用。
文档编号A61K48/00GK102492723SQ20111040414
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者孙勇, 朱云 申请人:孙勇