具有用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种可以用作疫苗的组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具，以及佐剂粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。该组合物可以用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。
【专利说明】具有用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具的组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种组合物，其可以用作包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具的疫苗。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG样寡脱氧核苷酸用作佐剂。在一个方面中，这种组合物在任何恒温动物中可以用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏反应和/或自身免疫疾病。
【背景技术】
[0002]疫苗为生物制剂，其被注入到机体内，机体产生抗体并提供对疾病的免疫力。疫苗可以是预防性的或治疗性的。就其在制造中的容易程度、生产的低成本以及施用方法而言，疫苗提供了潜在的优点。由于为了达到有效性，疫苗必须激发特异性的且强的CD8+T细胞应答，所以治疗性疫苗的研发是一种挑战。
[0003]树突状细胞(DC)是控制一系列免疫应答的高度特异化的抗原呈递细胞(APC)。树突状细胞可以调动多种免疫抵抗机制，例如CD8+T细胞、细胞毒T细胞、CD4+辅助T细胞、自然杀伤(NK)细胞以及自然杀伤T (NKT)细胞。这些淋巴细胞的每一种都具有识别和杀死患病细胞、以及释放保护性细胞因子(例如IFN-Y和CD4T细胞)的作用。此外，树突状细胞还为CD8+溶细胞性细胞提供帮助和维持，而NK和NKT细胞可以消除会妨碍MHC I类呈现(由此会逃避CTL的识别)的分子。因此，在免疫中非常重要的是抗原被传递至树突状细胞，从而在体内取得抗原的呈递，以及树突状细胞的成熟，使得细胞分化，由此它们不会通过不同的机制诱导耐受。
[0004]树突状细胞由抗原加工细胞到抗原呈递细胞的过度通常是通过I类和II类主要组织相容性蛋白质(MHC)的表达的增加来完成的。活化的且成熟的树突状细胞诱导特异性的T细胞免疫以及对肿瘤和其他患病状态的抗性。
[0005]本领域已知有多种载体将多种抗原传递至恒温动物，所述的载体例如有脂质体、微米粒子和纳米粒子，以及毒素载体、单克隆和多克隆抗体。但是，这些载体中，许多都不能靶向树突状细胞，并且不具有刺激足够的免疫应答的足够佐剂性质。
[0006]已知志贺毒素(志贺毒素)的B亚单元(毒素载体)为可以用于直接或间接靶向Gb3受体的通用载体。美国专利号6，613，882描述了式B-X的嵌合多肽，其中B为志贺毒素的B亚单元或其功能等价物，X为具有治疗意义的多肽。美国专利7，632，514B2描述了具有式STxB-Z (n) -Cys-X的载体，其中STxB为志贺毒素的B亚单元，Z为不具有巯基基团的氨基酸连接体并且η为0、1、2或为多肽，Cys为半胱氨酸。
[0007]美国专利申请号0100266672描述了疫苗组合物，该组合物包含志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，其能够与Gb3受体结合，并且与至少第一抗原络合；所述的组合物进一步包含第二抗原以及选自金属盐、油水乳液、Toll样受体配体、皂苷以及它们的组合中的佐剂。
[0008]尽管多种类型的载体用作疫苗，但是本领域仍需要改善免疫原性，并由此改善疫苗治疗多种疾病状态的效力。[0009]发明概述
[0010]本发明提供了一种组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具，以及佐剂，其中所述的至少一种抗原与所述的工具组合，而所述的佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG样寡脱氧核苷酸。
[0011]在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，该组合物包含与至少一种抗原结合的、靶向树突状细胞的载体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG样寡脱氧核苷酸。在这一方面中，载体可以为靶向树突状细胞的任何载体，例如与抗体络合的脂质体，与抗体络合的微米粒子和与抗体络合的纳米粒子、靶向树突状细胞的毒素载体、或者靶向树突状细胞的单克隆或多克隆抗体。此外，还可以使用单克隆或多克隆抗体的片段，只要它们保持它们的靶向能力即可。
[0012]在另一个方面中，用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具为抗-DEC205抗体，优选的是CD205、NLDC-145、保留了它们的靶向树突状细胞能力的片段、以及它们的混合物。
[0013]在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，该组合物包含志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物、以及佐剂，其中所述的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合，而所述的佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG样寡脱氧核苷酸。
[0014]在本发明的组合 物中，用于靶向树突状细胞的工具或靶向树突状细胞的载体、靶向树突状细胞的毒素载体或者靶向树突状细胞的单克隆或多克隆载体、靶向树突状细胞的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物通过共价结合、通过静电或疏水性相互作用或者作为融合蛋白质与至少一种抗原结合。
[0015]本发明的另一个方面为志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物通过化学偶联以半胱氨酸基团或Z (n) -Cys基团与所述的至少一种抗原结合，其中Z为不具有巯基基团的氨基酸并且η为O、I或为多肽。
[0016]所述的至少一种抗原可以为癌症抗原，得自感染性疾病的抗原(例如细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或原生动物抗原)、自身免疫抗原、过敏抗原及它们的混合物。因此，所述的组合物可以用于治疗恒温动物的多种医学疾病状态。
[0017]此外，本发明的另一个实施方案为一种组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0018]此外，本发明的另一个实施方案为一种组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体、或用于靶向靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆的抗体，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0019]此外，本发明的另一个实施方案为一种组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。[0020]在本发明的另一个方面中，本文所述的组合物可以用作药品，优选作为疫苗。因此，本文所述的组合物可以用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。此外，它们还可以用于治疗乳腺癌。
[0021]在本发明的另一个方面中，提供了制造用于接种恒温动物的药剂的组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具，或用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体，或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体，或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体；以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0022]在本发明的另一个方面中，提供了制造用于接种恒温动物的药剂的组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0023]本发明的另一个实施方案为制造用于治疗恒温动物的癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和自身免疫疾病的药剂的组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具、或用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0024]本发明的另一个实施方案为制造用于治疗恒温动物的癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和自身免疫疾病的药剂的组合物，该组合物包含靶向树突状细胞 并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能片段，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0025]本发明的另一个实施方案为制造用于治疗乳腺癌的药剂的组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞的工具或靶向树突状细胞的载体，或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体，或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，靶向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的志贺毒素的B亚单元或志贺毒素的B亚单元的免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0026]本发明的另一个实施方案为用于接种的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的组合物以及可药用的赋形剂。该疫苗适用于同时、依次或分开向恒温动物施用。
[0027]在另一个方面中，本发明提供了用于活化细胞毒T淋巴细胞的方法，该方法包括向需要这种活化的恒温动物施用一种组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞的载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或志贺毒素的B亚单元的免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0028]本发明的另一个方面为用于治疗恒温动物的癌症，或者由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和自身免疫疾病的方法，该方法包括向需要这种治疗的恒温动物施用一种组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者与靶向树突状细胞并至少一种抗原组合的志贺毒素的B亚单元或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元的免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0029]此外，本发明还提供了用于治疗乳腺癌的另一种方法，该方法包括向需要这种乳腺癌治疗的哺乳动物施用一种组合物，该组合物包含用于靶向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的工具、或靶向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的载体、与HER-2/neu抗原组合的毒素载体、或祀向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的单克隆或多克隆抗体、或者靶向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的志贺毒素的B亚单元或志贺毒素的B亚单元的免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0030]其他方面和实施方案在下文中列出，或者通过以下优选实施方案的描述将容易得出。
[0031]附图简述
[0032]图1为在Elispot测定中，使用志贺毒素的B亚单元_0VA257_264或单独的0VA257_264与20g GM-CSF/CpG接种小鼠后，显示LT-⑶8抗-OVA的CTL诱导的柱状图。这些柱状图显示出每组4只小鼠的平均值 土标准偏差。
[0033]图2为在使用志贺毒素的B亚单元-0VA257_264或单独的0VA257_264与不同浓度的不同佐剂Gal Cer、GM-CSF/IFA或GM_CSF/CpG接种小鼠后，通过四聚体法分析显示出抗-OVA的CTL诱导的对比分析的柱状图。测量四聚体Kb-0VA257_264的诱导，并显示为平均值土标
准偏差。
[0034]图3为在小鼠中使用Her2/neu HLA-A2限定的四聚体的四聚体法分析，显示在使用GM-CSF和CpG作为佐剂(以及志贺毒素的B亚单元)之间的协同作用的柱状图。小鼠使用单独的与Her-2/neu肽偶联的志贺毒素的B亚单元、或者与CpG(50pg)、GM_CSF (20pg)或等量的GM-CSF与CpG的组合形成的混合物免疫。
[0035]图4为显示小鼠中通过志贺毒素的B亚单元以及20g GM-CSF的Elispot测定产生的CTL诱导结果的柱状图，其中所述的志贺毒素的B亚单元与由HLA-A2限定的HER-2/neu 肽(KIFGSLAFL(SEQ ID NO: 2))和序列(RRAR(SEQ ID NO: 3))相应的肽 IBC002(RRARKIFGSLAFL(SEQ ID NO:1))、非载体化的肽IBC002、或不具有侧翼序列的天然Her2/neu肽偶联。第二天施用50g CpG。在第14天进行二次免疫,未使用任何佐剂。
[0036]图5为示出在接种后诱导的抗-Her2/neu369_377ra8+T细胞具有良好的亲合力的柱状图,在Elispot测定中，所述的细胞可以使用低至0.01g/ml Her2/neu369_377的肽来活化。按照图4所述来进行免疫以及通过Elispot对CTL活化的揭示。
[0037]以下过程列于实施例7中。
[0038]图6示出GM-CSF和CpG的组合作为佐剂与抗_DEC205_0VA257_264协同作用来激发抗-0VA257_264ra8+T细胞。使用四聚体Kb-OVA257_264测量这种诱导。各试验中包含不相关的对照四聚体，并且使用这种四聚体所观察到的背景(总是〈0.05%)推定为特定的值。
[0039]图6A 为使用单独的抗-DEC205-0VA257_264(右图)或者与 GM-CSF(20pg)和 CpG(50pg)(左图)组合，经皮下免疫后获得的特异性抗-0VA257_264的特异性⑶8+T细胞的百分率示意图。
[0040]图6B为由小鼠得到的平均抗-0VA257_264CD8+T细胞(n=4只小鼠/组)土标准偏差的柱状图，其中所述的小鼠使用单独的抗-DEC205-0VA257_264或者与GM-CSF和CpG组合来免疫。此外，还示出了使用对照的不相关的四聚体得到的平均背景。 [0041]优选实施方案的描述
[0042]如本文所用，缩写“APC”是指抗原呈递细胞，其为展示外源抗原的细胞，并在其表面上具有主要组织相容性复合体(MHC)的复合体，其中在所述的表面上，所述的复合体可以与T细胞受体相互作用。
[0043]如本文所用，缩写“GM-CSF”是指粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，并且在本发明中被用作佐剂。
[0044]如本文所用，缩写“ IFA”是指不完全弗氏佐剂。
[0045]缩写“CTL”是指细胞毒T淋巴细胞，其为杀死其他靶细胞的淋巴细胞。大部分的CTL属于T细胞的⑶8+亚群，使用抗原的α β T-细胞受体(TCR)，在I类MHC的槽中识别抗原，并且如果它们遇到树突状细胞上的抗原/MHC(它们的TCR对这种抗原/MHC是特异性的)，则它们进入细胞周期并分化成“杀伤细胞”。
[0046]如本文所用，缩写“MHC”是指主要组织相容性复合体，并且为用于展示T淋巴细胞的肽抗原的免疫系统机制。
[0047]如本文所用，术语“佐剂”是指帮助或增强药品或疫苗的药理学作用、或者增加抗原刺激免疫系统的能力的任何物质。
[0048]如本文所用，“CpG寡脱氧核苷酸”为携带未甲基化CpG基元的短DNA序列，该序列与Toll样受体9 (TLR9)结合。TLR为在B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达的受体，弓丨起MHC和其他刺激分子的上调，这进而导致更有效的APC介导的T细胞的刺激。CpG寡脱氧核苷酸的实例包括 0DN2006、ODN D35、0DN1018ISS、0DN1758、0DN1826、0DN2216、0DN2007、0DN1668、0DN1720、0DN2006、0DN2041、0SN7909、CpG-28 等。
[0049]如本文所用，“结合的”涵盖本领域的那些技术人员已知的所有可能的工具，从而使用于将至少一种抗原靶向树突状细胞的工具与所述的至少一种抗原在物理上相关联。具体而言，此类术语是指至少一种抗原与用于靶向树突状细胞的工具形成化学偶联，或者至少一种抗原与用于靶向树突状细胞的工具形成基因融合，或者通过静电、疏水性相互作用或任何其他相互作用而相关联。因此，至少一种抗原与用于靶向树突状细胞的工具、用于靶向树突状细胞的载体、用于靶向树突状细胞的毒素载体(例如志贺毒素的B亚单元)或者靶向树突状细胞的多克隆和单克隆抗体通过静电或疏水性相互作用而在物理上相关联，或者可以通过化学或融合蛋白质形成共价连接，或者通过半胱氨酸残基连接，如美国专利7，632，514 中所述。
[0050]如本文所用，术语“恒温动物”包括鸟和哺乳动物。
[0051]可以使用本发明的组合物和方法治疗的鸟的实例包括蓝鸟、红雀、鸽子、鹰、鹅、火鸡、小鸡、母鸡、鸭子、鹌鹑、鹭、麻雀、啄木鸟、猫头鹰、鹦鹉等。[0052]术语“哺乳动物”涵盖哺乳类的多种恒温脊椎动物的任意一种，包括人，所述的动物表征为皮肤上覆盖有毛发，并且在雌性中具有用于喂养幼崽的产奶的乳腺。特别由于公知的是动物还可以具有不同的医学病理，所以本发明不限于治疗人类，而且还涵盖了兽医的用途。
[0053]可以使用本发明的组合物和方法治疗的哺乳动物的实例包括人类、家畜(例如狗和猫)、马、小鼠、山羊、鹿、奶牛、兔子、动物园动物、熊、猴子、猿、麋鹿、野牛，但是本发明也可以用于其它哺乳动物物种。
[0054]如本文所用，缩写“LT-CD8”是指CD8+T淋巴细胞，其为细胞毒T淋巴细胞，该细胞毒T淋巴细胞监控机体的细胞，并以MHC类途径破坏表达外源抗原片段的任何细胞。
[0055]如本文所用，“树突状细胞”是指任何类型的树突状细胞，包括浆细胞样树突状细胞、CD8+树突状细胞、CD8-树突状细胞、髓样树突状细胞、炎性树突状细胞、Tip树突状细胞和郎格汉氏细胞。因此，树突状细胞包括迁移性树突状细胞(例如郎格汉氏细胞和真皮树突状细胞)、淋巴组织残余树突状细胞(例如胸腺和脾脏的树突状细胞)、以及炎性树突状细胞。
[0056]“用于靶向树突状细胞的工具”包括任何工具，例如与抗体络合的脂质体；生物材料，例如与抗体络合的纳米粒子、与抗体络合的微米粒子、以及毒素载体。在另一个方面中，靶向树突状细胞的抗体可以与至少一种抗原直接络合。抗体可以为靶向树突状细胞受体的单克隆或多克隆抗体。可以使抗原靶向树突状细胞的抗体的实例包括靶向甘露糖受体、Fcy受体、去唾液酸糖蛋白受体、血液DC抗原2(BDCA-2)、Clec9A、Clecl2A、CDllc、CD8、cDC、DCIR-2、FIRE、CIRE、dectin-1、dectin-2、DC-SIGN、L-SIGN、MANR、MMR、MGL, CD23、⑶69、⑶94、Ly-49和N KG2的那些抗体。因此，任何抗-甘露糖受体抗体、抗_Clec9A抗体、抗-Clecl2A抗体、抗-CDllc抗体、抗-CD8抗体、抗-cDC抗体、抗-DCIR-2抗体、抗-FIRE抗体、抗-CIRE抗体、抗-dectin-1抗体、抗-dectin-2抗体、抗-DC-SIGN抗体、抗-L-SIGN抗体、抗-MANR抗体、抗-MMR抗体、MGL抗-抗体、抗-CD23抗体、抗-CD69抗体、抗-CD94抗体、抗-Ly-49抗体和抗-NKG2抗体都可以用于本发明的组合物和方法中。此外，还可以使用这些抗体的片段，只要它们保留了靶向树突状细胞的能力即可。
[0057]就志贺毒素的B亚单元的实施方案而言，“其免疫功能等价物”是指毒素起到类似于志贺毒素的B亚单元的免疫作用，并且可以与Gb3细胞结合，和/或它们可以内化至少一种抗原，使得该至少一种抗原可以被呈递至MHC I类途径，或者在相同的抗原呈递细胞上被呈递给MHC I类和II类途径。此外，免疫功能等价物可以靶向树突状细胞。
[0058]如本文所用，“治疗”是指对恒温动物给予医疗护理或关注，和/或特别是通过疫苗与疾病抗争，其中所述的疫苗可以为治疗性疫苗或预防性疫苗。
[0059]“CpG-样”寡脱氧核苷酸是指寡脱氧核苷酸具有大量的相同的内部基元(核苷酸G和C彼此交替)，但是外部基元不同，该外部基元并非为G和C核苷酸，并被Toll-样受体9所识别。在内部基元中的G和C核苷酸含量占寡脱氧核苷酸长度的至少50%GC。
[0060]如本文所用，“至少一种抗原”是指单独的一种抗原或者多于一种抗原(例如2、3、
4、5、6、7、8、9或10种抗原)被本文所述的工具、载体、毒素载体或者单克隆或多克隆抗体所靶向。此外，可以与本文所述的用于靶向的工具、载体、毒素载体或者单克隆或多克隆抗体结合的不同抗原的混合物也被涵盖在本发明的范围内，并且抗原的片段也涵盖在本发明的范围内，只要这些片段保留了它们的抗体生产活性即可。
[0061]此外，本发明还进一步涵盖了本文所述的与不同抗原组合的不同载体、毒素载体或者单克隆或多克隆抗体的混合物，以及本文所述的不同载体、毒素载体或者单克隆或多克隆抗体的这些不同的混合物的施用，其中所述的不同载体、毒素载体或者单克隆或多克隆抗体上具有不同的抗原与它们组合。
[0062]“基本由……组成”是指主要元素存在于组合物或疫苗中，而且不会在实质上影响组合物或疫苗的少部分组分也可以存在。
[0063]在整个说明书中，术语包含、组成或者基本上由……组成可以交换使用。
[0064]更具体而言，本发明提供了一种组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。用于靶向的工具与至少一种抗原结合。
[0065]如本文所述，这些组合物可以用作药品，优选为疫苗。这种疫苗可以治疗现有的疾病状态，并由此为治疗性疫苗；或者用于防止疾病状态的发展，由此为预防性疫苗。应该理解的是预防性疫苗通常产生体液应答，而治疗性疫苗通常产生CD8+T淋巴细胞应答。在本文所述的组合物和方法中特别关注的治疗性疫苗。
[0066]用于靶向的工具包括任何的工具，例如与抗体或其片段结合的脂质体(其中所述的片段保留了它们靶向树突状细胞的能力)；生物材料，例如与抗体或抗体的片段结合的纳米粒子或微米粒子，只要所述的抗体片段保留了它们靶向树突状细胞的能力即可；与至少一种抗体结合的毒素载体；或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体；以及它们的组合。
[0067]在另一个方面中，本·发明提供了一种组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。在这一方面中,所述的载体可以为任何载体，例如与抗体或其片段结合的脂质体，其中所述的抗体片段保留了它们的靶向能力；生物材料，例如与抗体或抗体的片段结合的纳米粒子或微米粒子，只要所述的抗体的片段保留了它们的靶向能力即可；靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体；以及它们的组合。在另一个方面中，靶向树突状细胞的单克隆或多克隆抗体可以与至少一种抗原结合。
[0068]可以使用任何类型的脂质体捕获至少一种抗原。诸如磷酸甘油酯和鞘脂之类的任何天然或合成的磷脂都可以用于制造脂质体。可以使用诸如磷脂酰胆碱(PO、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸之类的天然磷脂。可以使用的合成磷脂包括二油酸磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。根据应用情况，可以将胆固醇引入到脂质体中。可以以胆固醇与PC的摩尔比为1:1或者甚至2:1的浓度来引入胆固醇。
[0069]脂质体可以为单层脂质体或多层脂质体。此外，脂质体还可以是交联的。
[0070]可以使用被动加载技术或主动加载技术，通过本领域已知的方法来制备本发明的脂质体。机械分散方法的实例包括脂膜水化法、微乳液法、超声波处理、法式压滤法、膜挤出法、干燥重组脂质体法和冻融脂质体法。溶剂分散法包括乙醇注射、醚注射、复乳化脂质体
法、逆向蒸发囊法和稳定的多层囊法。此外，使用诸如胆酸盐和Triton X? 100之类的洗
涤剂以及通过透析、稀释或柱层析除去洗涤剂也胃以用于脂质体的制备。[0071]此外，至少一种抗原可以通过纳米粒子被传递至树突状细胞。这些粒子的尺寸小于或等于lOOnm。它们可以由天然材料或衍生物、树突状聚合物、富勒烯、聚合物、二氧化硅、清蛋白、金、水凝胶以及本领域已知的其他材料来制造。用于制造纳米粒子的天然材料的实例包括壳聚糖、右旋糖苷、胶质、藻酸盐和淀粉。可以用于本发明的纳米粒子的多种聚合物包括聚乳酸、聚丙烯酸氰基酯、聚乙烯胺、嵌段共聚物、聚己酸内酯和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
[0072]可以使用多种材料涂敷纳米粒子，例如右旋糖苷涂料、肠溶衣、聚合物涂料、金涂料、聚乙二醇(PEG)涂料和碳水化合物涂料。
[0073]可以使用不同的方法来制备纳米粒子，例如研磨、高温分解、使用热等离子体、气相技术、复乳化溶剂蒸发法、气体流量聚焦、电喷雾、流体纳米沉淀、乳化-分散-蒸发法、改善的相转化法/溶剂分散法、或者溶胶-凝胶法。这些方法在文献中有所描述，并且是本领域的技术人员已知的。
[0074]微米粒子为尺寸为0.1至100 μ M的粒子。它们可以使用与纳米粒子相似的材料由天然或合成的聚合物制造。因此，纤维素、淀粉、溶血磷脂酰胆碱、聚(乳酸)、磷酸胆碱、聚(DL-丙交酯-共-乙醇酸交酯)、藻酸盐-精胺、聚氨基酸、聚磷腈、清蛋白、右旋糖苷、Eudragit S100、Eudragit L100、胶质和3-(三乙氧基甲娃烷基)丙基-封端的聚二甲基娃氧烷为用于制备微米粒子的一些材料。此外，本发明的微米粒子可以与其他材料嫁接。例如，与聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯酸酯嫁接的淀粉微米粒子或硅酮嫁接的淀粉微米粒子。
[0075]此外，还可以使用与上文用于纳米粒子的那些相同的涂料来涂敷微米粒子，即，右旋糖苷涂料、肠溶衣、聚合物涂料、金涂料、EudragitSlOO涂料、PEG涂料和碳水化合物涂料。
[0076]在配制微米粒子时，可以使用多种方法，例如喷雾-干燥、乳化/蒸发、复乳化/蒸发、盐析、溶剂替换/沉淀、冷制备(cryopreparation)、以及油包油乳剂/溶剂蒸发。这些以及其他方法在文献中有所描述(例如参见Kendall等人，Eur.J.Pharm, Sci37, 284-290(2009))，并且是本领域已知的。`
[0077]就用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具或者靶向树突状细胞的载体而言，可以配制脂质体、微米粒子或纳米粒子，使得至少一种抗原存在于这些载体的内部。在另一个方面中，至少一种抗原被配制在这些载体的外部上。在另一个方面中，至少一种抗原被配制在这些载体的内部和外部上。不同抗原的混合物可以以与本文所述相同的方式来配制。
[0078]为了将至少一种抗原包封在脂质体、微米粒子或纳米粒子载体的内部，可以在包含高浓度的至少一种抗原中配制载体。可以通过尺寸排阻色谱或平衡透析来除去载体上的未包封的一种或多种抗原。
[0079]在需要使至少一种抗原位于脂质体、微米粒子或纳米粒子载体的外部的情况下，可以使用本领域已知的任何工具(例如通过静电或疏水性相互作用)使至少一种抗原与载体结合，或者可以以化学方式共价连接。此为，至少一种抗原还可以通过连接体附着在载体上。使用的连接体的类型取决于载体的类型、载体以及络合于载体上的至少一种抗原中所使用的材料。连接体的实例包括巯基键、烷基键、乙二醇键、肽键以及烷基二硫键。
[0080]此外，附着在脂质体、微米粒子或纳米粒子的外部或包封在脂质体、微米粒子或纳米粒子的内部或这两者的至少一种抗原具有可以使抗原靶向树突状细胞的多克隆或单克隆抗体，这些抗体也可以附着在这些载体的外部。这些为用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具。可以使用将抗体附着脂质体、微米粒子或纳米粒子的任何工具，例如通过非共价结合、共价结合、吸附、通过静电或疏水性相互作用。
[0081]用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体或者多克隆或单克隆抗体的片段，只要这些片段保留了它们的靶向能力即可。此外，抗体还可以为嵌合抗体。此外，它们可以为多克隆抗体、单克隆抗体以及它们的片段的混合物。本发明中使用的片段应该保留它们结合树突状细胞的能力。此外，还可以使用将至少一种抗原传递至树突状细胞上的单链Fv (scFv)以及抗体的Fab片段。
[0082]在另一个方面中，可以使用双抗体(例如Hollinger, P.和Winter, G.在CancerImmunology, Immunotherapy νο145ηο, 3_4ρρ.128-130 (1997)所述的那些)、双特异性抗体(例如Hollinger等人在PNAS vol.90n0.14pp6444_6448 (1993)所述的那些)以及微抗体(例如 Tramontano 等人在 Journal of Molecular Recognition vol.7n0.lpp9-24 (1994)所述的那些)。
[0083]本发明的抗体可以为鼠抗体或人抗体。如果需要，鼠抗体可以经历“去鼠源化(demur ini zat ion)，，。
[0084]本发明中可以用于使组合物靶向树突状细胞的抗体的具体实例包括靶向甘露糖受体、Fey受体、去唾液酸糖蛋白受体、血液DC抗原2 (BDCA-2)、CD205、NLDC-145, Clec9A、Clecl2A、CDllc 、CD8、cDC、DCIR-2、FIRE、CIRE、dectin-l、dectin-2、DC-SIGN、L-SIGN、MANR、MMR、MGL,⑶23、⑶69、⑶94、Ly-49和NKG2的那些抗体。因此，任何抗_甘露糖受体抗体、抗-Clec9A抗体、抗-Clecl2A抗体、抗-CDllc抗体、抗-CD8抗体、抗_cDC抗体、抗-CIR-2抗体、抗-FIRE抗体、抗-CIRE抗体、抗-dectin-1抗体、抗-dectin-2抗体、抗-DC-SIGN抗体、抗-L-SIGN抗体、抗-MANR抗体、抗-MMR抗体、MGL抗-抗体、抗-CD23抗体、抗-CD69抗体、抗-CD94抗体、抗-Ly-49抗体和抗-NKG2抗体都可以用于本发明的组合物和方法中。此外，还可以使用多种抗体以及这些抗体的片段的混合物，只要所述的抗体的片段保留了它们的靶向能力即可。
[0085]在优选的实施方案中，抗体为抗-DEC205抗体，优选为⑶205、NLDC_145、它们的保留了它们的树突状细胞靶向能力的片段以及它们的混合物。
[0086]在一个方面中，靶向抗体靶向DEC205膜糖蛋白，并且在这方面可以使用的抗体为CD205抗体、NLDC-145抗体、它们的混合物以及它们的片段，只要抗体片段保留了它们的靶向能力即可。
[0087]生产多克隆抗体、单克隆抗体以及它们的片段的方法是本领域公知的。对于多克隆抗体或其片段而言，诸如纯化的多肽、与载体(例如GTS、钥孔戚血蓝素或任何合适的载体)偶联的多肽或被引入到免疫载体中的多肽之类的免疫原可以与佐剂混合，并使用混合物免疫动物。通过取得测试流血并测定所关注的多肽的反应性效价来监控动物对免疫原制备物的应答。当获得针对免疫原的合适水平的抗体时，由动物收集血液并制备抗血清。
[0088]对于单克隆抗体或其片段的制备而言，使用所选择的抗原免疫动物。由动物脾脏分离形成抗体的细胞，并与肿瘤细胞融合，然后在培养物生长。所得的杂交瘤细胞在培养物中生长，然后分离并纯化单克隆抗体。例如参见Kohler和Milstein Nature256 (5517)pp.495 (1975);Riechmann 等人 Nature332 (6162)pp.323-327(1998);Goding MonoclonalAntibodies:Principles and Practice (2nd ed) Academic Press, New York, N.Y.(1986)。
[0089]在一个实施方案中，至少一种抗原与树突状细胞靶向抗体或保留了树突状细胞靶向能力的抗体片段直接结合。在这种实施方案中，至少一种抗原直接或者通过连接体附至抗体。结合至少一种抗原的方法可以通过共价偶联形成融合蛋白质，或者通过静电或疏水性相互作用或离子相互作用。可以使用的连接体的实例包括巯基键、烷基键、乙二醇键、肽键以及烷基二硫键。
[0090]此外，还可以使用长的肽或脂肽使至少一种抗原靶向树突状细胞。实例包括得自多种细菌的二酰基脂蛋白和脂质基团。
[0091]可以用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的毒素载体的实例包括志贺毒素、本文所述的志贺样毒素、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)毒素、白喉毒素、腺苷酸环化酶毒素、霍乱毒素、假单胞菌外毒素等。此外，还可以使用这些毒素的非毒性亚单元，其不具有任何毒性亚单元。使至少一种抗原与这些毒素结合的方法可以通过共价偶联形成融合蛋白质，或者通过静电或疏水性相互作用或离子相互作用。
[0092]本发明的另一个方面提供了一种组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0093]志贺毒素的B亚单元的序列在Strockbine等人.，J.Bacteriol, 170, 1116-22(1988)中有所描述。免疫功能等价物为这样的物质，其中毒素可以与Gb3受体结合，和/或引起抗原的内化并将其呈递给I类MHC途径、以及I类和II类MHC途径两者。因此，由E.coli得到的志贺样毒素(例如志贺样毒素1、志贺样毒素2以及志贺样毒素2变体，例如志贺样毒素2c、志贺样毒素2dl、志贺样毒素2d2、志贺样毒素2e、志贺样毒素2f以及志贺样毒素2y)的B亚单元均可以被认为是免疫功能等价物。在一个实施方案中，在本发明的组合物的配制物中，可以使用由大肠杆菌得到的维罗毒素-1(verotoxin-1)、维罗毒素2、维罗毒素2c或维罗毒素2v的B亚单元来替代志贺毒素的B亚单元。应该注意维罗毒素-1为志贺样毒素1的替换名称，而维罗毒素-2为志贺样毒素2的替换名称。
[0094]志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物缺乏毒素活性，因此对哺乳动物而言不具有毒性。缺乏毒性不会影响志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物与Gb3受体结合，或者进入I类MHC、或者I或II类MHC途径。
[0095]可以通过本领域已知的方法来评价与Gb3受体的结合,例如Tarrago-Trani在Protein Extraction and Purification, 39:ppl70-176 (2004)或 Nishikawa 等人在 ChemPharm Bull April54 (4):pp.522-7 (2006)所描述的那些，所述的文献以引用方式并入本文。
[0096]在一个实施方案中，志贺毒素的B亚单元具有以下序列:
[0097]COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVEYTKYND DDTFTVKVGDKELFTNRffNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHN GGGFSEVIFRC-NH2 (SEQ ID NO:4)。
[0098]然后，志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物与至少一种抗原结合。
[0099]在另一个方面中，志贺毒素的B亚单元或所述的其免疫功能等价物通过化学偶联以半胱氨酸基团或Z (n) -Cys基团与所述的至少一种抗原结合，其中Z为缺乏巯基基团的氨基酸并且η为O、I或为多肽。
[0100]可以用于本文所述的组合物、用途和方法的至少一种抗原包括恒温动物的癌症抗原、感染性疾病抗原(例如细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原或寄生虫抗原)、过敏抗原、自身免疫抗原以及这些抗原的混合物。
[0101]用于癌症的抗原可以为得自睾丸癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌、食管癌、胃癌、肾癌、恶性肉瘤、成神经细胞瘤、霍奇金或非霍奇金淋巴瘤以及白血病。 [0102]用于癌症的免疫治疗性疗法的癌症抗原例如有用于治疗黑素瘤的MAGE AU MAGEA3或其他MAGE抗原；在多种类型的肿瘤(例如黑素瘤、肺癌恶性肉瘤和膀胱癌)中表达的抗原例如有PRAME、BAGE或GAGE，前列腺特异性抗原(PSA)，HER-2/neu，KSA, PAP乳腺球蛋白，MUC-1, CEA, WTl, LMP2, HPBV Ε6, Ε7, EGFRvlll，特异型，p53 非突变体，NY-ES0-1,NY-ES0-2, NY-ES0-3, NY-ESO-4, NY-ES0-5, NY-ES0-6, NY-ES0-7, NY-ES0-8, PSMA,⑶2,MeIanA/MARTI, Ras突变体,gplOO,p53突变体,蛋白酶3 (PRl),bcr-abl,酪氨酸酶,存活素，nTERT，恶性肉瘤易位断裂点，EphA2, ML-1AP, AFP, EpCAM, ERG (TMPRSS2ETS 融合)，NA 17mPAX3, ALK，雄性激素受体，Cyclin BI，多聚唾液酸，MTCN, RhoC, TRP-2，GD3, Fucosyl GMl,间皮素，PSCA, sLe(a)，CYPlBl, PLAClmGM3, BORISm Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5,SART3，STn，碳酸酐酶 IX，精液蛋白 17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGEl，B7H3m Legumain,Tie2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-β.MAD-CT_2Fos-相关抗原 1，其中的一些抗原在 Cheever 等人〃The Prioritization of Cancer Antigens:A National InstitutePilot Project for the Acceleration of Translational Research, "Clinical CancerResearch, 15，pgs，532305337 (2009年8月31日)中有所描述。在一个实施方案中，HER-2/neu用作至少一种抗原。此外，还可以使用这些癌症抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0103]用于细菌感染的抗原可以为得自大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、细菌性脑膜炎、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniaea)、白喉、肺炎链球菌(Streptoccoccus pneumoniaea)、金黄色葡萄球菌(Streptoccoccusaureus)> 链球菌属(Streptoccoccus)细菌、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、流感嗜血杆菌血清型B (Haemophilus influenza Serotype B)、军团杆菌病、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、百日咳、猩红热、中毒性休克综合征、颗粒性结膜炎、泌尿道感染、炭疽、肉毒中毒、霍乱、斑疹伤寒、淋病、脓疱病、麻风病、细螺旋体病、莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、诺卡氏菌病(nocardosis)、百日咳、痕疫、肺炎球菌肺炎(Pneumococcalpneumonia)、鹦鹉热、Q热、落基山斑疹热、志贺氏菌病、破伤风、肺结核、野兔病、伤寒以及它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些细菌抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0104]病毒抗原可以为得自AIDS (例如gag、tat nef、包膜(例如其gpl20或gpl60片段))、水痘、感冒病毒、巨细胞病毒、科罗拉多壁虱热、登革热、埃博拉出血热、手足口病、轮状病毒、冠状病毒、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、人乳头状瘤病毒、流感、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性白质脑病、狂犬病、风疹、SARS、天花病毒、病毒性脑炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病、甲型流感病毒、EB病毒、呼吸道合胞体病毒、成人型T细胞白血病病毒、甲型肝炎病毒、痘病毒、黄热病和它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些细菌抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0105]可以用于本发明的真菌抗原包括得自变应性支气管肺曲菌病、肺曲菌球病、足癣、蛙粪霉病、黑色毛结节菌病、芽生菌病、念珠菌病、壶菌病、球孢子菌病、耳霉病、坚黑穗病、隐球菌病、加蒂隐球菌(cryptococcus gatti)、皮肤癣菌病、双相型真菌、毛内癣菌、昆虫病原真菌、流行性淋巴管炎、食管炎念珠菌病、exothrix、真菌血症、组织胞浆菌病、massospora cicadina、霉菌病、毛孢子菌病、肺孢子菌肺炎、sirococcusclavigignent1-juglandacearum、抱子丝菌病、thousand cankers 病、癖、须癖、头癖、体癖、tinea crusis、面癣、伪装癣、掌黑癣、花斑癣、鹅口疮、白鼻子综合征以及它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些真菌抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0106]可以用于治疗寄生虫或原生动物感染性疾病的抗原包括得自非洲椎虫病、阿米巴病、蛔虫病、巴贝西虫病、balatidiasis、查格斯氏病、肝吸虫病、球虫病、隐孢子虫病、囊虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、多房棘球蝴病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自生生活阿米巴虫感染、贾弟虫病、颌口虫病、蠕虫、六鞭虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、蟠尾丝虫病、头虱病、plasmonium、疥癣、血吸虫病、绦虫病、蛔虫病、弓形体病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病、锥虫病以及它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些寄生虫或原生动物抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0107]可以用于治疗过敏的抗原包括得自吸烟过敏、化学品过敏、织物过敏、蟑螂过敏、尘螨过敏、食物过敏、胃肠道过敏、草花粉过敏、花粉热、房尘螨过敏、昆虫叮咬过敏、乳胶过敏、霉菌过敏、宠物过敏、花粉过敏、豚草属过敏(ragweed allergies)、树木花粉过敏以及它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些过敏抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0108]可以用于治疗自身免疫疾病的抗原包括得自achlorhydra自身免疫活跃慢性肝炎、Addison病、斑秀、肌萎缩侧索硬化、强直性脊柱炎(akylosing spondylitis)、抗-GBM肾炎或抗-TBM肾炎、抗磷脂综合征、再生障碍性贫血、关节炎、哮喘、特应性变态反应、特应性皮炎、自身免疫学溶血性贫血、自身免疫学肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、淋巴细胞增生综合征伴自身免疫(ALPS)、巴娄病、贝赫切特病、伯杰氏病、大疱性类疱疮、心肌病、伯杰氏、慢性疲劳免疫综合征、Churg-Strauss综合征、疤痕性类天疱疮、科干综合征、冷凝集素病、结肠炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病、库兴氏综合征、Dego病、皮炎、皮肌炎、Devic病、I型糖尿病、2型糖尿病、德雷斯勒综合征、盘状红斑狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic facsiitis)、获得性大疱性表皮松解症、埃文氏综合征、纤维肌痛症、纤维性肺泡炎、胃炎、巨细胞动脉炎、血管球性肾炎、古德帕斯丘病、格雷夫斯病、巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜、肝炎、Hughes综合征、特发性肾上腺萎缩、特发性肺间质纤维化、特发性血小板减少性紫癜、炎性脱髓鞘性多发性神经病、肠易激综合征、川崎病、扁平苔藓、Lou Gehrig病、狼疮样肝炎、狼疮、莱姆病、美尼尔氏病、混合结缔组织病、多发性骨髓瘤、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、眼部瘢痕性类天庖疮、骨质疏松、睫状体平展部炎、寻常型天疱疮、自身免疫性多腺体综合征、风湿性多肌痛(PMR)、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、雷诺现象、莱特氏综合征、风湿热、风湿性关节炎、结节病、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、粘血综合征(sticky blood syndrome)、斯提耳氏病、Stiff Man综合征、Sydenham舞蹈病、系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、白癜风、韦格纳肉芽肿、Wilson综合征以及它们的混合的抗原。此外，还可以使用这些自身免疫抗原的片段，只要它们刺激抗体的生产即可。
[0109]在本发明的组合物和/或方法中使用的至少一种抗原的量取决于所使用的抗原，因此随着各种不同的配方而改变。但是，至少一种抗原应该在不会产生不利的副作用的条件下至少诱导免疫保护性应答。通常，组合物所包含的每一种抗原为0.1至1000g。在另一个方面中，组合物所包含的每一种抗原为0.1至500g。在另一个方面中，组合物所包含的每一种抗原为0.1至100g。此外，在另一个方面中，0.1至50g的每一种抗原都可以用于组合物中。
[0110]所述的组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具，靶向树突状细胞的载体(例如脂质体、微米粒子或纳米粒子)，靶向树突状细胞的毒素载体，或者靶向树突状细胞的单克隆或多克隆抗体，其中所述的工具、载体、毒素载体或抗体通过共价结合、作为融合蛋白质、通过静电或疏水性相互作用、或者离子相互作用而与至少一种抗原结合。如果脂质体、微米粒子或纳米粒子用作载体，则至少一种抗原可以络合在这些载体的外部或者通过包封而在内部中形成。当至少一种抗原络合在脂质体、微米粒子或纳米粒子的外部时，可以使用本文所述的连接体。不同抗原的混合物可以与本文所述的不同载体结合。
[0111]此外，在一个方面中，组合物所包含的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物与至少一种抗原的结合还可以通过共价结合、作为融合蛋白质、通过静电或疏水性相互作用、或者离子相互作用来形成。这种结合可以在志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物上直接形成，或者其可以通过本文所述的连接体、半胱氨酸基团或Z (n) -Cys基团结合，其中Z为缺乏巯基基团的氨基酸并且η为0、1或为多肽。
[0112]就共价结合而言，可以使用至少一种抗原偶联试剂，例如溴化氰、氰脲酰氯、2，2- 二氯对二氨基联苯P, P’ - 二氟-m, m’ - 二硝基二苯砜或2，4- 二氯硝基苯。在实施方案中，使用溴化氰来共价连接至少一种`抗原。
[0113]在Haicheur 等人 Journal of Immunologyl65pgs3301-3308 (2000)(该文献以引用方式并入本文)中所述的融合蛋白质还是键的来源，并且可以用于使抗原与毒素载体、志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物偶联。
[0114]非共价结合包括离子相互作用、疏水性相互作用以及通过氢键结合。因此，对于离子相互作用而言，公知的是天冬氨酸和谷氨酸上的负电荷羧基可以被赖氨酸和精氨酸残基上的正电荷游离氨基所吸引。
[0115]一旦至少一种抗原与用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体结合，它们便与佐剂粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)混合，并施用需要这种治疗的恒温动物。GM-CSF的施用量范围为2至50g。在一个实施方案中，施用20g用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者与抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物，在另一个实施方案中，施用IOg所述的物质。
[0116]在本发明的一个方面中，用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物通常在第O天时与佐剂GM-CSF —起施用，并且可以在第I天时施用CpG寡脱氧核苷酸或CpC-样寡脱氧核苷酸。
[0117]在另一个方面中，用于使至少一种结合的抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物可以与佐剂GM-CSF以及CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸在同一天同时施用，在同一天或非同一天依次施用，或者在同一天或非同一天分开施用。
[0118]任何CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸都可以作为第二佐剂。例如，具有以下特征的A类寡脱氧核苷酸，其在5’末端或3’末端或两者具有poly G序列、内部回文序列、部分硫代磷酸化改性的骨架以及具有内部回文序列的GC 二核苷酸。A类寡脱氧核苷酸的实例在 Krug 等人 European Journal of Immunology、31 (7) pgs.2154-63 (2001)中描述为2216。B类CpG寡脱氧核苷酸的特征在于具有一个或多个6mer CpG基元(5’Pu Py CG Py Pu-3’)，长度通常为18至28个核苷酸，并且具有全部的硫代硫酸化改性的骨架。寡脱氧核苷酸2007落入B类，并由Krieg等人Nature374 (6522) Pgs、546_9 (1995)描述。
[0119]可以用作CpG佐剂的其他CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸包括Liu等人 Blood, 923730-3736 ( 1998)所述的编号 1758 和 1826，Deng 等人 The Journal ofImmunology, 1674616-4626 (2001)所述的编号 1668、1720m2006 和 2041，Speiser 等人 TheJournal of Clinical Investigation volumell5, No, 3, pgs, 739-746 (2005)所述的编号7909，以及 Guzylack-Piriou 所述的编号 2216、D32 和 D19。
[0120]在一个实施方案中，CpG寡脱氧核苷酸可以具有序列TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQID NO:5)。
[0121 ] 此外，CpG-样寡脱氧核苷酸也涵盖在本发明的范围内，并且替代CpG寡脱氧核苷酸使用。备选地，CpG-样寡脱氧核苷酸和CpG寡脱氧核苷酸可以作为混合物一起施用。
[0122]在一个方面中，在第I天施用剂量为I至1000g/剂的CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸，另一方面，施用I至500g/剂的CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸。在另一个方面，施用I至100g/剂的CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸。在另一个方面，施用I至50g/剂的CpG寡脱氧核苷酸或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0123]在另一个实施方案中，在第O天，佐剂GM-CSF以及CpG或CpG-样寡脱氧核苷酸作为佐剂一起施用。
[0124]在初始施用的至少14天或更多天，可以向恒温动物施用加强剂量的组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物。该加强剂量不与佐剂一起施用。
[0125]在另一个方面中，在初始施用后的至少14天或更多天，施用加强剂量，该加强剂量包含与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫等价物。该加强剂量不与佐剂一起施用。
[0126]本文所述的组合物可以粘膜或系统施用。如果以系统方式传递，则通常通过经皮、皮下或肌肉内途径。在一个实施方案中，本发明的组合物和佐剂以肌肉内施用。在另一个实施方案中，本发明的组合物被直接注入到肿瘤中。
[0127]在一个方面中，所述的组合物构成了本发明的一部分，其中所述的组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸，以便用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。在一个实施方案中，所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原，并且所述的疾病为乳腺癌。
[0128]所述的组合物构成了本发明的另一个方面，其中所述的组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸，以便用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。在一个实施方案中，所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原，并且所述的疾病为乳腺癌。
[0129]所述的组合物的用·途构成了本发明的另一个方面，其中所述的组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含用于活化细胞毒T淋巴细胞的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸，以便用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。在一个方面中，所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原，并且所述的疾病为乳腺癌。
[0130]所述的组合物的用途构成了本发明的另一个方面，所述的组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸，其用于活化细胞毒T淋巴细胞和/或用于治疗疾病，特别是用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病。在一个方面中，所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原，并且所述的疾病为乳腺癌。
[0131]所述的组合物在制造用于治疗恒温动物的癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病的药剂的用途为本发明的另一个方面，其中所述的组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0132]所述的组合物在制造用于治疗恒温动物的癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病的药剂的用途为本发明的另一个方面，其中所述的组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0133]此外，本发明用于制造治疗乳腺癌的药剂的组合物的用途，其中所述的组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。在一个实施方案中，所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原。
[0134]用于制造治疗乳腺癌的药剂的组合物的用途为本发明的另一个实施方案，其中所述的组合物包含靶向树突状细胞并与HER-2/neu抗原组合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0135]就组合物而言，免疫功能等价物如上文所述，而对于该组合物的用途而言，所述的等价物适用于本文所述。它们包括可以与Gb3受体结合，和/或引起抗原内化并将其呈递给MHC I类途径、或者MHC I类和II类途径两者的任何毒素。因此，由大肠杆菌得到的志贺-样毒素的B亚单元(例如志贺-样毒素1、志贺-样毒素2以及志贺-样毒素2变体，例如志贺-样毒素2c、志贺-样 毒素2dl、志贺-样毒素2d2、志贺-样毒素2e、志贺-样毒素2f以及志贺-样毒素2y)都可以被认为是免疫功能等价物。在实施方案中，在本发明的组合物的配制物中，由大肠杆菌得到的维罗毒素-1、维罗毒素_2、维罗毒素2c或维罗毒素2v的B亚单元可以替代志贺毒素的B亚单元使用。
[0136]靶向树突状细胞的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物与上文关于组合物所列相同的方式结合；即，通过共价结合，通过静电或疏水性相互作用，或者作为融合蛋白质。
[0137]在本发明的用途方面，可以使用上文针对组合物所列的相同的抗原，例如癌症抗原和HER-2/neu抗原。
[0138]相似地，在本发明的用途方面，可以使用上文在组合物中所列的相同的CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0139]用于活化细胞毒T淋巴细胞的方法为本发明的另一个方面，其中所述的方法包括向需要这种活化的恒温动物施用组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0140]用于活化细胞毒T淋巴细胞的方法为本发明的另一个方面，其中所述的方法包括向需要这种活化的恒温动物施用组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0141]治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和自身免疫疾病的方法为本发明的另一个方面，其中所述的方法包括向需要这种治疗的恒温动物施用组合物，该组合物包含用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0142]在另一个方面中，提供了治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物感染引起的感染性疾病，过敏和自身免疫疾病的方法，该方法包括向需要这种治疗的恒温动物施用组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0143]提供一种治疗乳腺癌的方法，该方法包括向需要这种治疗的恒温动物施用组合物，该组合物包含用于使HER2/neu抗原靶向树突状细胞的工具、或靶向树突状细胞并与HER2/neu抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或祀向树突状细胞并与HER2/neu抗原结合的毒素载体、或者靶向树突状细胞并与HER2/neu抗原结合的单克隆或多克隆抗体，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0144]一种用于治疗乳腺癌的方法，该方法包括向需要这种治疗的哺乳动物施用组合物，该组合物包含靶向树突状细胞并与`HER-2/neu抗原组合的志贺毒素的B亚单元或免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0145]用于接种的试剂盒为本发明的另一个方面，其中所述的试剂盒包含至少一种本文所述的本发明的组合物，佐剂以及至少一种可药用的赋形剂，其中所述的佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
[0146]可药用的赋形剂包括无菌水、盐水或缓冲溶液。
[0147]本文所述的用于接种的疫苗或试剂盒适用于向恒温动物同时、依次或分开施用。
[0148]用于同时、依次或分开施用的包含组合物的产物的组合(也称为多部件试剂盒)为本发明的另一个方面，其中所述的组合物包含用于靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的工具、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的载体(例如脂质体、微米粒子和纳米粒子)、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的毒素载体、或靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的单克隆或多克隆抗体、或者靶向树突状细胞并与至少一种抗原结合的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物，以及佐剂，该佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。[0149]已经描述了本发明的多个实施方案和/或方面。但是，将会理解的是在不脱离本发明的实质和范围的条件下可以进行多种修改。
实施例
[0150]实施例1-志贺毒素的B亚单元与抗原的偶联
[0151]IA-志贺毒素的B亚单元与MAGE的重组偶联
[0152]用于将志贺毒素的B亚单元(STxB)与MAGE抗原偶联的方法在美国专利6，613，882中有所描述，该文献以引用方式并入本文。
[0153]更具体而言，使用的质粒为Su等人Infect Immun, 60，pgs.33-45 (1992)所述的PSU108 质粒。
[0154]使用的PCR引物为:
[0155]5’-CTAGCTCTGAAAAGGATGAACTTTGAGAATTCTGACTC AGAATAGCTC-3’ (SEQ ID N0.6)
[0156]5’-CTTTTCAGAGCTAGTAGAATTAGGATGATAGCGGCCG CTACGAAAAATAACTTCGC-3’ (SEQ IDNO:7)
[0157]使用的引物为得自ShigaAtpE(5’)载体的特异性引物，并具有以下序列:
[0158]引物ShigaAtpE: 5，-CACTACTACGTTTTAAC-3" (SEQ ID NO: 8)
[0159]引物Shiga-fd:5，-CGGCGCAACTATCGG-3，(SEQ ID NO:9)·[0160]这些引物生产出在SU108质粒的限制性位点SphI和SalI克隆的片段。
[0161]包含糖基化位点和KDEL序列的接头片段在16°C下过夜连接，所述KDEL序列由硫酸化寡核苷酸 I ( (5，-磷酸化;5，-GGCCGCCATCCTAATTCTACTTCT-3’) (SEQ ID NO: 10)以及硫酸化 2 (5，-CTCAGAAGTAGAATTAGGATGGC-3’) (SEQ ID NO: 11)(或硫酸化 3 (5，-GAGTCTGAAAAAGATGAACTTTGATGAG-3) ’ (SEQ ID NO: 12))构成。
[0162]所得的片段在PSU108的NotI和EcoRI限制性位点处克隆，并包含编码B-Glyc-KDEL 的 cDNA。
[0163]此外，使用如上Su等人所述的技术来纯化重组片段。简言之，将包含由PSU108获得的重组表达质粒的大肠杆菌细胞在30°C下过夜培养。然后，在50°C下，将培养物在补充有50mg/ml氨苄青霉素的LB中稀释5倍。在42°C下温育4小时后，使用IOmM Tris/HCl、pH8充分洗涤细胞，在IOmM Tris/HCL, pH8, 25%蔗糖ImM EDTA中温育10分钟，并最终快速悬浮于包含ImM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(亮肽素、糜蛋白酶抑素、胃酶抑素、抗痛素和抗蛋白酶肽)的冰水混合物中。最终的步骤使得细胞周质破裂。在澄清后，将上清液装载到QFF柱(Pharmacia)上，并使用NaCl在20mM Tris/HCl, pH7.5中形成的线性梯度溶液进行洗脱。根据结构，B片段在120mM至400mM之间被洗脱。接着，将包含B片段的级份对20mMTris/HCL, pH7.5进行透析,并再次装载到monoQ柱(Pharmacia)上,并按照之前相同的方式洗脱。所得的蛋白质使用聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳估计纯度为95%，然后储存在-80°C下，直到使用。
[0164]IB-志贺毒素的B亚单元的化学偶联
[0165]根据美国专利7，632，514首先制备表达STxB的质粒，该文献以引用方式并入本文。更具体而言，使用SEQ ID N0:10和SEQ ID NO: 11，对如上Su等人所述的质粒pSU108进行修饰，从而在B-片段cDNA的3’末端引入半胱氨酸密码子tgt，其中SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11与质粒特异性引物ShigaAtpE和Shiga-fd以及引物A和B —起使用，由此生产DNA片段，该DNA片段在第二次PCR中使用Shiga AtpE和Shiga-fd产生了多个片段，这些片段被克隆到PSU108的SphI和SalI限制性位点中。由PCR衍生的序列通过双脱氧法测序来证实。
[0166]引物A:
[0167]5’-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC-3’ (SEQ ID NO:13)
[0168]引物B: [0169]5’-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3’ (SEQ ID NO:14)
[0170]通过接种125ml LB/Amp以及125 μ I在30°C下过夜生长的培养物，以及在30°C下进一步过夜生长来获得细胞周质提取物。然后，在50°C下，将培养物转移至375ml LB/Amp中，并在42°C下温育4小时。接着离心培养物，使细胞成团，再使用IOmM Tris/HCl、pH8.0将细胞洗涤三(3)次。然后，将细胞再次悬浮于200ml的25%蔗糖、ImMEDTA、IOmM TRIS/HCl，pH8.0中，并在室温下温育10分钟。接着再次将细胞离心从而使细胞成团，并再次悬浮于200ml包含蛋白酶抑制剂的混合物的冰冷的水肿。将再次悬浮的细胞在冰上温育10分钟，离心，然后收集上清液。加入20mM Tris/HCL.PH8.0。
[0171]将细胞周质提取物加载到QFF阴离子交换柱(Pharmacia)上，并在230mM NaCl下洗脱。合并包含StxB的级份,稀释4倍,并加载到Mono Q阴离子交换柱(Pharmacia)上，然后在230mM NaCl下洗脱。在使用得自PallFiltron的微浓缩装置浓缩后，使合并的级份通过Sephadex75凝胶过滤柱。纯度高于95%。
[0172]STxB-Cys的B级份基本为单体。但是，具有一些这样的结构，其中在距B-片段的天然C-末端的2个以上的氨基酸处加入半胱氨酸，其中在五聚体中的相邻片段参与有二硫键。
[0173]制备3种不同的载体，它们如下:
[0174]STxB-Cys,其中Cys被直接加入到B亚单元的C-末端。该蛋白质作为单体由纯化柱上洗脱。
[0175]STxB-Z2-Cys为这样的载体，其在野生型B片段的C-末端与Cys之间的克隆盒之间具有2个氨基酸的短的间隔。大部分的蛋白质作为二聚体由纯化柱上洗脱。这些蛋白质可以在还原条件下分离，表明在五聚体B-亚单元络合物中的单体之间形成了二硫键。
[0176]STxB-Glyc-Cys-KDEL为这样的载体，其中Cys位于9个氨基酸长的糖基化盒与C-末端KDEL肽之间。大部分的蛋白质作为二聚体由纯化柱上洗脱。这些蛋白质可以在还原条件下分离，表明在五聚体B-亚单元络合物中的单体之间形成了二硫键。
[0177]3种抗原肽与STxB偶联，这3种抗原肽为:Pepl，其为由16个氨基酸构成的并携带有由鸡卵清蛋白衍生的SL8抗原肽的合成肽；Pep2，其为由24个氨基酸构成的并携带有由鸡卵清蛋白衍生的SL8抗原肽的合成肽，并且在其C-末端具有His-gag ；以及SL8，其为由卵清蛋白得到的抗原肽，该肽可以在抗原呈递细胞的质膜上与I类MHC络合物上的肽直接交换。
[0178]两种条件用于使抗原肽与STxB偶联:还原条件和非还原条件。在还原条件下，使用DTT对融合蛋白质进行过夜处理，然后加入过量的活化的肽，其在N-末端携带有溴乙酸基团。使用融合蛋白质的第一偶联试验所使用的条件基本上使单体二聚化(蛋白质STxBZ2-Cys和STxB-Glyc-Cys-KDEL)。在非还原条件下，融合蛋白质与其N-末端使用溴乙酸活化的肽直接反应。
[0179]用于偶联的所使用的最佳条件如下:将STxB-Cys对20mM硼酸盐缓冲液，pH9.0，150mM NaCl进行透析。透析后，将STxB-Cys浓缩至lmg/ml。N-末端活化的肽使用修乙酸酐活化。N-末端活化的肽溶解于12mM DMS0。然后，将活化的肽在蛋白质溶液中稀释至
0.2mM,并在室温下温育12小时。然后，将偶联的STxB-活化的肽对PBS透析。
[0180]IC-0va257_264, IBC002 和 HER2/Neu 肽的化学偶联
[0181]1.1-StxB 的合成
[0182]由如上Su等人所述的质粒pSU108,按照上文所述制备STxB,但是在其C-末端不具有Cys。
[0183]1.2_0va257_264 和 HER-2/neu 的合成
[0184]根据Fmoc/tBu 方案，在 100 μ mol Fmoc-Leu-Wang 树脂，IRISBiotech Tentage ；
0.25mmol/g的级别下，由C-末端至N-末端化学合成0va257_264, IBC002 (SEQ ID NO:1)和HER-2/neu。
[0185]在Liberty CEM型的自动化肽合成仪上，使用微波在树脂上进行氨基酸的依次偶 联。
[0186]1.3-在N-末端引入溴乙酰基团
[0187]然后，人工处理所述的肽。
[0188]通过与DMF:哌啶(80:20)的混合物温育5分钟、然后搅拌15分钟来除去Fmoc保护。接着，使用DMF洗涤树脂4次。
[0189]将20当量酸酐形式的溴乙酸与10当量的二异丙基碳二亚胺(DIC)在4ml 二氯甲烷中搅拌20分钟来活化，其中所述的二氯甲烷在使用前在凝胶过滤柱上干燥。在旋转蒸发仪上浓缩之后，将溴乙酸酐溶解于4ml DMF中并加入到树脂中。在搅拌30分钟后，将树脂用DMF洗涤3次，每次2分钟；使用DCM洗涤3次，每次2分钟；最后用醚洗涤2次，然后使用膜真空泵干燥。
[0190]1.4-裂解、脱保护和纯化
[0191]使用包含8ml TFA和400 μ I茴香醚的裂解溶液在搅拌下将2种树脂处理I小时。在沉淀以及在冰上使用醚:庚烷的1:1混合物进行2个洗涤步骤后，在5%乙酸中取得所述的肽，然后注射用于制备型HPLC。
[0192]将包含所述的肽的级份合并、冷冻并冻干。
[0193]2.2种溴乙酰化的肽与STxB/Cys的偶联
[0194]2.1选择用于形成硫醚连接体的条件
[0195]STxB-Cys中存在的半胱氨酸可以特异性地与溴乙酰基官能团反应，其中所述的额溴乙酰基官能团存在于所述的肽上，从而形成共价硫醚连接体。测试以下条件:4μ I STxB/Cys处于5mg/ml PBS中，以及1、2或9当量的肽处于11 μ I的PBS中。在室温下，在搅拌下温育I小时后，通过MALDI质谱分析所述的溶液。在MALDI光谱上，人们观察到所形成的半定量的缀合物。
[0196]在所有条件下，这2种肽的偶联反应是准总量的，清楚的是使用过量的1.5当量实施偶联反应，从而使STxB-Cys达到最大的消耗，而无需在纯化过程中必须出去过多的肽。[0197]2.2 肽与 200 μ g STxB-Cys 的偶联
[0198]使用以下条件:40 μ I STxB处于5mg/ml PBS中，15 μ 12.56mM的肽处于水和95 μ IPBS中。在室温下温育I夜后，用LC/MC显示反应被终止。
[0199]2.32种肽在511^ STxB-Cys 上的偶联
[0200]基于2.2中的结果增大级别:220 μ I STxB处于5mg/ml PBS中，75 μ 12.56mM肽处于水和475 μ I PBS中。这些产物通过凝胶过滤色谱纯化。
[0201]实施例2-在小鼠接种GM-CSF/CpG和STxB-OVA或单独的OVA后，Elispot测定的比较
[0202]在第O天，使用与20 μ g GM-CSF混合的、20 μ g与卵清蛋白(OVA)偶联的志贺毒素的B亚单元(STxB)或单独的OVA免疫每组四(4)只小鼠(n=4，并且3次试验)。第二天，向小鼠施用50pgCpGTCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:5)。在第14天，向各组的每只小鼠仅施用与卵清蛋白(OVA)偶联的(STxB)或单独的0VA，而不含有佐剂。在第21天，取得小鼠的脾细胞，并由脾细胞分离单核细胞。然后，进行Elispot测定。
[0203]更具体而言，按下文实施Elispot测定。将LT-⑶8抗-OVA的包被抗体在无菌PBS中稀释至15yg/ml。每个96-孔Millipore平板加入100 μ I并在4°C下温育过夜。将平板洗涤4次，并使用封闭缓冲剂(具有10%FCS的RPMI)封闭非特异性结合位点。
[0204]在第21天，移除脾，并通过使用Ficoll-hypaque由小鼠得到的脾细胞分离单核细胞。洗涤细胞并计数生存的细胞。以4xl06个细胞/ml的浓度，将细胞再次悬浮于组织培养基(在RPMI中)中。每孔加入100 μ I细胞悬浮液。
[0205]将刺激浓度调整至2χ (1-10 μ g/ml)，并将100 μ I刺激物加入各孔中。将细胞在37°C下在湿度为5%的CO2恒温箱中温育40小时。
`[0206]通过除去孔中的细胞并将它们洗涤6次来进行Elispot。通过在蒸馏水中洗涤2次并在洗涤缓冲剂中洗涤4次来除去细胞。将生物素化的mAb (抗-0VA257_264)在封闭缓冲剂中稀释至I μ g/ml，并向各孔中加入100 μ I。将平板在室温下温育1-2小时。将链霉亲和素结合碱性磷酸酶在封闭缓冲剂中以1:1000稀释，并向各孔中加入100μ I。然后，将平板在室温下温育1-2小时。在洗涤各孔后，加入100μ I底物，并温育平板直到黑斑出现。通过在自来水中洗涤来停止颜色的显现，并干燥平板。
[0207]使用自动化机器计数斑点的数量。
[0208]结果示于图1中。如该图所示，与施用单独的OVA以及佐剂GM-CSF和CpG相比，在施用STxB-OVA以及相同的佐剂时，更多地诱导CTL。
[0209]实施例3-在使用STxB-OVA或单独的OVA(使用各种佐剂)接种后，抗-OVA LT-⑶8诱导的比较分析
[0210]使用与OVA偶联的志贺毒素的B亚单元或单独的OVA (使用各种佐剂)免疫小鼠(η=4 并且 2 次试验)。以如下组合施用 STxB-OVA:20μ g GM-CSF/IFA (IFA 的 vol/vol)、10 μ gGM-CSF/IFA、20 μ gGM-CSF 和 50 μ g CpG、以及 Iyga GalCer。将 OVA 与 20 μ gGMCSF/IFA 和20 μ g GM-CSF/50 μ g CpG—起施用。第二天施用CpG的第二佐剂。在14天后，再次施用不具有佐剂的抗原。在第21天，取得小鼠脾细胞，并通过Ficoll纯化单核细胞。测量识别四聚体Kb-0VA257_264/LT-CD8肽的CTL的百分率。使用Kb-VSV (疱疹性口炎病毒(VascularStomatitis Virus))作为对照，并从所示的百分率中扣除由对照得到的背景噪声。[0211]结果以所获得的平均结果土标准偏差示于图2中。如图2所示，与其他佐剂相比，当小鼠接种GM-CSF/CpG时，发生抗-0VA257_264LT-CD8的强诱导，而单独的0VA257_264具有较少的诱导。
[0212]实施例4-通过四聚体分析显示，联合志贺毒素的B亚单元的GM-CSF与CpG(作为佐剂)之间的协同作用
[0213]使用50 μ g CpG 或 20 μ g GM-CSF、或者 50 μ g CpG 和 20 μ gGM-CSF 的组合，用与Her2/neu肽偶联的20 μ g志贺毒素的B亚单元(STxB_Her2/neu)免疫小鼠(n=4并且2次试验)。在使用与GMCSF的组合的情况下，在施用STxB-HER-2/neu后24小时，施用CpG。在第14天,实施单独的STxB-HER2/neu的二次免疫。在第21天,移除脾细胞,并通过miltenyi柱纯化LT-⑶8。通过血细胞计数来测量识别每个四聚体中HER2/neu HLA-A2限制性肽的CTL的百分率。在各试验中使用不相关的四聚体，从而确保对HER2/neu的反应特异性。从所示的百分率中扣除由不相关的聚合物的得到的背景噪声。
[0214]结果示于图3中。
[0215]实施例5-通过Elispot测定显示，联合志贺毒素的B亚单元的GM-CSF与CpG(作为佐剂)之间的协同作用
[0216]使用与肽IBC002偶联的20g志贺毒素的B亚单元(StxB)两次免疫TgHLA-A2 (Pascolo S.J.J.Exp.Med.1997)小鼠，其中肽 IBC002 的序列为(RRARKIFGSLAFL)(SEQ ID NO:1)。与 HLA-A2 限制的 HER2/neu 肽(KIFGSLAFL) (SEQ ID NO: 2)和侧翼序列(RRAR) (SEQ ID NO: 3)相应，与20 μ g GM-CSF联合有利于加工，或者肽IBC002是非载体化的，或者具有天然的HER2/neu但不限于侧翼序列。第二天,施用50yg的CpG。在第14天，使用抗原进行二次免疫，但不使用佐剂。然后，移除小鼠的脾细胞，并使用Ficoll纯化单核细胞。使用天然HER2/neu肽激活一些纯化的脾细胞。结果在图4中给出。
[0217]图3和4中所示的这些结果证明，当STxB与抗原HER2/neu以及佐剂GM-CSF和CpG—起施用时，可诱导细胞毒T-淋巴细胞(CTL)。这种效果在单独施用HER2/neu肽是未观察到。强烈表明当与抗原偶联的STxB载体一起施用时，GM-CSF与CpG佐剂之间存在协同作用。
[0218]实施例6-呈递给树突状细胞
[0219]根据上述实施例1C的过程使OVA与志贺毒素的B亚单元偶联。OVA基本上通过化学偶联与STxB-Cys连接。首先，使用MBS的异源_双功能连接体(Pierce, Rockford, II)在赖氨酸侧链上，通过氨基基团活化0VA257_264。然后，活化的OVA与STxB-Cys反应，并且反应产物通过凝胶过滤纯化。
[0220]按照Winzler等人J.Exp、Med: 185:317 (1997)所述，将Dl树突状细胞系在IMDM(Sigma)中培养，其中所述的MDM补充有10%热活化的FCS、2mM谷氨酰胺(Sigma)、5mM丙酮酸钠和50 μ M2-巯基乙醇，以及由生产粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的ΝΙΗ-3Τ3得到的30%的条件培养基(Rl培养基)。就Kb而言，Β3Ζ为对0VA257_264肽具有特异性的⑶8+T细胞杂交瘤，其携带有由IL-2启动子通过NF-AT元件驱动的LacZ结构。
[0221]对于OVA-衍生的SLSKb-限制性肽的呈递而言，首先使用抗原对IO5个树突状细胞冲击5小时，洗涤2次，并使用B3Z杂交瘤细胞过夜共培养(2xl05个细胞/孔)。使用0NPG(O-硝基苯基β -D-吡喃半乳糖苷作为底物的比色测定用于检测Β3Ζ裂解物中的β-半乳糖苷酶活性。
[0222]使用与STxB-Cys化学偶联的全长OVA致敏的Dl树突状细胞能够将免疫显性OVA-衍生的SL8肽呈递给Β3Ζ (其为抗-SL8-特异性⑶8-Τ细胞杂交瘤)。低至5ηΜ的STxB-Cys-OVA足以致敏用于SL8呈递的Dl细胞系。相比之下，与单独的OVA温育而未与STxB-Cys温育的那些细胞系不能呈递SL8肽。
[0223]实施例7-接种后诱导的抗-Her2/neu369_377ra8+T细胞具有良好的亲合力
[0224]使用与GM-CSF(20g)混合物的、与RRARKIFGSLAFL肽偶联的志贺毒素的B亚单元(STxB)通过皮下途径免疫HLA-A2转基因小鼠(Pascolo S J Exp Medl997) (n=4只小鼠/组)，其中所述的RRARKIFGSLAFL肽相应于由HLA-A2和侧翼序列(RRAR)(有利于细胞内加工)限定的Her2369_377肽。第二天,施用50yg CpG。在第14天，使用不具有佐剂的疫苗进行二次免疫。然后移除小鼠脾细胞，并通过Miltenyi柱(Miltenyi Biotec SAS.ParisFrance)纯化CD8+T细胞。CD8阴性级份用作抗原呈递细胞，并进行冲击，或者不使用浓度变化的1^2369_377肽，然后与纯化的⑶8+T细胞共温育24小时。根据公司的推荐，通过由Diaclone-Gen-Probe (Besancon.France)得到的 IFNyElispot 测量由特异性 Her2/neu369_377刺激得到的活化的T细胞测量。结果以所得的平均结果土标准偏差示出。
[0225]结果示于图5中，并证明接种后诱导的抗-Her2/neu369_377ra8+T细胞具有良好的亲合力，其中在Elispot测定中，所述的细胞可以使用低至0.01g/ml Her2/neu369_377肽来活化。
[0226]实施例8-1类卵清蛋白衍生的肽(QllL)与DEC205抗体的偶联
[0227]使用2mg DEC205 (DEC2057mg/ml PBS pH7, 4 (Biotem))进行 DEC205 二硫键的部分还原，其中所述的DEC205在PBS-EDTA(IOmM)pH7.4中稀释的最终浓度为2mg/ml，所述的还原通过在37°C下在15mn·的过程中与IOOmM MESNA ( (2-巯基乙磺酸钠盐)(Sigma) 1M、EDTA(IOmM)溶液)温育来进行，从而在DEC205抗体上生成游离的巯基。
[0228]通过在roio脱盐柱上加载还原的抗体来除去MESNA，从而除去MESNA，并立即使用BCA测定来检测蛋白质的含量。
[0229]通过在4°C下使用5摩尔过量的QlIL肽在PBS-EDTA缓冲剂中过夜使QlIL肽(N末端溴乙酸修饰的Q11L(RRAR序列形成0VA257_264的侧翼)肽，冻干形式(Polypeptide))与还原的DEC205抗体偶联。
[0230]然后，通过凝胶过滤纯化DEC205-Q11L缀合物。使用SuperdexG200纯化柱，在PBS缓冲剂平衡的s印hadex G200柱上通过凝胶过滤将缀合物与游离的QllL肽分离。
[0231]然后，使用DEC205、DEC205+MESNA、由G200凝胶过滤得到的bl级份以及由G200凝胶过滤得到的b2级份，在不可还原(-DTT)和可还原(+DTT)的条件下，使DEC205-Q11L缀合物在8%丙烯酰胺凝胶上进行考马斯亮蓝染色。bl和b2级份显示推定的HLc-Qll缀合物(HLc=大约95kDa的DEC205的重链和轻链)。
[0232]此外，使用DEC205、DEC205+MESNA以及由G200凝胶过滤得到的合并的bl和b2级份，在不可还原(-DTT)和可还原(+DTT)的条件下，在8%丙烯酰胺变性凝胶上迁移后进行Western印迹。在可还原(+DTT)的条件下，由于QllL肽与游离巯基偶联，重链稍微移位至大约55kDa。
[0233]在Western印迹中分子量55kDa是指还原条件(+DTT)。在这些条件下,在推定的缀合物的重链和轻链之间存在的剩余的二硫桥由于DTT被裂解。所得的产物为与肽偶联的重链，其表现为稍微移位至大约55kDa大小。总之，95kDa产物(-DTT)成为55kDa产物(+DTT)，在这种分析中，轻链不可见。此外，这些移位在非还原条件下在大约95kDa大小下也是可见的。
[0234]实施例9-GM-CSF与CpG的组合为有效的混合佐剂，从而增加疫苗的抗原_特异性CD8+T细胞所被赋予的靶向树突状细胞的能力
[0235]QllL OVA衍生的肽(具有RRAR氨基酸作为侧翼的0VA257_264)与由ATCC得到的抗-DEC205mAb 偶联。
[0236]使用单独的抗-DEC205-0VA257_264( 20l.! g)或者与 GM_CSF(20l.! g)结合的抗-DEC205-0VA257_264免疫小鼠(n=4只/组)。第二天，施用50 μ g CpG。在第11天，使用不具有佐剂的疫苗进行二次免疫。然后在第17天移除小鼠脾细胞,并通过Miltenyi柱(Miltenyi Biotec SAS.Paris France)纯化 CD8+T 细胞。测量识别四聚体 Kb_0VA257_264/LT-⑶8肽的CTL的百分率。使用Kb-VSV (疱疹性口炎病毒)作为对照，并由所示的百分率推断由对照得到的背景噪声。
[0237]结果以所得的平均结果土标准偏差示于图6A (使用单独的抗-DEC205-0VA257_264或者与GM-CSF和CpG混合的抗-DEC205-0VA257_264免疫的小鼠诱导的CTL的图示)和B中。
[0238]如图6B所示，与使用单独的抗-DEC205-0VA257_264接种的小鼠相比，当使用抗-DEC205-0VA257_264加GM-CSF/CpG接种小鼠时，发生了对抗-0VA257_264LT_CD8的显著更高的诱导。这些结果证明，GM-CSF与CpG的组合为有效的混合佐剂，从而增加疫苗的抗原-特异性CD8+T细胞所被赋予的靶向 树突状细胞的能力。
[0239]尽管根据多个优选的实施方案描述的本发明，但是技术人员应该理解的是在不脱离本发明的范围的条件下，可以进行多种修改、替代、删除和改变。因此，意图是本发明的范围由权利要求书(包括其等价物)的范围来限定。
【权利要求】
1.一种组合物，优选为药物组合物，其包含:用于使至少一种抗原靶向树突状细胞的工具，所述的至少一种抗原与所述的用于靶向的工具结合；以及佐剂，其包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及CpG寡脱氧核苷酸和/或CpG-样寡脱氧核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述的用于靶向的工具为靶向树突状细胞的载体，所述的载体为与抗体络合的脂质体、与抗体络合的微米粒子、与抗体络合的纳米粒子、毒素载体、或者单克隆或多克隆抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述的至少一种抗原通过共价键合、通过静电相互作用、疏水性相互作用、融合蛋白质或嵌合蛋白质与所述的用于靶向树突状细胞的工具或者与所述的祀向树突状细胞的载体结合。
4.根据权利要求1至3的任意一项所述的组合物，其中所述的至少一种抗原为得自癌症的抗原、得自感染性疾病的抗原、过敏抗原、 自身免疫抗原或者它们的混合物，其中所述的得自感染性疾病的抗原例如为细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、寄生虫抗原或原生动物抗原。
5.根据权利要求1至4的任意一项所述的组合物，其中所述的至少一种抗原为HER-2/neu抗原。
6.根据权利要求1至5的任意一项所述的组合物，其中所述的CpG寡脱氧核苷酸具有序列 TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:5)。
7.根据权利要求1至6的任意一项所述的组合物，其中用于使所述的至少一种抗原靶向树突状细胞的所述的工具为毒素载体，其为志贺毒素的B亚单元，例如SEQ ID No:4的志贺毒素的B亚单元，或其免疫功能等价物，所述的免疫功能等价物优选为志贺样毒素1、志贺样毒素2、志贺样毒素2c、志贺样毒素2dl、志贺样毒素2d2、志贺样毒素2e、志贺样毒素2f、志贺样毒素2y、维罗毒素-1、维罗毒素-2、维罗毒素2c或维罗毒素2v。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述的志贺毒素的B亚单元或其免疫功能等价物通过化学偶联以半胱氨酸基团或Z (n) -Cys基团与所述的至少一种抗原结合，其中Z为缺乏巯基基团的氨基酸并且η为0、1或为多肽。
9.根据权利要求1至6的任意一项所述的组合物，其中用于使所述的至少一种抗原靶向树突状细胞的所述的工具为抗-DEC205抗体，优选为⑶205、NLDC-145、保留了它们靶向树突状细胞的能力的其片段、以及它们的混合物。
10.根据权利要求1至9的任意一项所述的组合物，其中所述的至少一种抗原为与所述的相同的或不同的工具或载体结合的不同抗原的混合物。
11.根据上述权利要求的任意一项所述的组合物作为药品，优选作为疫苗。
12.根据权利要求1至10的任意一项所述的组合物用于治疗癌症，由细菌、病毒、真菌、寄生虫或原生动物引起的感染性疾病，过敏和/或自身免疫疾病的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，用于治疗乳腺癌。
14.一种用于接种的试剂盒，其包含权利要求1至10的任意一项所述的组合物以及可药用的赋形剂。
15.根据权利要求1至10的任意一项所述的组合物，其为适用于同时、依次或分开向恒温动物施用的疫苗或根据权利要求14的用于接种的试剂盒。
【文档编号】A61K39/00GK103796674SQ201280036278
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月23日 优先权日:2011年7月22日
【发明者】E·塔投尔, L·乔哈尼斯 申请人:居里研究所, 国家科研中心, 国家健康与医学研究院, 公共救济事业局-巴黎医院, 笛卡尔巴黎大学