哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法及其用途
【专利摘要】本发明公开一种哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法及其用途，制备方法包括以下步骤：将新鲜离体骨髓细胞加入生理盐水，浓度为108～109细胞/ml；然后反复冻融将骨髓细胞裂解；然后经高速离心使细胞膜和细胞内液分离，然后提取表面上清液，过滤至无菌，所得滤液即为哺乳动物骨髓细胞内液；所述新鲜离体骨髓细胞来自哺乳动物。目前肿瘤的治疗有药物治疗、手术治疗和放射治疗，药物治疗又包括了化学药物治疗、生物治疗以及基因治疗，但都不能达到满意的治疗效果，特别应该提到的化疗是主要治疗方法，但对人体的杀伤作用特别大，往往肿瘤没被抑制住，人却没了。而本发明制备的哺乳动物骨髓细胞内液对机体无毒副作用，且有明显的肿瘤抑制作用。
【专利说明】晡乳动物骨髓细胞内液的制备方法及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床医学【技术领域】，特别涉及一种哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002]当细胞发生基因突变后，细胞会出现异常增殖且不受机体免疫系统控制，最终导致细胞的恶变，形成恶性肿瘤。恶性肿瘤能侵犯、破坏邻近的组织和器官，癌细胞能够快速繁殖和扩散，它是目前威胁人类生命健康的最主要疾病之一，是医学界急待攻克的最重要的研究课题，随着医疗技术和生活水平的提高，人们对生存质量越来越重视，肿瘤临床治疗急待有一种针对性强、安全，毒副作用小的治疗方法。肿瘤的治疗有药物治疗、手术治疗和放射治疗，药物治疗又包括了化学药物化疗、生物治疗以及基因治疗，目前有很多药物可以杀死肿瘤细胞，但都缺乏特异性，毒性大，且不能治愈肿瘤。随着医学理论及临床实践的不断进展，特别是肿瘤分子生物学的飞速发展，恶性肿瘤的药物治疗已不再拘泥于普通的化学治疗药物。目前许多研究人员转向对细胞生物治疗的研究，有研究报告蛋白酪氨酸激酶功能的失调会引发生物体内的一系列疾病，超过50%的原癌基因和癌基因广物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生。也有人认为糖蛋白的减少会导致细胞信号传达障碍，也可以导致肿瘤发生，因此有很多利用海洋动物多糖蛋白抑制肿瘤生长的相关报道。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法及其用途，本发明所制备的哺乳动物骨髓细胞内液具有抑制恶性肿瘤的效果。
[0004]为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案:
[0005]哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将新鲜离体骨髓细胞加入生理盐水，浓度为IO8~IO9细胞/ml ;然后反复冻融将骨髓细胞裂解；然后经高速离心使细胞膜和细胞内液分离，然后提取上清液，过滤至无菌，所得滤液即为哺乳动物骨髓细胞内液；所述新鲜离体骨髓细胞来自哺乳动物。
[0006]本发明进一步的改进在于:所述新鲜离体骨髓细胞来自新鲜离体下肢骨；所述新鲜离体下肢骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，获取所述新鲜离体骨髓细胞；所述新鲜离体下肢骨来自3-6个月大的哺乳动物。
[0007]本发明进一步的改进在于:反复冻融的次数为4-6次。
[0008]本发明进一步的改进在于:所述高速离心为10000-14000cpm离心20-40分钟。
[0009]本发明进一步的改进在于:过滤至无菌具体为将上清液经2um滤网过滤达到无菌。
[0010]本发明进一步的改进在于:所述哺乳动物为狗、猪、羊或者兔。
[0011]哺乳动物骨髓细胞内液在制备用于抑制和/治疗肿瘤的药物中的应用。[0012]本发明进一步的改进在于:所述肿瘤为黑色素细胞瘤或肝癌。
[0013]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
[0014]目前肿瘤的治疗有药物治疗、手术治疗和放射治疗，药物治疗又包括了化学药物治疗、生物治疗以及基因治疗，但都不能达到满意的治疗效果，特别应该提到的化疗是主要治疗方法，但对人体的杀伤作用特别大，往往肿瘤没被抑制住，人已经没了。而本发明制备的哺乳动物骨髓细胞内液对机体无毒副作用，且有明显的肿瘤抑制作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为体外培养对比图；
[0016]图2为体内试验对比图。
[0017]图3为哺乳动物骨髓细胞内液抑制肿瘤细胞生长的对比图。
[0018]图4为注入哺乳动物骨髓细胞内液对小鼠生存率的影响对比图。
【具体实施方式】
[0019]本发明一种哺乳动物骨髓细胞内液(以下称为的制备方法，包括以下步骤:
[0020]将新鲜离体下肢骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，取出骨髓细胞，加入生理盐水IO8~IO9细胞/ml ;然后反复冻融4-6次将骨髓细胞裂解；然后经10000-14000cpm高速离心20-40分钟后使细胞膜和细胞内液分离，提取表面上清液(即细胞内液)；上清液经2um滤网过滤达到无菌，所得滤液即为哺乳动物骨髓细胞内液(life-1)。新鲜离体下肢骨来自
3-6个月大的哺乳动物。本发明所制备的哺乳动物骨髓细胞内液对肿瘤抑制非常明显，并且无毒副作用，可以被临床用来治疗肿瘤。
[0021]实施例1
[0022]本发明Iife-1的制备方法，包括以下步骤:将新鲜离体股骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，取出骨髓细胞，加入生理盐水IO8细胞/ml，放入冰箱中冻藏，数小时或更长时间后取出，这样反复冻融4次将骨髓细胞裂解，经lOOOOcpm高速离心20分钟后，提取表面上清液，上清液经2um滤网过滤达到无菌，所得滤液即为life-Ι。上述新鲜离体股骨来自3个月大的狗。
[0023]实施例2
[0024]本发明Iife-1的制备方法，包括以下步骤:将新鲜离体股骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，取出骨髓细胞，加入生理盐水IO9细胞/ml，放入冰箱中冻藏，数小时或更长时间后取出，这样反复冻融6次将骨髓细胞裂解，经12000cpm高速离心40分钟后，提取表面上清液，上清液经2um滤网过滤达到无菌，所得滤液即为life-Ι。上述新鲜离体股骨来自6个月大的狗。
[0025]实施例3
[0026]本发明life-Ι的制备方法，包括以下步骤:将新鲜离体胫骨/腓骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，取出骨髓细胞，加入生理盐水IO8细胞/ml，放入冰箱中冻藏，数小时或更长时间后取出，这样反复冻融6次将骨髓细胞裂解，经HOOOcpm高速离心30分钟后，提取表面上清液，上清液经2um滤网过滤达到无菌，所得滤液即为life-Ι。上述新鲜离体胫骨/腓骨来自4个月大的狗。
[0027]实施例4-6:将实施例1-3中的哺乳动物狗替换成哺乳动物猪。
[0028]实施例7-9:将实施例1-3中的哺乳动物狗替换成哺乳动物羊。
[0029]实施例10-12:将实施例1-3中的哺乳动物狗替换成哺乳动物兔。
[0030]本发明制备方法中，除了使用实施例中的四种哺乳动物外，其它哺乳动物同样适用。
[0031]本发明life-Ι的制备方法，可以从所有哺乳动物的骨髓细胞中提取出用于抑制恶性肿瘤的哺乳动物骨髓细胞内液；优选3-6个月的哺乳动物的新鲜离体骨髓细胞，其中脂肪细胞含量少，有利于所获得的复合酶达到有效的浓度。
[0032]体外培养:进行两组对比试验:第一组(图1中B16cell)，单独在3ml DMEM培养液中加入IO5黑色素细胞瘤(B16F1)细胞，然后在CO2培养箱中培养1，3，6天；第二组(图1中B16+Life-1)，将实施例1所获得的life-1 (IOOul，5ug)放入6孔板DMEM培养液3ml，加入IO5黑色素细胞瘤(B16F1)细胞，然后在CO2培养箱中培养1，3，6天。每个时间段在显微镜下观察，并拍片，可以发现和单独肿瘤细胞培养组的相比，life-Ι培养组的细胞数目减少，生长缓慢，明显受到抑制，见图1所示。用同样的方法检测了人肝癌细胞，发现肝癌细胞明显受到抑制未在图中显示。
[0033]体内试验:将体外培养6天后第一组和第二组中的肿瘤细胞分别以5x10s植入两组C57BL/6小鼠(6-8周龄)皮下，发现加入LIFE-1 (B16+life_l)培养后的肿瘤负荷明显减小(图2)。
[0034]如图3所示，进行三组对 比试验:1(图3中B16)、将黑色素细胞瘤(B16F1)以5xl05植入小鼠皮下；2 (图3中B16+life-l (IOOul))、将黑色素细胞瘤(B16F1)以5x10s植入小鼠皮下，再经小鼠皮下注入 IOOul (5ug) life-Ι ；3 (图 3 中 B16+life_l (100+100ul))、将黑色素细胞瘤(B16F1)以5x10s植入小鼠皮下，再经小鼠皮下注入IOOul (5ug)life_l ;对三组小鼠进行培养，其中第3组每隔6天再经小鼠皮下注入IOOul (5ug)life-l ;如图3所示，可以发现注入life-Ι后的小鼠肿瘤负荷明显减小，持续注入life-Ι后的小鼠肿瘤负荷减小更加明显(图3)。图2是在体外经过和life-Ι共培养后植入体内，显示肿瘤细胞生长减缓。图3是肿瘤细胞在体内被life-Ι抑制的实验。
[0035]体内小鼠生存试验:将黑色素细胞瘤(B16F1)以5x10s植入小鼠(3_4周龄)皮下，再经小鼠皮下注入IOOul (5ug) life-1,结果显示不仅肿瘤负荷明显减小(图中未显示);同时，持续注入LIFE-1的实验组(B16+LIFE-l(100ul+100ul)，每隔6天注入IOOul (5ug))相对于只注入一次LIFE-1的实验组(B16+LIFE-1 (IOOul)和没有注入LIFE-1的实验组(B16)小鼠生存率显著提高(图4)。
[0036]从图1到图3的试验结果可以明显看出本发明所制备的life-Ι对于肿瘤细胞有明显的抑制作用，特别是在肿瘤的作用时间没有超过一周的情况下，体外及体内实验中life-Ι对肿瘤的抑制作用已经被明显显现出来，图4所示由于肿瘤负荷的减少，小鼠的生存率提高了。
[0037]本发明的优点在于:
[0038]1.来源丰富，猪、狗、羊、兔在我国农村被大量饲养，成本低，繁殖率高易获得。
[0039]2.提取方法简单，本发明方法将股骨经无菌处理后打开骨髓腔，经细胞裂解后离心提取裂解液，整个流程操作简单。
[0040]3.更重要的是对肿瘤的抑制得到了实验证实，并且效果十分显著。
[0041]4.应用范围广，由于它的作用机制是通过补充肿瘤细胞缺少的糖蛋白酶来抑制肿瘤，因此对多数的肿瘤均有疗效。
[0042]本发明利用了哺乳动物骨髓细胞内液中含有的大量糖蛋白酶，动物实验表明，本发明从骨髓细胞中提取的life-Ι可以在体外和体内明显抑制肿瘤的生长，减少肿瘤负荷，由于它直接来自动物细胞因此对动物体无明显毒副作用，目前设想肿瘤细胞生长发育异常是因为细胞缺少多种糖蛋白酶，因此给与补充缺少的糖蛋白酶以抑制肿瘤细胞生长。
【权利要求】
1.哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将新鲜离体骨髓细胞加入生理盐水，浓度为IO8~IO9细胞/ml ;然后反复冻融将骨髓细胞裂解；然后经高速离心使细胞膜和细胞内液分离，然后提取上清液，过滤至无菌，所得滤液即为哺乳动物骨髓细胞内液；所述新鲜离体骨髓细胞来自哺乳动物。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:所述新鲜离体骨髓细胞来自新鲜离体下肢骨；所述新鲜离体下肢骨经酒精消毒后，将骨髓腔打开，获取所述新鲜离体骨髓细胞；所述新鲜离体下肢骨来自3-6个月大的哺乳动物。
3.根据权利要求1所述的哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:反复冻融的次数为4-6次。
4.根据权利要求1所述的哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:所述高速离心为10000-14000cpm离心20-40分钟。
5.根据权利要求1所述的哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:过滤至无菌具体为将上清液经2um滤网过滤达到无菌。
6.根据权利要求 1所述的哺乳动物骨髓细胞内液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:所述哺乳动物为狗、猪、羊或者兔。
7.权利要求1制备的哺乳动物骨髓细胞内液在制备用于抑制和/治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述肿瘤为黑色素细胞瘤或肝癌。
【文档编号】A61K35/28GK103463128SQ201310360958
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】刘铁 申请人:西安交通大学