用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰n-脂肪酰核苷类似物的制作方法

用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰n-脂肪酰核苷类似物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其特征在于核苷类似物用环磷酰化基团修饰后，再连接不同碳原子数的脂肪链。该磷酰N-脂肪酰核苷类似物可以方便地制备得到纳米传递系统，且具有明显肝细胞靶向性和肿瘤靶向性。纳米传递系统包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、纳米乳、自组装传递系统。核苷类药物选自拉米夫定、阿糖腺苷、西多福韦、吉西他滨、阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟达拉滨。磷酰N-脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统经静脉给药后，可发挥靶向性治疗病毒性肝炎和肝癌的效果。
【专利说明】用于病毒性肝炎和肝癌治疗的磷酰N-脂肪酰核苷类似物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学和生物医药领域，特别涉及一种磷酰N-脂肪酰核苷类似物，由该 化合物可制备纳米传递系统，包括脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳、自组装 传递系统。

【背景技术】
[0002] 肝组织细胞可分为肝实质细胞和非实质细胞。非实质细胞主要包括枯否细胞等具 有吞噬功能的细胞，属于单核巨噬细胞系统（MPS)。肝脏恶性肿瘤包括肝实质细胞癌（HCC， 简称肝癌）、胆管细胞癌、肝内血管肉瘤及肝内转移性肿瘤等，其中90%为肝实质细胞癌， 是全球除胃癌和食管癌外的第3种常见肿瘤。我国是肝癌发病率最高的国家，比西方国家 高10倍以上，仅次于肺癌居第2位。我国肝癌发病人数占全球的55%，而死亡人数约占全 世界肝癌死亡人数的45%。在可导致肝癌的多项危险因素中，乙型肝炎病毒（HBV)感染、丙 型肝炎病毒（HCV)感染和酒精位列前3位。HBV或HCV作为嗜肝病毒，主要感染肝实质细 胞，继而引发肝实质细胞肿瘤。特别是由于HBV感染还没有得到有效控制，我国肝癌发病率 保持持续上升势头。
[0003] 核苷（Nucleosides)是生物体内的重要化学成分，由它衍生得到的核苷酸以及核 酸是遗传信息的携带者。最重要的遗传物质DNA和RNA就是由核苷酸组装而成。核苷和核 苷酸也参与生物体内许多重要的反应。自然界中的核苷由一个噪呤或啼陡碱基与一个五碳 糖结合而成。碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，五碳糖为核糖和脱氧核 糖，并由它们分别组成腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷，以及脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧 胸苷。
[0004] 核苷类似物（Nucleoside analogues, Nu)是一类重要的化学物质。它的结构特 征与核苷类似。人们已经合成了多种核苷类似物，发现其中有许多具有药理活性，例如抗病 毒作用、细胞毒作用、免疫抑制作用等。目前对核苷类似物活性的考查主要集中在抗病毒和 抗癌方面。抗病毒的核苷类似物在体内经过病毒和人体细胞的激酶磷酸化作用后形成磷酸 化核苷类似物，后者可通过各种途径抑制病毒。根据不同作用功能部位，它们可以分为DNA 聚合酶抑制剂、DNA还原酶抑制剂、胸苷激酶抑制剂、RNA酶抑制剂、逆转录酶抑制剂等，临 床上用于治疗疱疫病毒、巨细胞病毒、水痘病毒、流感病毒、肝炎病毒、SARS病毒、艾滋病毒 (HIV)、脑炎病毒等感染。因为病毒的复制在细胞内完成，所以大多数抑制病毒复制增殖过 程的抗病毒药物需要进入细胞内才能发挥抗病毒作用。核苷类似物的水溶性一般较强，使 得细胞内核苷类物质不易渗出，这是由细胞维持生命本能决定的。同时外界核苷类似物也 较难进入细胞内部，即许多核苷类似物的细胞膜渗透性不好。因此许多核苷类似物药物口 服生物利用度差，细胞内浓度小，影响了抗病毒作用的发挥，并且药物长期在细胞内保持低 浓度还有可能使病毒产生耐药性。抗癌的核苷类似物一般是一种抗代谢物，通过抑制核酸 合成发挥细胞毒作用，同样它们也需要进入细胞内才能发挥作用。因此抗癌核苷类似物也 存在生物利用度较低、穿越细胞膜和血脑屏障较难等问题。
[0005] 人们设计了很多方法来解决核苷类似物的生物利用度和细胞摄取问题，例如合成 前药和设计特殊的药物传递系统，其中脂溶性前药和脂质体给药系统比较引人注目。脂溶 性前药给药有一定困难。因为脂溶性药物不溶或难溶于水，一般制剂，如片剂和注射剂无法 解决其在水溶液中的分散和溶解问题。药物一般需要以分子或高度分散状态的分子聚集体 形式才能吸收和进入细胞。人体内环境呈水性，生物膜呈脂溶性，药物或药物传递系统需在 体内多次穿越生物膜，才能达到细胞等作用靶部位。如果不溶性的脂溶性药物无法溶解或 高度分散，就无法有效地传递药物。
[0006] 脂质体（Liposomes)是一种由磷脂双分子层构成的囊泡，在水溶液中高度分散， 可作为多种药物的载体。它的高度分散性使其在体内具有靶向、缓释等效果，口服具有淋巴 趋向性，较易携带药物穿越血脑屏障，容易通过融合、内吞等途径进入细胞内。脂质体囊泡 的磷脂双分子层膜将内部包裹的水相和外部水相隔开，双分子层内呈疏水性。药物根据其 物理化学性质的不同分别包裹在内水相或膜中。一般地，水溶性药物在内水相中；脂溶性药 物在膜层中。脂质体的制备是磷脂分子在水中自组装的过程，内外水相的体积比例不能很 大。这些因素决定了大部分水溶性药物的包裹率较低（〈50%)，有时还会很低（5%)，并且 包裹的药物有渗漏到外水相的可能。如果有合适的脂溶性基团（如脂肪链），脂溶性药物 分子就可插入到磷脂双分子层中，结合比较牢固，药物分子不容易脱掉，所以药物包裹率较 高。因此为了增加某些水溶性药物在脂质体中的包裹率，人们往往采用了制备成带有长脂 肪链的脂溶性前体药物的方式。如果在制备得到核苷类似物脂溶性前药的基础上，再制备 成脂质体，可以增加包裹率，也同时具有了脂质体水溶液中高度分散性和脂溶性前药易渗 透进入细胞的特点
[0007] 非离子表面活性剂囊泡（Niosomes)是指某些非离子表面活性剂（如司盘60)在 一定条件下在水中自组装成囊泡结构，类似脂质体。它可作为药物载体，具有类似脂质体的 一些体内外特征。
[0008] 纳米粒（Nanoparticles) -般是指纳米级分散的固体粒子，由于其高度分散性， 作为药物载体有提高药物生物利用度、增强靶向性等特点。固体脂质纳米粒（SLN)采用人 体相容的脂质材料作为主要辅料形成纳米粒，具有普通纳米粒的特点和生物相容性好的特 点，近年来研究较多。
[0009] 绝大部分肿瘤内部血管生长迅速不规则，内部淋巴系统清除慢，存在肿瘤渗透增 强因子，使大分子和纳米颗粒易滞留在肿瘤内部，称为"增强渗透和滞留效应"（Enhanced Permeability and Retention, EPR)。纳米给药系统由于EPR效应可被动革巴向到肿瘤。
[0010] HepDirect前药是一类新的磷酸酯和磷酸酯前药。它是1，3-丙烷基酯类，包含一 个4-芳基环状取代基。该类前药对细胞色素P450 (CYP450)催化的氧化断裂反应敏感，可以 特异地被CYP450同工酶CYP3A4酶氧化，释放出活性核苷酸或核苷磷酸，发挥药效。CYP3A4 酶主要在肝实质细胞中表达，其他细胞表达较少。因此Hepdirect前药只有在肝实质细胞 中被特异性降解发挥作用，降低了前药对正常细胞的损伤，毒副作用降低。在肝炎和肝癌靶 向治疗中意义重大。


【发明内容】

[0011] 本发明人发明了一种磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其特征在于核苷类似物用环磷 酰化基团修饰后，再连接不同碳原子数的脂肪链。本发明人出乎意料地发现由上述磷酰 N-脂肪酰核苷类似物可以方便地制备得到纳米传递系统，且具有明显肝细胞靶向性和肿瘤 靶向性。根据前面所述，具有高度分散状态并且脂溶性较强的药物容易在体内进行传递，并 且生物膜渗透性好。本发明因此首次设计并制备了具备上述功能的用于病毒性肝炎和肝癌 治疗的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，并制备了其纳米传递系统。
[0012] 一般采用适当的某种反应将环磷酰化基团、核苷类似物、长脂肪链三者结合，得到 磷酰N-脂肪酰核苷类似物。磷酰N-脂肪酰核苷类似物的结构为
[0013] Hep-Nu-L
[0014] 其中Hep代表在核苷糖环5'位羟基或短脂肪链羟基取代的环磷酰化基团，Nu是 核苷类似物基团，L代表脂肪链，并且L中的碳数在8?20之间。
[0015] 一般情况下，可以先将环磷酰化基团与核苷类似物结合，再与长脂肪链结合，当然 也可以将顺序颠倒。本发明中的长脂肪链碳数在8?20之间，它的原型分子优选自8?20 个碳数的单羧基脂肪酸，如正辛酸、正癸酸、十二酸（月桂酸）、十四酸（肉豆蘧酸）、十六酸 (软脂酸）、十八酸（硬脂酸）、二十酸（花生酸）。
[0016] 本发明中所述的用于制备磷酰N-脂肪酰核苷类似物的核苷类似物原型分子，在 分子结构特征方面一般含有活泼基团，如游离的羟基或氨基，优选的是核苷类似物分子中 的非芳香环的脂肪链（或环）上有一个以上的羟基，更优选的是非芳香环的脂肪链（或环） 上有一个羟基。本发明所述的核苷类似物没有要求其具有特殊作用，但优选的是在作用方 面具有药理活性的药物，更优选的是具有抗病毒或抗癌作用的药物。抗病毒药物可以选自 拉米夫定、阿糖腺苷、西多福韦，优选的是拉米夫定。抗肿瘤药物可以选自吉西他滨、阿糖胞 苷、阿扎胞苷、氟达拉滨，优选的是吉西他滨。
[0017] 本发明中的磷酰N-脂肪酰核苷类似物的合成步骤一般分为两个阶段。首先核苷 类似物与环磷酰化基团发生酯化，然后再与脂肪链以酰胺键连接得到最终产物，或两个步 骤倒置。在上述酰化反应中，可以采用酸或酸酐与羟基或氨基酰化；或酰氯与羟基或氨基酰 化的方式；或羧酸先形成活化的中间体，然后与羟基或氨基酰化；或由羧酸直接与羟基或 氨基酰化。通过参考相关文献方法和利用一般专业技术就可以得到高纯度的磷酰N-脂肪 酰核苷类似物。
[0018] 本发明中的磷酰N-脂肪酰核苷类似物带有脂溶性较强的脂肪长链，可以将它们 制备成纳米传递系统，选自脂质体、非离子表面活性剂囊泡、纳米粒、纳米乳剂型。这些纳米 传递系统的粒子直径一般小于1微米，优选的是小于0. 5微米，更优选的是小于0. 2微米。 制备方法可以参考相关文献方法和专业技术。
[0019] -般地，如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将磷酰N-脂肪酰核苷类似物与磷 脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中，减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适 当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。如果超声时间延长，还可能得到纳米 级分散系统。如果采用反相蒸发法制备脂质体，可以将磷酰N-脂肪酰核苷类似物与磷脂 等膜材共同溶于有机溶剂，加入水或缓冲液，高速搅拌或超声制备成乳剂，然后减压旋转蒸 发，得到凝胶态物质，然后加入水或适当缓冲液或不加，继续减压旋转蒸发，直至形成均匀 的脂质体混悬液。脂质体混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾 干燥，形成固体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到脂质 体混悬液。运用同样的技术可以获得磷酰N-脂肪酰核苷类似物的非离子表面活性剂囊泡。
[0020] 纳米粒制剂中的固体脂质纳米粒较适合于本发明中的磷酰N-脂肪酰核苷类生 物。一般地，将磷酰N-脂肪酰核苷类似物与常温下为固态的脂质，如磷脂、脂肪酸、甘油酯， 共同加热熔融，然后加入水或适当缓冲液，在加热情况下在高压乳匀机上循环乳化多次，形 成纳米分散的乳滴，迅速冷却，使之固化，即得到磷酰N-脂肪酰核苷类似物固体脂质纳米 粒。用微乳法也可制得磷酰N-脂肪酰核苷类似物固体脂质纳米粒。磷酰N-脂肪酰核苷类 似物纳米粒混悬液还可以选择适当处方并在适当条件下进行冷冻干燥或喷雾干燥，形成固 体粉末状，这样可以保证制剂的稳定性，临用前加入水溶液振摇即可得到纳米粒混悬液。
[0021] 磷酰N-脂肪酰核苷类似物纳米乳的制备可以参考常见的处方，一般包括乳化剂、 助乳化剂、助溶剂、油相、水相。一般在选择合适的处方后，即可容易地形成纳米乳。如果选 择合适的处方，一般包括乳化剂、助乳化剂、助溶剂、油相，还可以组成自纳米乳化系统，在 加入适量水溶液后，系统可以自行分散成纳米乳。
[0022] 除了上述可以方便地得到的磷酰N-脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统外，本发 明人还出乎意料地发现由于本发明中的磷酰N-脂肪酰核苷类似物具有特殊的物理化学性 质，特别是两亲性，由它自身或加入适量添加剂后在水溶液中可以自组装，形成纳米传递系 统。磷酰N-脂肪酰核苷类似物分子中含有脂溶性强的长脂肪链基团和极性较大的核苷基 团，因此具有两亲性，这种物理化学性质类似于磷脂和某些表面活性剂。如果两亲性分子的 分子结构满足一定条件，由它本身可以在水中自组装成纳米有序聚集体，例如双分子层、双 分子层弯曲得到的囊泡和双分子层叠加得到的长形纳米粒。本发明中的磷酰N-脂肪酰核 苷类似物具有较长的并且脂溶性较强的长脂肪链基团和亲水性核苷基团，较容易形成双分 子层，并进一步得到囊泡或长形纳米粒，不过某些条件下需加入一定量的添加剂。因此本发 明首次设计并制备了由本发明中的磷酰N-脂肪酰核苷类似物组成或加入适量添加剂的自 组装传递系统。
[0023] 本发明中的由磷酰N-脂肪酰核苷类似物组成的自组装传递系统的制备方法和脂 质体等纳米传递系统的制备方法类似。通常是将磷酰N-脂肪酰核苷类似物溶于某种有机 溶剂，根据需要可以加入适当添加剂，然后进行分散。方法包括薄膜分散法、反相蒸发法、注 入法、复乳法等。在某些情况下，添加剂不是必需的，此时传递系统全部由磷酰N-脂肪酰核 苷类似物组成。在某些情况下，单独用磷酰N-脂肪酰核苷类似物不能形成很好的纳米粒 子，此时需要加入适当添加剂，帮助其形成有序结构。是否需要加入添加剂根据磷酰N-脂 肪酰核苷类似物的物理化学性质决定，一般可以通过预实验来推断。
[0024] 本发明中的自组装传递系统中添加剂的量占全部组成成分的分子摩尔比例在 0?50%之间，优选的是0?30%，更优选的是0?15%，其余成分即为磷酰N-脂肪酰核 苷类似物。添加剂可以选自磷脂、多元醇酯类表面活性剂、聚氧乙烯类表面活性剂、双十六 烷基磷脂酸、胆固醇及其衍生物、硬脂胺。磷脂包括合成磷脂、半合成磷脂、天然磷脂。其中 合成磷脂又包括修饰的磷脂如聚乙二醇衍生化的磷脂、连接单克隆抗体的磷脂。多元醇酯 类表面活性剂优选的是失水山梨醇脂肪酸酯，具体如司盘60、司盘40、司盘20。聚氧乙烯类 表面活性剂优选的是聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物（又称泊洛沙姆），聚山梨酯和聚氧乙 烯脂肪醇醚，具体如泊洛沙姆P188、吐温80、吐温60、吐温40、吐温20、苄泽35。胆固醇及 其衍生物包括胆固醇、胆固醇的脂肪酸酯、聚乙二醇衍生化的胆固醇。
[0025] 含磷酰N-脂肪酰核苷类似物的纳米传递系统包括自组装传递系统，如果其组成 或表面吸附有高度亲水的分子或分子片段，由于在体外环境或体内环境可以形成亲水性保 护层，可以阻滞粒子间的聚合或在体内阻滞调理化作用而获得长循环效果。常用的亲水性 分子或分子片段是聚乙二醇（PEG)。在本发明中，可以采用添加聚乙二醇衍生化的磷脂或聚 乙二醇衍生化的胆固醇的方法制备得到表面亲水的磷酰N-脂肪酰核苷类似物的纳米传递 系统包括其自组装传递系统。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图I. 1-(3-苯基）_1，3-丙二醇合成路线
[0027] 图2. 1- (3-氯苯基）-1，3-丙二醇-N-十二酰拉米夫定磷酸酯合成路线
[0028] 图3.磷酰N-脂肪酰吉西他滨单分子膜π -a等温曲线。磷酰N-辛酰吉西他滨 (CPOG)、磷酰N-十二酰吉西他滨（CPDG)、磷酰N-十四酰吉西他滨（CPTG)、磷酰N-十六酰 吉西他滨（CPHG)和磷酰N-十八酰吉西他滨（CPODG)。
[0029] 图4.磷酰N-脂肪酰吉西他滨自组装传递系统的透射电镜照片。A :磷酰N-辛酰 吉西他滨自组装传递系统；B :磷酰N-十二酰吉西他滨自组装传递系统；C :磷酰N-十四酰 吉西他滨自组装传递系统；D :磷酰N-十六酰吉西他滨自组装传递系统；E :磷酰N-十八酰 吉西他滨自组装传递系统。
[0030] 图5.不同浓度磷酰N-脂肪酰吉西他滨自组装传递系统对H印G2细胞存活率的 影响。吉西他滨（GEM)、磷酰N-辛酰吉西他滨（CPOG)、磷酰N-十二酰吉西他滨（CPDG)、磷 酰N-十四酰吉西他滨（CPTG)、磷酰N-十六酰吉西他滨（CPHG)和磷酰N-十八酰吉西他滨 (CPODG)
[0031] 图6.磷酰N-十二酰吉西他滨（CPDG)自组装传递系统静脉注射后荷瘤小鼠体重 变化率
[0032] 图7.磷酰N-十二酰吉西他滨自组装传递系统静脉注射后在荷H22瘤小鼠中的组 织分布

【具体实施方式】
[0033] 实施例1.磷酰N-脂肪酰吉西他滨的合成
[0034] 磷酰N-脂肪酰吉西他滨的结构式为：
[0035]

【权利要求】
1. 一种磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其特征是结构为 Hep-Nu-L 其中Hep代表在核苷糖环5'位羟基或短脂肪链羟基取代的环磷酰化基团，Nu是核苷 类似物基团，L代表脂肪链，并且L中的碳数在8?20之间。
2. 如权利要求1所述的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其中脂肪链的原型分子选自正辛 酸、正癸酸、十二酸、十四酸、十六酸、十八酸、二十酸。
3. 如权利要求1所述的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其中核苷类似物原型分子，选自拉 米夫定、阿糖腺苷、西多福韦、吉西他滨、阿糖胞苷、阿扎胞苷、氟达拉滨。
4. 如权利要求1所述的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其中核苷类似物原型分子，是拉米 夫定。
5. 如权利要求1所述的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，其中核苷类似物原型分子，是吉西 他滨。
6. -种纳米传递系统，其特征是它包括权利要求1的磷酰N-脂肪酰核苷类似物，并且 选自脂质体、非离子表面活性剂泡囊、纳米粒、纳米乳、自组装传递系统。
7. 如权利要求6的纳米传递系统，其中自组装传递系统的粒子组成中权利要求1的磷 酰N-脂肪酰核苷类似物的量占全部组成成分的分子摩尔比例在50?100%之间，其余为添 加剂。
8. 如权利要求6的纳米传递系统，其中自组装传递系统的粒子全部由权利要求1的磷 酰N-脂肪酰核苷类似物组成。
9. 如权利要求6的纳米传递系统，是磷酰N-十二酰吉西他滨自组装传递系统。
10. 如权利要求6的纳米传递系统，是磷酰N-十二酰吉西他滨长循环自组装传递系统。
【文档编号】A61P31/12GK104211742SQ201410169585
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】金义光, 杜丽娜, 汪珊 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所