用于治疗癌症的组合的制作方法

本发明主要涉及治疗学和药物化学的领域，且更具体地涉及一些脾酪氨酸激酶(Syk)抑制剂与一些长春花生物碱的组合在治疗癌症中的用途，所述癌症包括例如，白血病、淋巴瘤和实体细胞肿瘤。

背景技术：

当下正在研究多种咪唑并吡嗪化合物以用于抑制脾酪氨酸激酶(Syk)的活性。Syk是非受体酪氨酸激酶，其在多种类型的细胞中的免疫受体-和整合素-介导的信号传导中起着关键作用，所述细胞类型包括B细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、T细胞、自然杀伤细胞、血小板和破骨细胞。

据报道，Syk在经B细胞受体的信号传导中起着重要作用，其已知为B细胞中的重要的生存信号。因此，抑制Syk活性可用于治疗一些类型的恶性血液病。这种恶性血液病的实例包括癌症，例如B细胞淋巴瘤和白血病。而且，存在关于一些实体癌(肿瘤)细胞系中Syk表达的报告。这些实体癌肿瘤的实例包括胰腺癌、肺癌、结肠癌和结肠直肠癌、卵巢癌和肝细胞癌。此外，抑制Syk活性被认为可用于治疗其他疾病和病症，包括炎性疾病(例如，类风湿性关节炎)、过敏性疾病和自身免疫性疾病。

已经发现抑制Syk活性的一种这样的化合物或其药学上可接受的盐，其用式I表示:

该式的化合物具有化学名6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺。该化合物及其合成已被描述于美国专利号8,450,321和8,455,493中，将其全部引入本文作为参考，特别在于制备该化合物的方法。参见例如，美国专利号8,450,321的实施例1和2。

长春花生物碱为20世纪50年代发现的衍生自长春花(Madagascar periwinkle)植物的药物的亚组，且具有多种用途，包括治疗糖尿病、高血压和癌症。对这些适应症正在使用或正开发约10(十)种长春花生物碱，包括用于临床肿瘤用途的4种主要的长春花生物碱：长春碱、长春瑞滨、长春新碱和长春地辛。这些主要长春花生物碱中的每一种都已报告引起了严重副作用，最显著为神经病。更常见的长春花生物碱之一为长春新碱(VCR)，也被称为醛基长春碱(leurocristine)，且以安可平为名销售。如同其它长春花生物碱，长春新碱作为有丝分裂抑制剂可用于癌症化疗且常用于非霍奇金病的标准护理方案CHOP(环磷酰胺、羟基柔红霉素(也称为多柔比星)、安可平(长春新碱)和泼尼松)，或用于B-细胞淋巴瘤的R-CHOP(CHOP与(也称为利妥昔单抗)的组合)。然而，长春新碱也与另一种长春花生物碱一样具有多种严重的副作用，最严重的副作用为化疗-诱导的周围神经病，其为进行性、持久的，通常不可逆的神经病。该神经病可如此严重，以至于导致长春新碱使用的减少或甚至停止。

所需要的是在有此治疗需要的受试者中治疗对抑制Syk有响应的疾病的方法，包括在可被认为有患该疾病风险、标准治疗难以治愈和/或标准治疗后复发的受试者中进行治疗，其中仅使用Syk抑制剂的治疗方案不抑制细胞活性，尤其是对于可对继发于治疗方案的神经病敏感的受试者，其中该治疗方案包含标准给药水平的长春新碱或长春花生物碱。

技术实现要素：

本发明提供了在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合：

在一些实施方案中，所述受试者为患有对Syk活性有响应的癌症的人。在另一实施方案中，所述受试者为具有表达Syk的实体癌肿瘤的人。在一些实施方案中，所述受试者为具有17p缺失、TP53突变、NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失或其任意组合的人。在一个实施方案中，所述受试者为具有17p缺失、TP53突变或其组合的人。在另一实施方案中，所述受试者为具有NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失，或其任意组合的人。

在一些实施方案中，所述长春花生物碱选自长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、desoxyvincaminol、vincaminol、长春布宁、长春蔓晶和长春内日定及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，至少一种长春花生物碱选自长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、desoxyvincaminol、vincaminol、长春布宁、长春蔓晶和长春内日定及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述长春花生物碱选自长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨及其药学上可接受的盐。在其它实施方案中，所述长春花生物碱选自长春新碱和长春碱及其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述长春花生物碱为长春新碱及其药学上可接受的盐。在另一实施方案中，所述长春花生物碱为长春碱及其药学上可接受的盐。

本文还提供在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐；和治疗有效量的长春花生物碱或其药学上可接受的盐。

本文还提供在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或其药学上可接受的盐，其中：所述受试者为没有正在经历任何其它抗癌治疗的人；且所述受试者(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或其组合。

本文还提供附图和实施例，阐述了式I的化合物或其药学上可接受的盐和治疗有效量的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，相比单一治疗或作为唯一药剂给药的单独的式I化合物或长春花生物碱，该组合在一些癌症以及其各自细胞系中的治疗作用具有出人意料的改善。

在一些实施方案中，所述受试者没有正在经历任何使用一种或多种PI3K抑制剂的其它抗癌治疗。在一些实施方案中，该PI3K抑制剂可包括化合物A、B和C，它们的结构在以下提供：

化合物A具有化学名(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)丙基)-5-氟-3-苯基喹唑啉-4(3H)-酮，化合物B命名为(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)乙基)-5-氟-3-苯基喹唑啉-4(3H)-酮，且化合物C为(S)-2-(1-((9H-嘌呤-6-基)氨基)乙基)-3-(2,6-二氟苯基)喹唑啉-4(3H)-酮。

在一些实施方案中，所述受试者为至少一种抗癌治疗难以治愈的。在其它实施方案中，所述受试者处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中。

在一些实施方案中，约100mg至800mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。在其它实施方案中，约200mg至400mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。在一个实施方案中，约400mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。

在一个变型中，所述受试者为具有17p缺失、TP53突变或其组合的人；且约100mg至800mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。在另一个变体中，所述受试者为具有17p缺失、TP53突变或其组合的人；且约200mg至400mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。在另一个变体中，所述受试者为具有17p缺失、TP53突变或其组合的人；且约400mg的式I的化合物或其药学上可接受的盐被给药于受试者，每天两次。

在其它实施方案中，所述长春花生物碱或其药学上可接受的盐，以临床批准的或亚临床批准的量给药于受试者，每周一次。在一些实施方案中，所述长春花生物碱的量以亚临床批准的量给药于受试者，每周一次。在其它实施方案中，所述长春花生物碱为长春新碱，且长春新碱或其药学上可接受的盐的量，以0.1mg-M²至1.5mg-M²的剂量给药。在其它实施方案中，所述长春花生物碱以0.25mg-M²至1.0mg-M²的剂量给药于受试者，每周一次，且所述长春花生物碱选自长春新碱和长春碱。在其它实施方案中，所述长春花生物碱以0.1mg-M²至0.2mg-M²的剂量给药于受试者，每天一次，且所述长春花生物碱选自长春新碱和长春碱。

在一些实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在长春花生物碱或其药学上可接受的盐之前给药。在其它实施方案中，长春花生物碱或其药学上可接受的盐，在式(I)的化合物或其药学上可接受的盐之前给药。

在一个实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐以及和长春花生物碱或其药学上可接受的盐同时给药，其中所述长春花生物碱通过静脉注射给药且式I的化合物通过片剂给药。在一些实施方案中，式I的化合物和至少一种长春花生物碱或它们的药学上可接受的盐，每天独立给药两次。在其它实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，和长春花生物碱或其药学上可接受的盐，每天给药一次。在其它实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，和长春花生物碱或其药学上可接受的盐，一周给药一次。在一个实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐每天给药两次，且长春花生物碱或其药学上可接受的盐一周给药一次。在一个实施方案中，式(I)的化合物或其药学上可接受的盐每天给药一次，且长春花生物碱或其药学上可接受的盐一周给药一次。

在一些实施方案中，所述癌症为恶性血液病。在一些实施方案中，所述癌症为白血病。在一个实施方案中，所述白血病为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在一些实施方案中，所述癌症为淋巴瘤。在一个实施方案中，所述淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一个变型中，所述NHL为弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、和/或边缘区淋巴瘤(MZL)。因此，应理解在一个方面所述受试者为患有恶性血液病，如白血病或淋巴瘤的人。

在某些实施方案中，所述癌症选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵袭性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、难治性iNHL、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、T-细胞淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、和边缘区淋巴瘤(MZL)。

在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤癌症(或实体癌肿瘤)。在一些实施方案中所述癌症为实体瘤且表达脾酪氨酸激酶(Syk)活性。在其它实施方案中，所述实体瘤癌症选自胰腺癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳癌、食管癌、腺癌和肝细胞癌。

附图简述

图1描绘式I的化合物的化学结构。

图2详述了式I的化合物和长春新碱的组合相比于单独的长春新碱在十七(17)种恶性B-细胞系(代表4种血液癌症类型：DLBCL、MM、FL和MCL)中的抑制作用。(图2(a)–2(q))

图3总结了式I的化合物和长春新碱的组合相对以下组合的效果：A)式I的化合物和考布他汀A4；B)式I的化合物和秋水仙碱；C)式I的化合物和多柔比星；以及D)式I的化合物和紫杉醇。

图4描绘且总结了当化合物共同给药时，图1化合物和两种长春花生物碱(分别为长春新碱和长春碱)之一的组合，在DLBCL细胞系DHL-10中的抑制作用。

图5总结了式I的化合物和长春新碱的组合在表达Syk的恶性结肠细胞系MiaPaca(图5a)、和不表达Syk的恶性结肠细胞系HepG2(图5b)中对细胞活力的抑制。

图6描绘了在MiaPaca和HepG2恶性结肠细胞系中Syk表达水平。

图7总结了在源自肺、胰腺和结肠的恶性细胞系中Syk的表达水平。

发明详述

以下说明阐述了示例性的组合物和方法。但是，应认识到，这种描述不旨在限制本发明的范围，而是作为示例性实施方案的说明。

本发明提供了在有此需要的具体受试者(例如，人)群体中治疗癌症的方法，其包括向这种受试者给药治疗有效量的式I化合物或药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合：

本文还提供附图和实施例，阐述了式I的化合物或其药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，相比单一治疗或作为唯一药剂给药的单独的式I化合物或长春花生物碱，该组合在一些癌症以及其各自细胞系中的治疗作用具有出人意料的改善。

所述式I化合物也可用其化合物名称表示：6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺。所提供的化合物名称是使用ChemBioDrawUltra 12.0命名的，且本领域技术人员理解，所述化合物结构可使用其他公认的命名系统和符号(包括CAS和IUPAC)进行命名或鉴定。用于合成所述式I化合物的方法在之前已描述于，例如，美国专利号8,450,321中。

本发明给出的任意化学式或结构，包括所述式I化合物及其药学上可接受的盐，也旨在表示该化合物的未标记形式以及同位素标记形式或其盐。同位素标记的化合物或其盐具有本发明给出的化学式所描绘的结构，除了一个或多个原子被具有选定的原子质量或质量数的原子所替代。可掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如，但不限于²H(氘，D)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²P、³⁵S、³⁶Cl和¹²⁵I。本发明的各种同位素标记的化合物或其盐，例如引入放射性同位素(例如³H、¹³C和¹⁴C)的那些均被包括在内。这种同位素标记的化合物或其盐可用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，例如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定或用于受试者(例如人)的放射性治疗。

本发明还包括所述式I化合物及其药学上可接受的盐，其中碳原子所连接的1至n个氢被氘代替，其中n为该分子中的氢数。这种化合物可表现出增加的代谢抗性，并因此当给药至哺乳动物时，有效提高所述式I化合物或其药学上可接受的盐的半衰期。参见，例如，Foster，“Deuterium Isotope Effectsin Studies of Drug Metabolism”,Trends Pharmacol.Sci.5(12):524-527(1984)。这种化合物通过本领域熟知的方式合成，例如通过采用其中一或多个氢已被氘代替的起始原料。

氘标记的或取代的本发明治疗性化合物可具有改善的DMPK(药物代谢和药代动力学)性质，其涉及分布、代谢和排泄(ADME)。由于更高的代谢稳定性，被较重的同位素(例如氘)取代可提供一定的治疗优势，例如增加的体内半衰期、减少的剂量需求和/或治疗指数的改善。¹⁸F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。同位素标记的本发明化合物及其前药通常可通过实施下述方案或实施例及制备中公开的操作制备，其用易得的同位素标记试剂取代非同位素标记试剂。应理解，在上下文中，氘被认为是所述式I化合物及其药学上可接受的盐的取代基。

这种较重的同位素(尤其是氘)的浓度可用同位素富集因子来定义。在本发明化合物中，没有具体用特定同位素指示的任何原子意指该原子的任何稳定的同位素。除非另外提及，当一个位置被具体指定为“H”或“氢”时，则该位置应理解为具有其天然丰度同位素组成的氢。因此，在本发明的化合物或其盐中，被具体指示为氘(D)的任何原子意指氘。

长春花生物碱及其药学上可接受的盐衍生自长春花植物，且已用于治疗糖尿病、高血压和多种癌症。长春花生物碱的实例包括长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、desoxyvincaminol、vincaminol、长春布宁、长春蔓晶和长春内日定。通常，在临床使用中有4种主要长春花生物碱：长春碱、长春瑞滨、长春新碱和长春地辛。所有长春花生物碱静脉内(IV)给药。

本发明的长春花生物碱及其药学上可接受的盐为细胞毒性的–它们终止细胞分裂且引起细胞死亡。在细胞分裂过程中，长春花生物碱分子结合至蛋白质(称为微管蛋白)的构建单元以抑制其形成。微管蛋白通常在细胞中起作用以产生微管。这些微管向细胞提供它们分裂和复制所需的结构和柔性。没有微管，细胞就不能分裂。与Syk抑制剂形成对照(其抑制脾酪氨酸激酶)，长春花生物碱的机理为占据微管蛋白的构建结构，从而理论上防止微管形成，因此干扰癌细胞分裂的能力。

本发明的长春花生物碱之一长春碱抑制血管发生或新血管从先前已存在的血管生长的过程。血管发生为肿瘤转变为恶性肿瘤的关键步骤。长春碱通常用于治疗霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、乳癌和生殖细胞肿瘤。长春碱的副作用包括：对白细胞的毒性、恶心、呕吐、便秘、呼吸困难、胸部或肿瘤疼痛、气喘和发烧。长春碱也偶尔与抗利尿激素分泌和心绞痛相关。

本发明的另一长春花生物碱为长春瑞滨，其作用与长春碱类似。长春瑞滨已在患有乳癌的患者中显示显著的抗肿瘤活性和对骨肉瘤(骨肿瘤细胞)的抗增殖作用。长春瑞滨治疗可导致副作用，包括对感染、擦伤或出血降低的抗性，贫血，便秘，腹泻，恶心，手和脚麻木或麻刺感，疲劳(也称为周围神经病)，和注射位点的炎症。不常见的副作用包括脱发和过敏反应。

本发明的长春花生物碱另一实例或实施方案为长春新碱或其药学上可接受的盐。长春新碱对微管蛋白二聚体(二聚体为仅为两个嵌段长度的蛋白质的构建块)具有高亲和力且可迅速附着和再附着在不同位点，因此理论上防止二聚体重新组装(构建)成细管的能力，从而使微管蛋白不稳定且抑制微管形成。长春新碱经FDA批准以治疗急性白血病、横纹肌肉瘤、成神经细胞瘤、魏尔姆瘤、霍奇金病和其它淋巴瘤。长春新碱最常见的副作用为：周围神经病、抑制骨髓活性、便秘、神经系统毒性、恶心、和呕吐，其中神经病为最常见和严重的副作用。因此，报告了一些用长春新碱治疗肿瘤的受试者必须停止长春新碱的治疗。

第四常见的长春花生物碱为长春地辛或其药学上可接受的盐。长春地辛的血清半衰期仅为24小时，但与长春碱的作用(预期作用和副作用)类似。在治疗黑素瘤、治疗肺癌和(与其它药物组合)治疗子宫癌时，长春地辛通常以3毫克/平方米体表面给药。长春地辛的其它副作用包括：贫血、血细胞毒性、疲劳、皮肤麻刺感或刺痛感觉，和皮肤毒性。

药学上可接受的盐

在本文所述方法的一些实施方案中，将所述式I化合物的药学上可接受的盐给药至所述受试者(例如，人)。

如本文所用“药学上可接受的”是指不是生物学不希望或其他方面不希望的物质，例如，可将该物质掺入给药至患者的药物组合物中而不会产生任何显著不希望的生物学效应，也不会与该组合物中所含的任何其他成分以有害方式相互作用。药学上可接受的载剂(例如，载体、佐剂和/或其他赋形剂)已优选地符合毒理学和成品试验的所需标准和/或已被包括在美国食品和药品管理局制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的盐”包括，例如，无机酸的盐和有机酸的盐。盐的实例可包括盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和烷酸盐(例如乙酸盐、HOOC-(CH₂)_n-COOH，其中n为0-4)。此外，如果以酸加成盐形式获得本文所述化合物，则该游离碱可通过将所述酸盐的溶液碱化获得。相反地，如果所述产物是游离碱，则加成盐(特别是药学上可接受的加成盐)可通过将所述游离碱溶于合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液进行制备，其根据由碱化合物制备酸加成盐的常规操作。本领域技术人员将理解可用于制备无毒药学上可接受的加成盐的各种合成方法。

术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指可能有效引起所需生物或医疗响应的量，包括当给药化合物至受试者以治疗疾病时足以实现该疾病的治疗的量。所述有效量将根据化合物、待治疗受试者的疾病及其严重性和年龄、体重等而改变。该有效量可包括一定范围的量。药物有效量包括当与其它药物组合时有效的药物的量。

在本发明一些实施方案中，式I的化合物的药学上可接受的盐为二甲磺酸盐。在本发明一些实施方案中，长春花生物碱的药学上可接受的盐为硫酸盐。在本发明一些实施方案中，式I的化合物的药学上可接受的盐为二甲磺酸盐且长春花生物碱的药学上可接受的盐为硫酸盐。在本发明一个实施方案中，式I的化合物的药学上可接受的盐为二甲磺酸盐且所述长春花生物碱为长春新碱，其中所述药学上可接受的盐为硫酸长春新碱。

药物组合物

在本文所述方法的一些实施方案中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，存在于药物组合物中，所述药物组合物包含所述式I化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂可包括药学上可接受的载体、辅料和/或其他赋形剂，并且其他成分也可被视为药学上可接受的，只要它们与该制剂的其他成分相容且对其接受者无害。

本文所述的式I化合物的药物组合物可使用任意常规方法制备，例如，混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、包埋、熔纺、喷雾干燥或冻干工艺。最佳药物制剂可由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量进行确定。这种制剂可影响所施用的药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。根据所治疗的病症，可配制这些药物组合物并全身给药或局部给药。

术语“载体”是指稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂以及与所述化合物一起施用的其他赋形剂和载剂。载体在本文以及在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中进行一般性描述。载体的实例包括，但不限于，单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟基二十八烷醇羟基硬脂酸酯、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆407、聚维酮、二氧化硅、胶体二氧化硅、硅酮、硅酮粘合剂4102和硅酮乳液。但是，应理解，该药物组合物中所选定的载体以及这种载体在所述组合物中的量可根据制剂的方法而变化(例如，干法制粒制剂、固体分散制剂)。

术语“稀释剂”通常是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的物质。稀释剂也可用于稳定化合物。稀释剂的实例可包括淀粉、糖、二糖、蔗糖、乳糖、多糖、纤维素、纤维素醚、羟丙基纤维素、糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、微晶纤维素、碳酸钙或碳酸钠、乳糖、乳糖一水合物、磷酸二钙、纤维素、可压缩糖、无水磷酸氢钙、甘露醇、微晶纤维素和磷酸钙。

术语“崩解剂”通常是指这样一种物质，其一旦加至固体制剂，则在给药后促进该固体制剂的分裂或崩解并使得活性成分尽可能有效地释放以允许其快速溶出。崩解剂的实例可包括玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、微晶纤维素、改性的玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、聚维酮、预胶化淀粉和海藻酸。

术语“沉淀抑制剂”通常是指防止或抑制所述活性剂从过饱和溶液中沉淀的物质。沉淀抑制剂的一个实例包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

术语“表面活性剂”通常是指降低液体和固体之间的表面张力的物质，其可提高所述活性剂的润湿性或提高所述活性剂的溶解度。表面活性剂的实例包括泊洛沙姆和月桂基硫酸钠。

术语“助流剂”通常是指用于片剂和胶囊制剂中以提高压片过程中的流动性并产生抗结块作用的物质。助流剂的实例可包括胶体二氧化硅、滑石、烟雾硅胶、淀粉、淀粉衍生物和膨润土。

术语“粘合剂”通常是指任意药学上可接受的膜(film)，其可用于将所述活性成分和载体的惰性成分粘合在一起以维持粘合和分离的部分。粘合剂的实例可包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、共聚维酮和乙基纤维素。

术语“润滑剂”通常是指加至粉末共混物中以防止在压片或包封过程中被压实的粉块粘到设备上的物质。润滑剂可帮助所述片剂从模具中排出并可提高粉末流动。润滑剂的实例可包括硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅、脂肪、硬脂酸钙、聚乙二醇、硬脂酰富马酸钠或滑石；和增溶剂，例如脂肪酸，包括月桂酸、油酸和C₈/C₁₀脂肪酸。

治疗方法

本发明提供了使用式I化合物或其药学上可接受的盐，在治疗或预防的方面上选择性或特异性地抑制Syk活性，并与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，在治疗或预防的方面上选择性或特异性地抑制微管蛋白或微管形成的方法。该方法包括以足以抑制Syk活性和/或抑制微管蛋白或微管形成的量，向有此需要的受试者(例如，人)给药式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，且与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合。所述方法可用于治疗患有或易患病症的受试者(例如，人)，所述病症的症状或病状是由Syk的表达或活性所介导的。

“治疗”是为了获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果可包括以下中的一种或多种：

(i)减少由该疾病产生的一种多种症状；

(ii)降低该疾病的严重程度和/或稳定该疾病(例如，延迟该疾病的恶化)；

(iii)延迟该疾病的扩散(例如，转移)；

(iv)延迟或减缓该疾病的复发和/或该疾病的进展；

(v)改善该疾病状态和/或提供该疾病的缓解(无论是部分缓解或整体缓解)和/或减少治疗该疾病所需的一种或多种其他药物的量；

(vi)提高生存质量；和/或

(vii)延长生存期。

“延迟”疾病或病症的发展是指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或搁延所述疾病或病症的发展。该延迟可为不同的时间长度，其取决于所述疾病或病症的病史，和/或所治疗的受试者。“延迟”疾病或病症的发展的方法是指，相比于未使用该方法，在给定时限内降低疾病或病症发展的可能性和/或在给定时限内降低疾病或病症的严重程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，该研究使用了统计学显著量的受试者。疾病或病症的发展可使用标准方法进行检测，例如常规身体检查、乳房X射线摄影术、成像或活组织检查。发展也可指最初检测不到的疾病或病症的进展，并包括发生、复发和发作。

在一些实施方案中，可将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，其被给药至有面临所述疾病或病症的风险或有所述疾病或病症家族史的受试者(例如，人)。

术语“抑制”表示生物活性或过程的基线活性的降低。“抑制Syk活性”是指相对于不存在所述式I化合物或其药学上可接受的盐时的Syk活性，由于直接或间接响应于这种化合物或其药学上可接受的盐的存在，Syk的活性降低。在一些实施方案中，所述Syk活性的抑制可与同一受试者治疗前相比较，或与未接受治疗的其他受试者相比较。“抑制微管蛋白形成的活性”是指相对于不存在所述长春花生物碱或其药学上可接受的盐时的微管蛋白形成的活性，由于直接或间接响应于长春花生物碱或其药学上可接受的盐的存在，降低了微管蛋白的形成。在一些实施方案中，微管蛋白形成的抑制可与同一受试者治疗前相比较，或与其它未接受该治疗的受试者比较。

疾病

在一些实施方案中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，被用于治疗癌症。在一些实施方案中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，用于治疗恶性血液病。在一些实施方案中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，抑制造血来源的癌细胞的生长或增殖。在一些实施方案中，所述癌细胞是淋巴来源的，且在一些实施方案中，所述癌细胞与B淋巴细胞或B淋巴细胞祖细胞有关或衍生自B淋巴细胞或B淋巴细胞祖细胞。

适于使用本发明公开的方法进行治疗的恶性血液病包括，但不限于，淋巴瘤(例如，淋巴和网状内皮组织的恶性肿瘤，例如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤)；多发性骨髓瘤；白血病(例如，淋巴细胞性白血病、慢性髓性(髓细胞性)白血病)。造血来源或其他来源的表达Syk的其他癌细胞也可通过给药本文所述的多晶型物及其组合物进行治疗。

在具体实施方案中，所述恶性血液病为白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述恶性血液病为急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵袭性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、难治性iNHL、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、T-细胞淋巴瘤、B-细胞淋巴瘤、弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。

在一个实施方案中，所述癌症为T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)，或B-细胞急性成淋巴细胞性白血病(B-ALL)。在另一实施方案中，所述癌症为慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另一实施方案中，所述癌症为非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一个实施方案中，所述NHL为弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。在一个实施方案中，所述癌症为低侵袭性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)。

在一些实施方案中，式I的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，用于治疗实体瘤癌症。在一些实施方案中，式I的化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，用于治疗一些实体瘤癌症，如胰腺癌、肺癌、结肠癌、结肠-直肠癌、乳癌、肝细胞癌。在一些实施方案中，式I的化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，用于治疗具有Syk活性的表达或其中表达Syk的一些实体瘤癌症。其它表达Syk的实体瘤癌细胞可通过给药本文所述的多晶型物和其组合物而治疗。

在又一方面，本发明提供了治疗患有Syk-介导的障碍的受试者(例如，人)的方法，其中向所述受试者给药式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合。本发明还提供了调节受试者(例如，人)的Syk的方法，其中向所述受试者给药式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合。

在本文所述的任意方法中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可作为单位剂量(例如以片剂的形式)给药至所述个体。在本文所述的任一方法中，所述长春花生物碱或其药学上可接受的盐，可通过IV(静脉内)递送而被给药于个体。

本文所提供的任何治疗方法都可用于治疗晚期癌症。本文所提供的任何治疗方法都可用于治疗局部晚期的癌症。本文所提供的任何治疗方法都可用于治疗早期癌症。本文所提供的任何治疗方法都可用于治疗缓解期癌症。在本文提供的任意治疗方法的一些实施方案中，所述癌症已在缓解后复发。在本文提供的任意治疗方法的一些实施方案中，所述癌症是进行性癌症。

受试者

所提供的任意治疗方法可用于治疗已被诊断为或疑似患有癌症的受试者。“受试者”是指动物，例如哺乳动物(包括人)，其已为或将为治疗、观察或实验的对象。本文所述的方法可用于人的疗法和/或兽医应用。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。

在本文提供的任意方法的一些实施方案中，所述受试者是有发展癌症风险的人(例如，遗传上或在其他方面倾向于发展癌症的人)和已诊断为或还未诊断为患有癌症的人。如本文所用，“有风险的”受试者是指有发展癌症(例如，恶性血液病或实体瘤癌症)风险的受试者。所述受试者可已患有可检测到的疾病或者可未患有可检测到的疾病，以及在本文所述治疗方法之前可能已表现出或可能未表现出可检测到的疾病。有风险的受试者可具有一种或多种所谓的危险因素，其为与如本文所述的癌症的发展相关的可测参数。具有一种或多种这些危险因素的受试者比没有这些危险因素的个体具有更高发展癌症的概率。

这些危险因素可包括，例如，年龄、性别、种族、饮食、先前病史、先兆疾病(precursor disease)的存在、基因(例如，遗传)原因和环境暴露。在一些实施方案中，有患癌症风险的受试者包括，例如，其亲戚已经历这一疾病的受试者，和通过基因或生化标记物分析确定风险的那些。患癌症的前史也可以是例如癌症复发的危险因素。

本发明提供了治疗受试者(例如，人)的方法，所述受试者有“极高风险”或“高风险”患癌症(例如，恶性血液病)。这种受试者可通过一些基因缺失和/或突变的存在来鉴定。在一个方面，极高风险的受试者是具有17p缺失、TP53突变，或其组合的人。在一个方面，高风险的受试者是具有NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失或其任意组合的人。因此，应理解，本文详述的治疗方法可能，在一些情况下，通过检测17p缺失、TP53突变、NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失或其任意组合中一种或多种的存在与否来选择具有极高患癌症风险或具有高患癌症风险的受试者。

本发明还提供了治疗受试者(例如，人)的方法，所述受试者表现出一种或多种与癌症(例如，恶性血液病或实体瘤癌症)相关的症状。在一些实施方案中，所述受试者是早期癌症。在其他实施方案中，所述受试者是晚期癌症。

本发明还提供了治疗受试者(例如，人)的方法，所述受试者正进行一种或多种用于治疗癌症(例如，恶性血液病或实体瘤癌症)的标准疗法，例如化疗、放疗、免疫疗法和/或手术。因此，在一些上述实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，在施用化疗、放疗、免疫疗法和/或手术之前、之中或之后进行给药。

在一些实施方案中，所述受试者可为人，其为(i)至少一种抗癌疗法难以治愈的，或(ii)在用至少一种抗癌疗法治疗后复发的，或(i)和(ii)两者。在一些实施方案中，所述受试者是至少两种、至少三种或至少四种抗癌疗法(包括，例如，标准或实验性的化疗)难以治愈的。

在一些实施方案中，所述受试者是至少一种、至少两种、至少三种或至少四种抗癌疗法(包括，例如，标准或实验性化疗)难以治愈的，所述抗癌疗法选自氟达拉滨、利妥昔单抗、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、烷化剂、阿仑单抗和其他化疗治疗，例如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)；R-CHOP(利妥昔单抗-CHOP)；hyperCVAD(超分割环磷酰胺(hyperfractionated cyclophosphamide)、长春新碱、多柔比星、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)；R-hyperCVAD(利妥昔单抗-hyperCVAD)；FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)；R-FCM(利妥昔单抗、氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)；硼替佐米和利妥昔单抗；坦西莫司和利妥昔单抗；坦西莫司和碘-131托西莫单抗和CHOP；CVP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)；R-CVP(利妥昔单抗-CVP)；ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)；R-ICE(利妥昔单抗-ICE)；FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥昔单抗)；FR(氟达拉滨、利妥昔单抗)；和D.T.PACE(地塞米松、沙立度胺、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷)。

其他化疗治疗(包括标准或实验性的化疗)的实例如下所述。此外，一些淋巴瘤的治疗在Cheson,B.D.,Leonard,J.P.,“Monoclonal Antibody Therapy for B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma”The New England Journal of Medicine 2008,359(6),第613-626页；和Wierda,W.G.,“Current and Investigational Therapies for Patients with CLL”Hematology 2006,第285-294页中讨论。美国的淋巴瘤发病模式在Morton,L.M等人，“Lymphoma Incidence Patterns by WHO Subtype in the United States,1992-2001”Blood 2006,107(1),第265-276页中进行概述。

例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)(尤其是B细胞来源的)的治疗包括使用单克隆抗体、标准化疗方法(例如，CHOP、CVP、FCM、MCP等)、放射性免疫疗法及其组合，特别是抗体疗法与化疗的结合。用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌症的非缀合单克隆抗体的实例包括利妥昔单抗、阿仑单抗、人或人源化的抗-CD20抗体、鲁昔单抗、抗-TRAIL、贝伐单抗、加利昔单抗(galiximab)、依帕珠单抗、SGN-40和抗-CD74。用于治疗非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌症的实验性抗体药物的实例包括奥法木单抗(ofatumumab)、ha20、PRO131921、阿仑单抗、加利昔单抗、SGN-40、CHIR-12.12、依帕珠单抗、鲁昔单抗、阿泊珠单抗、米拉珠单抗(milatuzumab)和贝伐单抗。用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌症的化疗的标准方案的实例包括CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)、FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)、CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)、MCP(米托蒽醌、苯丁酸氮芥和泼尼松龙)、R-CHOP(利妥昔单抗加CHOP)、R-FCM(利妥昔单抗加FCM)、R-CVP(利妥昔单抗加CVP)和R-MCP(R-MCP)。用于非霍奇金淋巴瘤/B细胞癌症的放射性免疫疗法的实例包括钇-90-标记的替伊莫单抗和碘-131-标记的托西莫单抗。

在另一实例中，套细胞淋巴瘤(MCL)的治疗性治疗包括组合的化学疗法，例如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)、hyperCVAD(超分割环磷酰胺、长春新碱、多柔比星、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷)和FCM(氟达拉滨、环磷酰胺、米托蒽醌)。此外，这些方案可补充有单克隆抗体利妥昔单抗(Rituxan)以形成组合疗法R-CHOP、hyperCVAD-R和R-FCM。其他方法包括将任意上述疗法与干细胞移植或用ICE(异环磷酰胺、卡铂和依托泊苷)的治疗相结合。治疗套细胞淋巴瘤的其他方法包括免疫疗法，例如使用单克隆抗体，如利妥昔单抗(Rituxan)。利妥昔单抗可用于治疗低侵袭性B细胞癌症，包括边缘区淋巴瘤、WM、CLL和小淋巴细胞性淋巴瘤。利妥昔单抗和化疗剂的组合是特别有效的。改进的方法是放射性免疫疗法，其中将单克隆抗体与放射性同位素颗粒组合(例如碘-131托西莫单抗和钇-90替伊莫单抗。在另一实例中，用于与CHOP进行连续治疗。另一免疫疗法实例包括使用癌症疫苗，其是基于个体患者肿瘤的基因构成。淋巴瘤疫苗的实例是GTOP-99治疗套细胞淋巴瘤的其他方法包括自体干细胞移植加上高剂量化疗，或者套细胞淋巴瘤的治疗包括给药蛋白酶体抑制剂，例如(硼替佐米或PS-341)，或血管生成抑制剂，例如沙立度胺，尤其是与Rituxan组合。另一治疗方法是施用引起Bcl-2蛋白降解并提高癌细胞对化疗的敏感性的药物，例如与其他化疗剂组合的奥利默森(Genasense)。另一治疗方法包括施用mTOR抑制剂，其可导致细胞生长的抑制和甚至细胞死亡；非限制性实例是坦西莫司(CCI-779)，和坦西莫司与或其他化疗剂组合。

治疗MCL的其他新近的疗法已被公开(Nature Reviews；Jares，P.2007)。这种实例包括夫拉平度(Flavopiridol)、PD0332991、R-roscovitine(Selicilib，CYC202)、苯乙烯基砜、Obatoclax(GX15-070)、TRAIL、抗-TRAIL DR4和DR5抗体、坦西莫司(CCl-779)、依维莫司(RAD001)、BMS-345541、姜黄素、伏立诺他(SAHA)、沙立度胺、来那度胺(lenalidomide，CC-5013)和格尔德霉素(17-AAG)。

用于治疗沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)的其他治疗剂的实例包括哌立福辛、硼替佐米利妥昔单抗、枸橼酸西地那非CC-5103、沙立度胺、依帕珠单抗(hLL2-抗-CD22人源化抗体)、辛伐他汀、enzastaurin、Campath-1H、地塞米松、DT PACE、奥利默森、抗瘤酮A10、抗瘤酮AS2-1、阿仑单抗、β-阿理新(beta alethine)、环磷酰胺、盐酸多柔比星、泼尼松、硫酸长春新碱、氟达拉滨、非格司亭、美法仑、重组干扰素-α、卡莫司汀、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、多拉司他汀10、铟In 111单克隆抗体MN-14、钇Y 90人源化依帕珠单抗、抗-胸腺细胞球蛋白、白消安、环孢菌素、甲氨蝶呤、麦考酚酸吗乙酯、治疗性的同种异体淋巴细胞、钇Y 90替伊莫单抗、西罗莫司、他克莫司、卡铂、噻替派、紫杉醇、阿地白介素、重组干扰素-α、紫杉醇、异环磷酰胺、美司钠、重组白介素-12、重组白介素-11、Bcl-2家族蛋白抑制剂ABT-263、地尼白介素(denileukin diftitox)、坦螺旋霉素(Tanespimycin)、依维莫司、聚乙二醇化的非格司亭、伏立诺他、alvocidib、重组的flt3配体、重组的人血小板生成素、淋巴因子激活的杀伤细胞、氨磷汀三水合物、氨基喜树碱、盐酸依立替康、乙酸卡泊芬净、氯法拉滨、阿法依伯汀、奈拉滨、喷司他丁、沙莫司亭、双酒石酸长春瑞滨、WT-1类似物肽疫苗、WT1 126-134肽疫苗、芬维A胺、伊沙匹隆(Ixabepilone)、奥沙利铂、单克隆抗体CD19、单克隆抗体CD20、ω-3脂肪酸、盐酸米托蒽醌、醋酸奥曲肽、托西莫单抗和碘I-131托西莫单抗、莫特沙芬钆(motexafin gadolinium)、三氧化二砷、替吡法尼(tipifarnib)、自体人肿瘤衍生的HSPPC-96、维妥珠单抗(veltuzumab)、苔藓抑素1和聚乙二醇化的脂质体盐酸多柔比星，及其任意组合。

用于治疗WM的治疗过程的实例包括外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓移植、抗体疗法、生物疗法、酶抑制剂疗法、全身辐射、输注干细胞、干细胞支持的骨髓消融、体外处理的外周血干细胞移植、脐带血移植、免疫酶技术、药理学研究、低-LET钴-60γ射线疗法、博来霉素、常规手术、放疗和非清髓性同种异体造血干细胞移植。

用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)药物疗法(Blood 2005Abramson，J.)的其他治疗剂的实例包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、抗-CD20单克隆抗体、依托泊苷、博来霉素、针对沃尔登斯特伦巨球蛋白血症列出的许多药剂及其任意组合，例如ICE和R-ICE。

用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)(Spectrum，2006，Fernandes，D.)的其他治疗剂的实例包括苯丁酸氮芥(Leukeran)、环磷酰胺(Cyloxan、Endoxan、Endoxana、Cyclostin)、氟达拉滨(Fludara)、喷司他丁(Nipent)、克拉屈滨(Leustarin)、多柔比星(Adriblastine)、长春新碱(安可平)、泼尼松、泼尼松龙、阿仑单抗(Campath，MabCampath)、针对沃尔登斯特伦巨球蛋白血症列出的许多药剂以及化疗和化学免疫疗法的组合，包括常规组合方案：CVP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)；R-CVP(利妥昔单抗-CVP)；ICE(异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)；R-ICE(利妥昔单抗-ICE)；FCR(氟达拉滨、环磷酰胺、利妥昔单抗)；和FR(氟达拉滨、利妥昔单抗)。

在又一方面，本发明提供了使受试者(例如，人)致敏的方法，所述受试者为(i)至少一种化疗治疗难以治愈的，或(ii)处于用化疗进行治疗后的复发中，或为(i)和(ii)二者，其中所述方法包括向所述受试者给药式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合。致敏的受试者是对治疗有响应的受试者，所述治疗涉及向受试者或尚未发展对这种治疗抵抗的受试者给药所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合。在本发明一个实施方案中，致敏的受试者是对治疗有响应的受试者，所述治疗涉及向受试者或尚未发展对这种治疗抵抗的受试者给药所述式I化合物或其药学上可接受的盐。

单一疗法和组合疗法

单一疗法

在一个方面，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，以单一疗法(即唯一治疗方案)给药至受试者(例如，人)。本发明提供了治疗方法，其中给药至受试者(例如，人)的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，是给药至所述受试者的唯一的抗癌治疗方案。本发明提供了治疗方法，其中将所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，给药至受试者(例如，人)，其中所述受试者不接受任何其他抗癌治疗。在一个变型中，所述受试者没有正在经历任何使用一种或多种PI3K抑制剂的其它抗癌治疗。在一些实施方案中，这种PI3K抑制剂可包括化合物A、B和C，其结构如下所提供。

在一个变型中，所述受试者不接受任何使用化合物A或其药学上可接受的盐的其他抗癌治疗。在另一变型中，所述受试者不接受任何使用化合物B或其药学上可接受的盐的其他抗癌治疗。在又一变型中，所述受试者不接受任何使用化合物C或其药学上可接受的盐的其他抗癌治疗。

在一些实施方案中，其中所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，作为单一治疗方案给药至所述受试者，所述受试者可为人，其为(i)至少一种化疗治疗难以治愈的，或(ii)在用至少一种抗癌疗法治疗后复发，或(i)和(ii)二者。在一些实施方案中，所述受试者为至少两种、至少三种或至少四种抗癌疗法(包括，例如，标准或实验性的化疗)难以治愈的。例如，在一些实施方案中，所述受试者可为人，其为(i)使用抗-CD20抗体、烷化剂(例如，苯达莫司汀)、嘌呤类似物(例如，氟达拉滨)、蒽环类抗生素或其任意组合的疗法难以治愈的；(ii)在用抗-CD20抗体、烷化剂(例如，苯达莫司汀)、嘌呤类似物(例如，氟达拉滨)、蒽环类抗生素或其任意组合治疗后复发的，或(i)和(ii)二者。

如上所述，至少一种抗癌疗法难以治愈的和/或在用至少一种抗癌疗法治疗后复发的人受试者可以已经接受了一种或多种先前疗法。在一些实施方案中，这种受试者在使用本文所述的方法之前(例如，在给药作为单一疗法的所述式I化合物或其药学上可接受的盐之前)已经接受了一种、两种、三种或四种，或至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种，或一至十种、一至九种、一至八种、一至七种、一至六种、一至五种或一至四种抗癌疗法。

应理解，当用所述式I化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，作为本文所述的单一治疗方案治疗受试者(例如人)时，所述受试者也可进行一种或多种非抗癌疗法的其他疗法。

在一些实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中：所述长春花生物碱选自长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和长春碱，且所述受试者为人，其(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。在一些其它实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中所述长春花生物碱选自长春新碱、长春地辛、长春瑞滨和长春碱，且其中进一步所述受试者为没有正在经历任何其它抗癌治疗的人；且所述受试者(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。

在一些实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中：所述长春花生物碱选自长春新碱和长春碱，且所述受试者为人，其(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。在一些其它实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中所述长春花生物碱选自长春新碱和长春碱，且其中进一步所述受试者为没有正在经历任何其它抗癌治疗的人；且所述受试者(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。

在一个实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中：所述长春花生物碱为长春新碱，且所述受试者为人，其(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。在一个其它实施方案，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中所述长春花生物碱为长春新碱，且其中进一步所述受试者为没有正在经历任何其它抗癌治疗的人；且所述受试者(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。

在一个实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中：所述长春花生物碱为长春碱，且所述受试者为人，其(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。在一个其它实施方案中，提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的式I的化合物或药学上可接受的盐，和治疗有效量的长春花生物碱或药学上可接受的盐，其中所述长春花生物碱为长春碱，且其中进一步所述受试者为没有正在经历任何其它抗癌治疗的人；且所述受试者(i)为至少一种抗癌治疗难以治愈的，或(ii)处于用至少一种抗癌治疗进行治疗后的复发中，或为其组合。

在其它实施方案中(其中式I的化合物或其药学上可接受的盐，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合作为单一治疗方案给药于受试者)，该受试者可具有17p缺失、TP53突变、NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失，或其任意组合。在一个实施方案中(其中式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，作为单一治疗方案给药于受试者)，该受试者具有17p缺失、TP53突变或其组合。在另一实施方案中(其中式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，作为单一治疗方案给药于受试者)，该受试者具有NOTCH1、SF3B1突变、11q缺失，或其任意组合。

其它组合疗法

本发明还提供了治疗方法，其中将给药至受试者(例如，人)的所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，与一种或多种额外的疗法(包括一种或多种上述抗癌疗法)进一步组合给予受试者(例如，人)。因此，在一些实施方案中，用于治疗有此需要的受试者(例如，人)的癌症的方法包括向所述受试者给药治疗有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，可与用于治疗所述癌症的一种或多种额外的疗法一起使用。所述一种或多种额外的疗法可包括给药一种或多种治疗剂。

在一些实施方案中，所述一种或多种额外的疗法涉及使用磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂，包括例如，化合物A、B和C，或这些化合物的药学上可接受的盐。

在上述方法的其他实施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，再与一种或多种额外的疗法组合)，所述一种或多种额外的疗法是除了使用化合物A、B和C或这些化合物的药学上可接受的盐的疗法之外的疗法。在上述方法的一个实施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，再与一种或多种额外的疗法组合)，所述一种或多种额外的疗法是除了使用化合物A或其药学上可接受的盐的疗法之外的疗法。在上述方法的其他实施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，再与一种或多种额外的疗法组合)，所述一种或多种额外的疗法是除了使用化合物B或其药学上可接受的盐的疗法之外的疗法。还在上述方法的其他实施方案中(其中涉及使用所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，再与一种或多种额外的疗法组合)，所述一种或多种额外的疗法是除了使用化合物C或其药学上可接受的盐的疗法之外的疗法。

在其他实施方案中，所述一种或多种额外的治疗剂可为赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)抑制剂和结合LOXL2的物质，包括例如，具有针对人LOXL2的免疫球蛋白IgG4同种型的人源化单克隆抗体(mAb)。

在其他实施方案中，所述一种或多种额外的治疗剂可为抗炎剂。使用所述一种或多种额外的治疗剂的治疗可在用本文所述药物组合物的治疗之前、同时或之后进行。在一些实施方案中，将本文所述药物组合物与另一治疗剂在单一剂型中组合，然后将其在本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐之前、同时或之后给药。可用于与至少一种本文所述的化学实体的组合中的合适的抗肿瘤治疗剂包括，但不限于，化疗剂，例如丝裂霉素C、卡铂、紫杉酚、顺铂、紫杉醇、依托泊苷、多柔比星或包含至少一种上述化疗剂的组合。放射治疗的抗癌剂也可单独使用或与化疗剂组合使用。

所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可用作化学致敏剂，并因此，当与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合时，可用于与其他化学治疗药物(尤其是，诱导细胞凋亡的药物)组合。

本发明还提供了用于提高癌细胞对化疗的敏感性的方法，其包括向进行化疗的受试者(例如，人)给药化疗剂以及式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，其与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合，其量足以提高癌细胞对所述化疗剂的敏感性。可与本文所述化学实体组合使用的其他化学治疗药物的实例包括拓扑异构酶I抑制剂(喜树碱或托泊替康)、拓扑异构酶II抑制剂(例如道诺霉素和依托泊苷)、烷化剂(例如环磷酰胺、美法仑和BCNU)、针对微管蛋白的药剂(例如紫杉酚和长春碱，或其它长春花生物碱)和生物制剂(例如抗体，例如抗CD20抗体、IDEC8、免疫毒素和细胞因子)。在用于提高癌细胞对化疗敏感性的方法的一个实施方案中，所述化疗剂是除了化合物A或其药学上可接受的盐之外的化疗剂。在用于提高癌细胞对化疗敏感性的方法的另一实施方案中，所述化疗剂是除了化合物B或其药学上可接受的盐之外的化疗剂。还在用于提高癌细胞对化疗敏感性的方法的另一实施方案中，所述化疗剂是除了化合物C或其药学上可接受的盐之外的化疗剂。

在一些实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，与(利妥昔单抗)或通过选择性耗竭CD20+B细胞起作用的其他药剂组合使用。

本发明包括的是治疗方法，其中将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，与长春花生物碱或其药学上可接受的盐的组合，与抗炎剂组合给药。抗炎剂包括但不限于NSAID、非特异性和COX-2特异性环氧合酶抑制剂、金化合物、皮质类固醇、甲氨蝶呤、肿瘤坏死因子受体(TNF)受体拮抗剂、免疫抑制剂和甲氨蝶呤。NSAID的实例包括，但不限于布洛芬、氟比洛芬、萘普生和萘普生钠、双氯芬酸、双氯芬酸钠和米索前列醇的组合、舒林酸、奥沙普秦、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、依托度酸、非诺洛芬钙、酮洛芬、萘丁美酮钠、柳氮磺吡啶、托美丁钠和羟氯喹。NSAID的实例还包括COX-2特异性抑制剂(即，抑制COX-2的化合物，其IC50最高是抑制COX-1的IC50的1/50)，例如塞来考昔、伐地考昔、芦米考昔、艾托考昔和/或罗非考昔。

在其他实施方案中，所述抗炎剂是水杨酸盐/酯。水杨酸盐/酯包括但不限于乙酰水杨酸或阿司匹林、水杨酸钠和水杨酸胆碱和水杨酸镁。所述抗炎剂还可为皮质类固醇。例如，所述皮质类固醇可选自可的松、地塞米松、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠和泼尼松。在一些实施方案中，所述抗炎剂是金化合物，例如硫代苹果酸金钠或金诺芬。在一些实施方案中，所述抗炎剂是代谢抑制剂，例如二氢叶酸还原酶抑制剂，例如甲氨蝶呤，或二氢乳清酸脱氢酶抑制剂，例如来氟米特。

在一些实施方案中，使用以下组合，其中至少一种抗炎化合物是抗-C5单克隆抗体(例如艾库组单抗(eculizumab)或培克珠单抗(pexelizumab))、TNF拮抗剂(例如依那西普)或英利昔单抗(其为抗-TNFα单克隆抗体)。

在一些实施方案中，使用以下组合，其中至少一种治疗剂是免疫抑制剂化合物，例如甲氨蝶呤、来氟米特、环孢菌素、他克莫司、硫唑嘌呤或麦考酚酸吗乙酯。

应理解，可使用上述额外治疗剂的任意组合，如同各种和每种组合被单独列出一样。例如，在一些实施方案中，所述额外的治疗剂包括PI3K抑制剂和LOXL2抑制剂，如simtuzumab。

给药方案和给药方式

在本文提供的方法中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物以治疗有效量给药以实现其预期目的。如本文所用，“治疗有效量”当涉及式I的化合物时，是足以调节Syk表达或活性的量，并从而治疗患有适应症的受试者(例如，人)，或改善或减轻该适应症的已有症状。例如，式I的化合物或其药学上可接受的盐的治疗有效量可为足以降低疾病或病症的症状的量，所述疾病或病症响应于抑制Syk活性。

在本文提供的方法中，式I的化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，以治疗有效量给药以实现其预期目的。如本文所述，“治疗有效量”当涉及长春花生物碱或其药学上可接受的盐时，为足以抑制微管蛋白生长或形成、或抑制或减少微管形成、或干扰纺锤体形成的量，从而治疗患有适应症的受试者(例如人)，或改善或减轻该适应症的已有症状。例如，长春花生物碱或其药学上可接受的盐的治疗有效量可为足以减少疾病或病症的症状的量，所述疾病或病症响应于抑制微管蛋白活性和/或形成。

治疗有效量的确定是在本领域技术人员能力范围内的，尤其在参考了本文提供的详细公开内容后。在一些实施方案中，治疗有效量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可(i)减少癌细胞数目；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓、并优选停止癌细胞浸润周围器官；(iv)抑制(例如，在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻一种或多种与所述癌症有关的症状。在各种实施方案中，所述量足以改善、缓和、减轻和/或延迟一种或多种癌症症状。

所述治疗有效量可根据所述受试者、所治疗的疾病或病症、所述受试者的体重和年龄、所述疾病或病症的严重性和给药方式而变化，其可由本领域技术人员容易地确定。

在本文提供的方法中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐与长春花生物碱或其药学上可接受的盐组合的给药方案可根据例如适应症、给药途径和该病症的严重性而变化。根据给药途径，可根据体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。最终给药方案是由主治医师根据良好的医疗实践进行确定，其中考虑了改变药物作用的各种因素，例如，所述化合物的特定活性、疾病状态的特性和严重性、患者的响应、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食，以及任何感染的严重性。可以被考虑的其他因素包括给药时间和频率、药物组合、反应敏感度和对疗法的耐受性/响应。本领域技术人员可常规地对适于使用本文所述任意制剂的治疗的剂量进行进一步细化，而无需过度实验，尤其参考了所公开的剂量信息和测定法以及在人临床试验中所观察到的药代动力学数据后。适当的剂量可通过使用已经建立的用于确定体液或其他样品中该药物的浓度以及剂量响应数据的测试法来确定。

所选定的制剂和给药途径可根据个体受试者、在所述受试者中待治疗的病症的性质和通常主治医师的判断进行制定。例如，所述式I化合物或其药学上可接受的盐的治疗指数，可通过以下增强：修饰或衍生所述化合物以用于靶向递送至表达标记物的癌细胞，所述标记物鉴别该细胞。例如，所述化合物可连接至抗体，所述抗体识别针对癌细胞的选择性或特异性标记物，以使所述化合物到达所述细胞的附近以在局部发挥其作用，如前文所述。参见例如，Pietersz等人，Immunol.Rev.，129:57(1992)；Trail等人，Science，261:212(1993)；和Rowlinson-Busza等人，Curr.Opin.Oncol.，4:1142(1992)。类似分析可适用于本发明的用长春花生物碱或其药学上可接受的盐的治疗和本文的方法。

给药方案

治疗有效量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可以以单一剂量或多剂量提供以实现所需的治疗终点。如本文所用，“剂量”是指受试者(例如，人)每次服用的活性成分(例如，所述式I化合物或其药学上可接受的盐)的总量。

用于人受试者的所述式I化合物或其药学上可接受的盐的示例性剂量可为约0.01mg至约1800mg，或约0.01mg至约1500mg，或约10mg至约1500mg，或约10mg至约1300mg，或约10mg至约1000mg，或约10mg至约800mg，或约10mg至约600mg，或约10mg至约300mg，或约10mg至约200mg，或约10mg至约100mg，或约100mg至约800mg，或约100mg至约600mg，或约100mg至约300mg，或约100mg至约200mg，或约200mg至约350mg，或约250mg至约300mg，或约200mg至约400mg，或约400mg至约600mg，或约400mg至约800mg，或约600mg至约800mg，或约800mg至约1200mg，或约1200mg至约1600mg，或约50mg至约200mg，或约25mg，约50mg，约75mg，约100mg，约125mg，或约150mg，或约175mg，约200mg，约250mg，约300mg，约350mg，约400mg，约450mg，约500mg，约550mg，约600mg，约650mg，约700mg，或约750mg，或约800mg，或约850mg，或约900mg，或约950mg，或约1000mg，或约1100mg，或约1200mg，或约1300mg，或约1400mg，或约1500mg，或约1600mg，或约1800mg。在一个实施方案中，在本文提供的方法中给药于受试者的式I的化合物或其药学上可接受的盐的剂量为约400mg。在一个实施方案中，在本文提供的方法中给药于受试者的式I的化合物或其药学上可接受的盐的剂量为约800mg。

在其他实施方案中，所提供的方法包括通过给药一定剂量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐来连续治疗受试者(例如，人)，其中该剂量实现了临床疗效，或通过递增至可维持疗效的水平来降低剂量。在具体实施方案中，所提供的方法包括向所述受试者(例如，人)给药所述式I化合物或其药学上可接受的盐的初始每日剂量(100mg至1000mg)，并给药后续每日剂量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，持续至少6天，其中各后续每日剂量以50mg至400mg增加。因此，还应理解，所述式I化合物或其药学上可接受的盐的剂量可通过递增来增加，直至达到临床疗效。可使用约25mg、约50mg、约100mg、或约125mg、或约150mg、或约200mg、或约250mg、或约300mg的递增量来增加该剂量。该剂量可每日增加一次、每隔一日增加一次、每周增加两次、增加三次、增加四次、增加五次或增加六次，或每周增加一次。

给药频率将取决于所施用化合物的药代动力学参数、给药途径和所治疗的具体疾病。剂量和给药频率也可取决于药代动力学和药效学，以及毒性和治疗有效性数据。例如，关于所述式I化合物或其药学上可接受的盐的药代动力学和药效学信息，可通过临床前的体外和体内研究收集，之后在人的临床试验过程中证实。因此，对于用于本文提供的方法中的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，治疗有效量可由生物化学和/或基于细胞的测试进行初始评估。然后，可在动物模型中调配剂量以实现所需的调节Syk表达或活性的循环浓度范围。由于进行了人研究，将获得关于各疾病和病症合适的剂量水平和治疗持续时间的进一步信息。

所述式I化合物或其药学上可接受的盐的毒性和疗效可在细胞培养物或实验动物中通过标准药学操作(例如，测定LD₅₀(致死50％群体的剂量)和ED₅₀(有效治疗50％群体的剂量))确定。毒性和疗效之间的剂量比率是“治疗指数”，其通常表示为比率LD₅₀/ED₅₀。呈现大的治疗指数(即，毒性剂量远高于有效剂量)的化合物是优选的。获自这种细胞培养测试和额外的动物研究的数据可用于配制人用剂量范围。这种化合物的剂量优选处于包括ED₅₀的循环浓度范围内，且具有很小毒性或没有毒性。

所述式I化合物或其药学上可接受的盐可在进食条件下给药。术语进食条件或其类似用语是指，在给药所述化合物或其药物组合物之前或同时，摄入或摄取了固体或液体形式的食物，或任意合适形式的卡路里。例如，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可在摄入卡路里(例如，一餐)的数分钟或数小时内给药至所述受试者(例如，人)。在一些实施方案中，所述式I化合物或其药学上可接受的盐，可在摄入卡路里的5-10分钟、约30分钟、或约60分钟内给药至所述受试者(例如，人)。

本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的治疗有效量，可以单剂量或多剂量提供以实现所需治疗终点。如本文所述，“剂量”是指被受试者(例如，人)每次服用的活性成分(例如，长春新碱或长春碱或其药学上可接受的盐)的总量。

用于人受试者的本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的示例性剂量，可为约0.01mg-M²至约3.0mg-M²，这取决于长春花生物碱的特性，或为约0.01mg-M²至约2.5mg-M²，或约0.01mg-M²至约2.0mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.9mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.8mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.7mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.6mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.5mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.4mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.3mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.2mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.1mg-M²，或约0.01mg-M²至约1.0mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.9mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.8mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.7mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.6mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.5mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.45mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.4mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.35mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.33mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.3mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.25mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.2mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.15mg-M²，或约0.01mg-M²至约0.01mg-M²，或约0.1mg-M²至约1.8mg-M²，或约0.15mg-M²至约1.7mg-M²，或约0.2mg-M²至约1.6mg-M²，或约0.25mg-M²至约1.5mg-M²，或约0.3mg-M²至约1.4mg-M²，或约0.33mg-M²至约1.3mg-M²，或约0.35mg-M²至约1.2mg-M²，或约0.4mg-M²至约1.1mg-M²，或约0.45mg-M²至约1.0mg-M²，或约0.5mg-M²至约0.9mg-M²，或约0.6mg-M²至约0.8mg-M²。在一个实施方案中，在本文提供的方法中给药于受试者的本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的剂量，为约1.5mg-M²。在一个实施方案中，在本文提供的方法中给药于受试者的本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的剂量，为约1.0mg-M²。在一个实施方案中，在本文提供的方法中给药于受试者的本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐的剂量，为约0.5mg-M²。

在其它实施方案中，提供的方法包括通过给药一定剂量的本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐继续治疗该受试者(例如，人)，其中在该剂量实现临床疗效，或通过递增至可维持疗效的水平来降低剂量。给药频率将取决于施用的化合物的药代动力学参数、给药途径和治疗的具体疾病。给药的剂量和频率也可取决于药代动力学和药效学、以及毒性和治疗功效数据。

给药方式

式I的化合物的药物组合物可以单剂量或多剂量，通过具有相似用途的药剂的任何可接受的给药方式进行给药，例如在被引入作为参考的那些专利和专利申请中所描述的，包括直肠、口腔、鼻内和经皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、胃肠外、肌内、皮下、口服、局部、作为吸入剂、或经由浸渍或涂覆装置(例如支架)或插入动脉的圆柱形聚合物而给药。

一种给药模式是胃肠外给药，特别是通过注射。其中可通过注射给药引入的所述式I化合物或其药学上可接受的盐的形式包括：水性或油性混悬液或乳液，其含芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、右旋糖，或无菌水溶液和类似的药物载剂。在盐水中的水溶液也可常规地用于注射。也可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持在分散情况下所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来维持合适的流动性。防止微生物的作用可通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

无菌可注射溶液通过以下制备：将所需量的本发明化合物掺入含有上文所列举的各种其他成分(根据需要)的合适的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散液通过以下制备：将各种灭菌的活性成分掺入无菌载剂中，含有基本分散介质和如上文所列举的那些所需的其他成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从之前无菌过滤的溶液中得到所述活性成分以及任何额外的所需成分的粉末。在一些实施方案中，对于胃肠外给药，制备无菌可注射溶液，其含有治疗有效量(例如，0.1至1000mg)的所述式I化合物或其药学上可接受的盐。但是，将理解，所述化合物实际给药的量通常将由医生根据有关情况来确定，包括所治疗的病症、所选定的给药途径、所给药的实际化合物及其相关活性、个体患者的年龄、体重和响应、所述患者症状的严重性等。

口服给药是给药所述式I化合物或其药学上可接受的盐的另一途径。给药可经由胶囊或肠溶包衣片剂等进行。在制备含有所述式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物时，通常将所述活性成分用赋形剂稀释和/或包封在载体中，所述载体可为胶囊、囊袋剂(sachet)、纸或其他容器的形式。当所述赋形剂用作稀释剂时，其可为固体、半固体或液体材料(如上述)的形式，其充当所述活性成分的载剂、载体或介质。因此，所述组合物可为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳液、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如高达10重量％所述活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、无菌可注射溶液和无菌包装粉剂的形式。

在口服制剂中合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。所述制剂还可包含：润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。

本文所述式I的化合物的药物组合物可采用本领域已知的步骤进行配制，以在给药至患者后提供所述活性成分的快速、持续或延迟释放。用于口服给药的控释药物递送系统包括渗透泵系统和溶出系统，其含有聚合物涂布的容器或药物-聚合物基质制剂。控释系统的实例提供在美国专利号3,845,770；4,326,525；4,902,514；和5,616,345中。另一用于本发明方法中的制剂采用了经皮递送装置(贴剂)。这种经皮贴剂可用于以控制量提供本发明化合物的连续或不连续输注。用于递送药剂的经皮贴剂的构造和使用是本领域熟知的。参见，例如，美国专利号5,023,252、4,992,445和5,001,139。这种贴剂可被构造为用于连续、脉冲或按需要递送药剂。

在一些实施方案中，将本文所述式I的化合物的组合物以单位剂型配制。术语“单位剂型”是指适合作为用于人受试者的单元剂量的物理分散单元，各单元含有预定量的活性物质(该预定量为经计算得到所需疗效的量)，以及合适的药物赋形剂(例如，片剂、胶囊、安瓿)。

在其他实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，以约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、或约1600mg、约1700mg、或约1800mg的单位剂量口服给药。在其他实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，以约200mg、约600mg、或约800mg、或约900mg、或约1200mg的单位剂量口服给药。在一些实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐，或其药物组合物，以约200mg或约800mg的单位剂量口服给药。

上述用于式I化合物口服给药的剂量可每日一次或每日两次(BID)进行给药。例如，在一些实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以约50mg BID、约100mg BID、约150mg BID、约200mg BID、约250mg BID、约300mg BID、约350mg BID、约400mg BID、约450mg BID、约500mg BID、约550mg BID、约600mg BID、约650mgBID、约700mg BID、约800mg BID、约900mg BID、约1100mg BID、约1200mg BID、约1300mg BID、约1400mg BID、约1500mg BID、或约1600mg BID、约1700mg BID、或约1800mg BID的单位剂量口服给药。在其他实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以约200mg BID、约400mg BID，或约600mg BID、或约800mg BID、或约1000mg BID的单位剂量口服给药。在一些实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以约200mg BID、或约800mg BID的单位剂量口服给药。在一个实施方案中，将所述式I化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以约800mg BID的单位剂量口服给药。

本发明的长春花生物碱或其药学上可接受的盐，通过IV给药。在一个实施方案中，所述长春花生物碱为硫酸长春新碱且小瓶的量为1mg/1ml。在一些实施方案中，所述长春花生物碱为硫酸长春新碱且小瓶为2ml，包含1mg或2mg硫酸长春新碱。在另一实施方案中，“硫酸长春新碱”，USP，为白色至灰白色粉末。其在甲醇中可溶，在水中易溶，但在95％乙醇中仅微溶。在98％乙醇中，硫酸长春新碱，USP，具有最大值在221nm的紫外线光谱(∈+47,100)。

“硫酸长春新碱注射剂”，USP，为无菌、无防腐剂的一次性使用溶液，其可在2mL(1mg和2mg)小瓶中用于静脉内应用。每mL包含1mg硫酸长春新碱USP、100mg甘露醇和注射用水(USP)。添加适量硫酸或氢氧化钠以控制pH。硫酸长春新碱注射(USP)的pH范围为4.0至5.0。

制品和试剂盒

包含所述式I化合物或其药学上可接受的盐的组合物(包括，例如，制剂和单位剂量)可在适当的容器中制备并放置，并标记为用于治疗指定病症。因此，还提供了制品，例如包含单位剂型的所述式I化合物或其药学上可接受的盐的容器和含该化合物使用说明的标签。在一些实施方案中，所述制品是包含单位剂型的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载剂的容器。在另一实施方案中，该制品为一种容器，其包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的单位剂型，以及含长春花生物碱或药学上可接受的盐的小瓶。

也考虑了试剂盒。例如，试剂盒可包含单位剂型的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，和含有所述组合物在治疗医学病症中的使用说明的药品说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒包含所述式I化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载剂的单位剂型，以及含长春花生物碱或药学上可接受的盐的溶液的小瓶。

在该试剂盒中的使用说明可为用于治疗癌症，包括，例如，恶性血液病或恶性实体瘤癌症。在一些实施方案中，在该试剂盒中的所述使用说明可为用于治疗癌症，例如白血病或淋巴瘤，包括复发和难治的白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，在该试剂盒中的所述使用说明可为用于治疗急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、低侵袭性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)、难治性iNHL、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)或边缘区淋巴瘤(MZL)。在一个实施方案中，在该试剂盒中的所述使用说明可用于治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一个实施方案中，所述NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)和边缘区淋巴瘤(MZL)。在一个实施方案中，所述恶性血液病是低侵袭性非霍奇金淋巴瘤(iNHL)。在一些实施方案中，在该标签中指明的疾病或病症可包括，例如，癌症的治疗。

在所述制品或所述试剂盒的一些实施方案中，式I的化合物的单位剂量具有约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、或约1600mg、约1700mg、或约1800mg的所述式I化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述单位剂量具有约400mg的所述式I化合物或其药学上可接受的盐。在所述制品或所述试剂盒的一个实施方案中，单位剂量的所述式I化合物或其药学上可接受的盐，是片剂。

实施例

包括以下实施例用以阐明本发明的实施方案，且所述实施例不旨在限定本发明的范围。本领域技术人员应理解，本文公开的技术表示的是用于实施本发明的技术。本领域技术人员将理解，根据本发明，在不脱离本发明的精神和范围内可对本发明的实施例进行修改。

实施例1

式I的化合物相比于多柔比星、长春新碱和环磷酰胺在10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中的效果

该实施例评估式I的化合物(图1)或其药学上可接受的盐，在10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中抑制恶性B-细胞活力的功效。该实施例还评估和比较了相比式I的化合物或其药学上可接受的盐的功效，在相同的10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中多柔比星、长春新碱和环磷酰胺抑制恶性B-细胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力测试：所有步骤在Branford的Gilead Sciences，Inc.进行，将式(I)的化合物、环磷酰胺、多柔比星和硫酸长春新碱溶于DMSO以制备储液，将其以1000X在DMSO中在96孔板格式中连续稀释3倍，从而各化合物的测试的最终起始分析浓度分别为10μM、200μM、10μM和1μM。将化合物板在没有血清或添加物的RPMI中稀释100倍，产生10X储液。在适合细胞系的100μl的生长培养基(补充有100U/L青霉素-链霉素)中将细胞以10,000–20,000细胞/孔接种在96-孔板中。OCI-Ly3、OCI-Ly4和OCI-Ly7在Iscove’s+20％FBS中生长，OCI-Ly19在αMEM+20％FBS中生长，且所有其它细胞系在RPMI+10％FBS中生长。向各孔以0.1％DMSO的终浓度添加11μl 10X化合物，且细胞在37℃在5％CO₂中培养72小时。细胞活力使用Cell Titer Glo(Promega，Madison，WI)按照制造商的方案在Envision读板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)评估。EC₅₀值使用4参数可变斜率模型通过GraphPad Prism 6.0软件测定。所有EC₅₀值表示来自一式两份的剂量响应曲线的平均值。结果报告于下表1。

表1总结了4种化合物的功效，分别在Cell Titer Glow测试中对各细胞系进行了测试。在浓度分别<3000nM和<10000nM时，式I的化合物的测试结果和环磷酰胺的测试结果没有在任一测试细胞系中显示抑制细胞活力。计算抑制细胞活力的多柔比星和长春新碱的EC₅₀值且其范围为分别为3.1-557nM和<1nM-103nM，如表1所示。

表1

实施例2

在10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中，式I的化合物与长春新碱的组合相对单独的长春新碱的效果的对比效果

该实施例评估了式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春新碱的组合，在10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中抑制恶性B-细胞活力的功效。该实施例还在相同的10个弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系、4个多发性骨髓瘤(MM)细胞系、2个滤泡性淋巴瘤(FL)细胞系和1个套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系中，评估和比较了长春新碱作为单一药剂抑制恶性B-细胞活力的功效，相比于式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春新碱的组合的功效。

Cell Titer Glo活力测试：所有步骤在Branford，CT的Gilead Sciences，Inc.进行。长春新碱作为单一药剂进行单独测试，或与300nM式I的化合物组合进行测试，在0.03-10nM范围内的4种浓度时显示该组合小于单一药剂对细胞活力的EC₅₀。将式I的化合物和硫酸长春新碱溶于DMSO以在分别的96孔板对各化合物制备1000X的储液，从而测试的最终起始分析浓度为300nM(式I的化合物)和10nM、3nM、1nM和0.3nM(长春新碱)。将化合物板在不含血清或添加物的RPMI中连续稀释100倍并混合在一起以创建组合或单一药剂在2％DMSO中的10X储液。将细胞以10,000–20,000细胞/孔接种在96孔板中适合细胞系的100μl生长培养基中，该生长培养基补充有100U/L青霉素-链霉素。OCI-Ly3、OCI-Ly4和OCI-Ly7在Iscove’s+20％FBS中生长，OCI-Ly19在αMEM+20％FBS中生长，且所有其它细胞系在RPMI+10％FBS中生长。在含有细胞的每个孔中，以0.2％DMSO的终浓度添加11μl的无血清培养基中的10X化合物混合物，并将细胞在37℃ 5％CO₂中培育72小时。细胞活力按照制造商的方案在Envision读板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)评估。记录单独化合物处理和组合的CTG信号。结果示于下图2。

图2详细描述在代表4种血液癌症类型：DLBCL、MM、FL和MCL的17个恶性B细胞系中式I化合物(图1)与长春新碱的组合相对于单独使用长春新碱(图2)的抑制效果。

实施例3

在恶性DLBCL B-细胞系DHL-10中，式I的化合物与长春新碱的组合相对式I的化合物与A)考布他汀(obretastatin)A4、B)秋水仙碱、C)多柔比星和D)紫杉醇的组合的效果的对比效果

该实施例评估式I的化合物(图1)或其药学上可接受的盐与长春新碱的组合在恶性弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系DHL-10中抑制恶性B-细胞活力的功效。该实施例还评估和比较了，相比于式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春新碱组合的功效，式I的化合物或其药学上可接受的盐与A)考布他汀(cobretastatin)A4、B)秋水仙碱、C)多柔比星和D)紫杉醇的组合，在恶性弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系DHL-10中抑制恶性B-细胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力测试：所有步骤在Branford，CT的Gilead Sciences，Inc.进行。将长春新碱、考布他汀A4、秋水仙碱、多柔比星和紫杉醇溶于DMSO中以制备储液，将1000X的储液在96孔板格式中，在DMSO中连续稀释3倍，从而，除了多柔比星从10μM开始以外，所有化合物的测试的最终起始分析浓度为1μM。将化合物板在不含血清或添加物，但含有1％DMSO或3μM式I化合物的RPMI中稀释100倍以创建10X储液。将DLBCL细胞系DHL-10以每孔10,000个细胞接种在补充有10％FBS和100U/L青霉素-链霉素的RPMI中。在包含细胞的每个孔中，以0.2％DMSO的终浓度添加11μl无血清的培养基中的10X化合物混合物，并将细胞在37℃ 5％CO₂中培育72小时。按照制造商的方案，在Envision读板器(Perkin Elmer，Waltham，MA)上使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)评估细胞活力。记录单独化合物处理和组合的CTG信号。使用四参数可变斜率模型，以GraphPad Prism 6.0软件测定EC₅₀值。结果显示于图2中。单独化合物或与300nM式I化合物的组合抑制存活DHL-10细胞的EC₅₀值的变化显示于表2中。

图3总结了式I的化合物和长春新碱的组合相对式I的化合物和考布他汀A4、式I的化合物和秋水仙碱，式I的化合物和多柔比星、以及式I的化合物和紫杉醇的组合的效果。

表2

实施例4

在恶性DLBCL B-细胞系DHL-10中式I的化合物与长春新碱的组合相比式I的化合物与长春碱的组合的对比效果

该实施例评估了式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春新碱的组合在恶性弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系DHL-10中抑制恶性B-细胞活力的功效。该实施例还评估和比较了式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春碱的组合在恶性弥漫型大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系DHL-10中抑制恶性B-细胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力测试：单独测试3nM的长春新碱和长春碱，或测试其与100nM式I的化合物的组合。将式I的化合物、硫酸长春碱和硫酸长春新碱溶于DMSO中，以在分别的96孔板制备各化合物1000X的储液，从而使式I化合物的最终起始分析浓度为100nM，而长春碱和长春新碱的浓度为3nM。将化合物板在不含血清或添加物的RPMI中连续稀释100倍并混合在一起以创建在2％DMSO中的组合或单一药剂的10X储液。将DHL-10细胞以10,000细胞/孔接种在96孔板中的100μl的RPMI+10％FBS(补充有100U/L青霉素-链霉素)中。在包含细胞的每个孔中，以终浓度为0.2％DMSO添加11μl无血清培养基中的10X化合物混合物，并将细胞在37℃ 5％CO₂中培育72小时。细胞活力使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)按照制造商的方案评估，且在Envision读板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)读取。记录单独化合物处理和组合的CTG信号。结果示于图4。

图4描绘和总结了当化合物共同给药时，图1化合物(式I的化合物)和两种长春花生物碱之一(分别为长春新碱和长春碱)的组合，在DLBCL细胞系DHL-10中的抑制作用(图4)。

实施例5

在表达Syk的实体瘤细胞系中式I的化合物与长春新碱的组合相对在不表达Syk的实体瘤细胞系中式I的化合物与长春新碱的组合的对比效果

该实施例评估式I的化合物或其药学上可接受的盐与长春新碱的组合在表达Syk的胰腺细胞系MIA PaCa-2中抑制细胞活力的功效。该实施例也评估了式I的化合物和长春新碱的组合在不表达Syk的细胞系HepG2中抑制细胞活力的功效。

Cell Titer Glo活力测试：在恶性胰腺细胞系MIA PaCa-2和肝细胞癌HepG2细胞系中，长春新碱被单独测试，或与4种浓度的式I的化合物(300nM、100nM、33nM和11nM)组合测试。将式I的化合物和硫酸长春新碱溶于DMSO以在分别的96孔板中制备各化合物1000X的储液，从而式I的化合物测试的最终起始分析浓度为300-11nM，而长春新碱的浓度为3nM。将化合物板在不含血清或添加物的RPMI中连续稀释100倍并混合在一起以创建组合或单一药剂在2％DMSO中的10X储液。将MIA PaCa-2和HepG2细胞以5,000细胞/孔接种在96孔板中的100μl的RPMI+10％FBS(补充有100U/L青霉素-链霉素)中。在包含细胞的每个孔中，以终浓度为0.2％DMSO添加11μl无血清培养基中的10X化合物混合物，并将细胞在37℃ 5％CO₂中培育72小时。细胞活力使用Cell Titer Glo(CTG，Promega，Madison，WI)按照制造商的方案在Envision读板器上(Perkin Elmer，Waltham，MA)评估。记录单独化合物处理和组合的CTG信号。结果示于图5。

图5总结了在表达Syk的恶性胰腺细胞系MiaPaca中(图5a)和在不表达Syk的恶性结肠细胞系HepG2中(图5b)式I的化合物和长春新碱的组合对细胞活力的抑制。

Syk蛋白测试：将细胞系在补充有10％FBS和100U/L青霉素-链霉素的RPMI中对数生长过夜。经由在室温下，以300x g离心8分钟在50mL管中收集1x 10⁷个细胞。在冰上，在200uL的含有蛋白酶(Roche，Palo Alto CA)和磷酸酶抑制剂(Sigma，Saint Louis MO；Santa Cruz Technologies，Dallas TX)的1X RIPA缓冲液(Cell Signaling Technology，Danvers MA)中将细胞团块裂解15分钟。将溶胞产物转移至V形底96孔板中并直接使用或在-80℃冷冻以供第二天使用。以4-12％SDS-Bis/Tris凝胶分离蛋白质并在硝基纤维素上进行印迹(blotted)。在Rockland Odyssey阻断缓冲液中阻断印迹并与总Syk抗体4D10(Santa Cruz)和pSyk-Y_525/6(Cell Signaling Technologies)一起培育。将一抗稀释1000倍并在室温下培育1小时。在含有1.0％Tween的Tris缓冲的盐水(TBS-T)中清洗印迹3次，清洗5分钟。然后，将印迹与山羊α小鼠IgG(H+L)、AlexaFluor 680(Life Sciences公司)和山羊α兔IgG(H+L)、DyLight 800(Thermo Scientific)(各自在阻断缓冲液中稀释20,000倍)在室温下培育1小时。将印迹在TBS-T中清洗3次，清洗5分钟，并在Odyssey凝胶成像仪(LI-COR)上进行分析。

图6描绘了在MiaPaca和HepG2恶性结肠细胞系中的Syk表达水平(图6)。

实施例6

在一些恶性实体瘤细胞系中Syk表达的测定

(图7)

Syk蛋白测试：将细胞系对数生长过夜，且经由在室温下以300x g离心8分钟在50mL管中收集1x 10⁷个细胞。在冰上，在200uL的含有蛋白酶(Roche，Palo Alto CA)和磷酸酶抑制剂(Sigma，Saint Louis MO；Santa Cruz Technologies，Dallas TX)的1X RIPA缓冲液(Cell Signaling Technology，Danvers MA)中将细胞团裂解15分钟。将溶胞产物转移至V形底96孔板中并直接使用或在-80℃冷冻以供第二天使用。以4-12％SDS-Bis/Tris凝胶分离蛋白质并在硝基纤维素上进行印迹。在Rockland Odyssey阻断缓冲液中阻断印迹并与总Syk抗体4D10(Santa Cruz)一起培育。将一抗稀释1000倍并在室温下培育1小时。在含有1.0％Tween的Tris缓冲的盐水(TBS-T)中清洗印迹3次，清洗5分钟。然后，将印迹与山羊α小鼠IgG(H+L)、AlexaFluor680(Life Sciences公司)(在阻断缓冲液中稀释20,000倍)在室温下培育1小时。将印迹在TBS-T中清洗3次，清洗5分钟，并在Odyssey凝胶成像仪(LI-COR)上进行分析。参见图7。

实施例7

在弥漫性大B细胞淋巴瘤的SU-DHL-10小鼠异种移植模型中评估entosplentinib和长春新碱单独及组合时的功效

在雄性SCID米色鼠的皮下细胞系肿瘤异种移植模型中使用人弥漫型大B细胞淋巴瘤细胞系SU-DHL-10，在entosplentinib和长春新碱的2x 2的剂量水平矩阵中评估作为单一药剂的entosplentinib及entosplentinib与长春新碱的组合在体内的功效。

制剂-在0.5％HPMC-0.2％Tween 80(pH 3.5，50mM醋酸盐缓冲液，而较低剂量通过直接稀释制备)的完全载剂中配制entosplentinib。使用搅拌棒混合高剂量制剂(且依需要，短暂地高速均质化(polytroned)以破裂化合物团块)以形成黄色溶液(pH＝1.8)，此黄色溶液在30分钟内变成不透明悬浮液。每天新鲜制备给药用悬浮液并在治疗之间贮存在4℃下，避免光照。

以0.9％无菌盐水稀释该储液以制备长春新碱的最高剂量组的制剂，而较低剂量通过以盐水直接稀释该储液来制备。该高剂量制剂的pH值为7.08。该给药制剂是在每次治疗前现场制备。

动物-本研究使用雄性Harlan SCID米色鼠(C.B-17/IcrHsd-Prkdc^scidLyst^bg-J)。在实验第1天这些小鼠为6-7周龄，且被喂食可自由采食的经照射的Harlan 2918.15啮齿类动物的食物及水。将动物饲养在静态笼子内，此静态笼子的Clean Room内具有Bed-O’Cobs^TM寝具(The Andersons Lab Bedding Products)，该Clean Room向气泡环境中提供H.E.P.A.过滤空气，每小时进行100次的全室换气(complete air changes)。所有治疗、体重测定及肿瘤测量均在气泡环境中进行。将环境控制在70°±2°F的温度范围及30-70％的湿度范围内。

细胞-从Leibniz Institute DSMZ-德国微生物和细胞培养保藏中心(DSMZ)取得SU-DHL-10细胞。将其生长在RPMI 1640培养基中，此RPMI 1640培养基以1％100mM丙酮酸钠、1％1M HEPES缓冲液、1％的45％葡萄糖溶液改性并补充有10％非经热灭活的胎牛血清(FBS)和1％100X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(PSG)。将生长环境保持在37℃具有5％CO₂气氛的培育箱中。将细胞在8℃200rcf离心8分钟，吸除上清液并通过移液来将小团块重新悬浮在冷Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。以台盼蓝溶液稀释均质细胞悬浮液的等分试样并使用Luna自动细胞计数器计数。植入前细胞活力为91％。将细胞悬浮液在8℃，200rcf离心8分钟。吸出上清液并将细胞团块重新悬浮在冷的50％无血清培养基:50％Matrix(Corning)中使得最终浓度为2.5E+07个细胞/ml。在植入期间将细胞悬浮液保持在湿冰上。植入后，用台盼蓝溶液稀释该剩余细胞的等分试样并计数以测定植入后的细胞活力(91％)。在第0天，使用27号针及注射器经由皮下途径在试验动物的高腋部(刚好在前肢下方)植入在0.2ml的50％无血清培养基:50％Matrix中的5.0x 10⁶个细胞。

根据肿瘤负荷(由测径器测量进行估计)将所有小鼠分至各研究组。在治疗期间和治疗之后通过监测肿瘤体积/重量来评估效力。使用测径器测量，每周测量肿瘤负荷(mg)三次并通过长椭球的体积公式将其转换为肿瘤质量，假设单位密度为：

肿瘤负荷(mg)＝(L x W²)/2

其中L和W分别为正交肿瘤长度和宽度测量值(mm)。

本研究中分布成功的标准为，所有组的平均肿瘤负荷为研究群体的整体平均肿瘤负荷的10％之内。第16天开始治疗时整体平均肿瘤负荷为197mm³。

组1：载剂对照(entospletinib)在50mM乙酸盐缓冲液中的0.5％HPMC、0.2％Tween 80，pH 3.5，每12小时口服给药一次，保持19天(16-32天)，且载剂对照(长春新碱)的0.9％盐水从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组2：Entosplentinib以每12小时75mg/kg口服给药，保持6.5天(第16-22天)；然后降低至每12小时50mg/kg，保持10.5天(第22-32天)，组合有盐水，其每7天静脉内给药一次，从口服给药第三天开始(第18、25和32天)。

组3：Entosplentinib以每12小时25mg/kg口服给药，保持19天(第16-32天)，组合有盐水，其从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组4：Entosplentinib的载剂每12小时口服给药一次，保持19天(第16-32天)，组合有长春新碱，其以0.5mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组5：Entosplentinib的载剂每12小时口服给药一次，保持19天(第16-32天)，组合有长春新碱，其以0.15mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组6：Entosplentinib以每12小时75mg/kg口服给药一次，保持6.5天(第16-22天)；然后由于体重损失降低至每12小时50mg/kg，保持10.5天(第22-32天)，组合有长春新碱，其以0.5mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组7：Entosplentinib以每12小时25mg/kg口服给药，保持19天(第16-32天)，组合有长春新碱，其以0.5mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组8：Entosplentinib以每12小时75mg/kg口服给药，保持6.5天(第16-22天)；然后降低至每12小时50mg/kg，保持10.5天(22-32天)，组合有长春新碱，其以0.15mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

组9：Entosplentinib以每12小时25mg/kg口服给药，保持19天(第16-32天)，组合有长春新碱，其以0.15mg/kg从口服给药第三天开始每7天静脉内给药一次(第18、25和32天)。

所有小鼠根据治疗那天的个体体重给药(0.1ml/20g)。

在肿瘤植入后第16天，具有确定肿瘤的动物(每组n＝9只动物)通过以75mg/kg或25mg/kg每天两次(BID)的剂量口服管饲载剂或entosplentinib，以此治疗3天。在第三天，动物接受盐水或长春新碱的静脉内给药，且在给药后0.5、2或12小时收集血浆和肿瘤样品。另外12只动物/组通过以计划的剂量水平(25mg/kg和75mg/kg BID)口服管饲载剂或entosplentinib，这样治疗19天(在研究第16天开始)，并在开始给药entosplentinib后的第三天(研究的第19天)开始每7天一次(Q7D)经由静脉内给药盐水或长春新碱(0.5mg/kg和0.15mg/kg)，共3个剂量。给药75mg/kg BID的entosplentinib剂量水平，共6.5天，随后由于在给药第三天所收集的血浆样品中所测得的血浆浓度高于计划的血浆浓度且在以0.5mg/kg长春新碱共同治疗的组中体重减轻，因而将剂量降至50mg/kg BID。此剂量水平被指定为75/50mg/kg。

通过测量肿瘤体积来评估效力。在给药entosplentinib的第三天(第19天)及给药的最后一天(第32天)评估entosplentinib和长春新碱的血浆水平。通过每日观察、体重(每周3次)和研究结束时循环血液细胞计数来评估耐受性。

75mg/kg的entosplentinib剂量降低至50mg/kg后，所有评估的剂量水平和组合均能被耐受。25和50mg/kg BID的entosplentinib剂量导致研究结束时血浆浓度分别超过在体外过钒酸盐剌激的小鼠中抑制SYK的全血EC₅₀和EC₈₀值(在C_min(波谷)时)。给药0.15和0.5mg/kg长春新碱均导致肿瘤生长明显受抑制。单独给药25或75/50mg/kg的entosplentinib可抑制肿瘤生长，但程度低于使用长春新碱时所见到的程度。

添加75/50mg/kg水平的entosplentinib导致对肿瘤生长抑制显著改善，超越单独使用长春新碱时的抑制效果，在0.5mg/kg长春新碱剂量下，肿瘤生长抑制％(TGI)从85％增加至96％，而在0.15mg/kg长春新碱剂量下，％TGI从42％增加至71％。在任一剂量的长春新碱中添加25mg/kg的entosplentinib不会显著增加对肿瘤生长的抑制。而接受作为单一药剂的entosplentinib或长春新碱的组并未完全或部分消退，接受75/50mg/kg entosplentinib与0.5mg/kg长春新碱的组合的小鼠中有50％具有部分响应且有8％完全消退，并有8％在研究结束时无肿瘤。单独的entosplentinib和长春新碱，以及二者的组合的肿瘤生长抑制和耐受性总结于下表中。

耐受剂量的entosplentinib和长春新碱的功效的总结

a肿瘤生长抑制的百分比(％TGI)通过以下计算，用治疗的肿瘤平均值的δ除以对照肿瘤平均值的δ(以百分比表示)，然后从100％减去。

b NA不适用，因为此为对照。

向携带SU-DHL-10皮下异种移植物的动物给药entosplentinib与长春新碱的组合，其显示，引起SYK的经计算的EC₈₀波谷覆盖范围(trough coverage)的一定剂量的entospletinib导致对肿瘤生长抑制的显著增加，且部分肿瘤消退增加至50％(相比之下，单独的entospletinib或长春新碱治疗的对应数据为0％)，其中8％完全消退。