本发明涉及一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，属药物制剂技术领域。
背景技术：
多柔比星(DOX)是一种由放线菌目的链霉菌产生的具有蒽环的糖苷类抗生素，其化学结构中均具有亲脂性的蒽环配基，且六元环侧链具有1个亲水性的氨基糖，结构式如式I所示。多柔比星作为一类肿瘤细胞周期非特异性抗癌药物，可直接嵌入各期肿瘤细胞DNA碱基对之间，并与DNA小沟区发生静电结合，不可逆地破坏DNA三级结构，干扰其转录过程，抑制mRNA和DNA合成，进而引起细胞死亡或停滞于S期，G2期，表现出极强的抗癌活性。作为临床应用最多的广谱抗肿瘤药物，对乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌等多种实体肿瘤均具有显著疗效，在肿瘤治疗中发挥重要作用。
然而，盐酸多柔比星在临床广泛用作抗肿瘤药物发挥药理作用的同时，也存在一系列需要克服的问题。盐酸多柔比星给药后血浆半衰期极短，且存在严重的骨髓抑制及心脏毒性等全身不良毒副作用，以及反复给药引起的肿瘤多药耐药性等缺点，均可导致其治疗指数偏低，很大程度上限制了其临床应用。因此，如何利用药物输送手段提高药物的肿瘤靶向性和降低药物的毒副作用，并克服肿瘤细胞的多药耐药成为目前抗肿瘤制剂研究的主要方向。
专利(公开号CN103655588A)公开了一种含盐酸多柔比星的冻干粉针剂，该组合物避免盐酸挥发，改善了盐酸多柔比星冻干粉针剂的复溶性能，但是并不能改善其靶向性差及毒副作用大的缺点。专利(公开号CN103919722A)公开了一种多柔比星脂质体组合药物，该组合药物虽能在一定程度上提高药物的吸收利用，但其稳定性不够好，常发生泄漏易产生聚集沉淀，影响生物利用度的提高；另外，该工艺步骤复杂，生产费用高。专利(公开号CN102225052A)公开了一种pH敏感多柔比星纳米脂质体，该脂质体由盐酸多柔比星、磷脂、胆固醇、维生素E、冻干赋形剂、羧甲基壳聚糖等组成。其所包覆的盐酸多柔比星的含量较高，且具有pH敏感性和长循环主动靶向给药功能。但仍具有脂质体的缺点，即稳定性差。
针对上述问题，本发明人提供了一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒(DOX-PLGA NPs)的制备方法，通过在负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子表面进行迭层自组装，达到在增强药物选择性及药效、降低药物毒性、减少给药频率等优势的同时提高药物稳定性，延缓药物的在体释放时间；通过改变PLGA纳米粒表面疏水特性，赋予其表面良好的亲水性，使其在体循环中停留较长时间而增加入靶机会。同时实现对PLGA纳米粒子药物释放的调控作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服盐酸多柔比星(DOX)药物靶向性差，毒副作用大的缺点；在于克服盐酸多柔比星PLGA纳米粒因其表面亲脂特性而药物利用度低且释放过程中有明显突释的缺点。本发明提供了一种通过改变PLGA纳米粒表面疏水特性，赋予其表面良好的亲水性，使其在体循环中停留较长时间而增加入靶机会；同时实现对PLGA纳米粒子药物释放的调控作用的方法。
本发明的第一个技术问题是制备一种负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子，其制备方法为：精密称取一定量盐酸多柔比星，以250μL去离子水完全溶解作为内水相；精密称取一定量PLGA，以2mL有机试剂(二氯甲烷/乙酸乙酯/丙酮/二氯甲烷与丙酮的混合溶液)震荡溶解作为有机相；将内水相加入溶有PLGA的有机相中，冰浴中超声乳化分散一定时间(t1)，形成初乳(W/O)；将初乳加入含有一定浓度乳化剂F68的溶液中，迅速震荡均匀，冰浴中超声乳化分散一定时间(t2)，形成复乳(W/O/W)；加入0.3％F68连续相15mL，室温下磁力低速搅拌一定时间(t3)，挥发有机试剂；低温高速离心(12000×g，30min，4℃)收集纳米粒，以去离子水反复重悬离心洗涤3次后，制得DOX-PLGA NPs。
上述纳米粒制备方案中，油相种类为二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮中的一种或几种。
上述纳米粒制备方案中，PLGA的浓度为5～50mg/mL；乳化剂用量为0.25％～2％；药载比为1∶25～1∶200；内水相与油相体积比为1∶2～1∶16；初乳超声时间为3～15min；复乳超声时间为8～20min；搅拌挥发时间为2～8h。
本发明的第二个技术问题是天然聚电解质壳聚糖(CHI)和海藻酸(ALG)在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装，其制备方法为：向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时分别加入4mL含有一定浓度NaCl的壳聚糖溶液(2mg/mL)，于一定温度水浴孵育一定时间后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入含有一定浓度NaCl的一定浓度ALG溶液，恒温水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，得到包覆不同层数聚电解质的纳米粒子。
上述迭层自组装纳米粒制备方案中，吸附平衡时间为5～30min；聚电解质浓度为0.5～2mg/ml；NaCl溶液浓度为0～0.5mol/L；自组装温度为15～37℃；包裹的聚电解质层数为1～6层。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明和具体阐述，但本发明的保护内容并不限于下述实施例。
实施例1：
一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，它含有下列步骤：
1)制备负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子：精密称取1mg盐酸多柔比星，以250μL去离子水完全溶解作为内水相；精密称取50mg PLGA，以2mL二氯甲烷与丙酮的混合溶液(v/v＝1∶1)震荡溶解作为有机相；将内水相加入溶有PLGA的有机相中，冰浴中超声乳化分散6～10min，形成初乳(W/O)；将初乳加入含有0.5％乳化剂F68的溶液中，迅速震荡均匀，冰浴中超声乳化分散12min，形成复乳(W/O/W)；加入0.3％F68连续相15mL，室温下磁力低速搅拌4h，挥发有机试剂；低温高速离心(12 000×g，30min，4℃)收集纳米粒，以去离子水反复重悬离心洗涤3次后，制得DOX-PLGA NPs。
制得的DOX-PLGA NPs平均粒径为(171.2±5.3)nm，平均包封率为(73.16±0.43)％，平均载药量为(1.51±0.07)％。
2)天然聚电解质壳聚糖和海藻酸在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装：配制2mg/mL的ALG溶液(0.5M NaCl)。向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时加入4mL浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液(0.5M NaCl)，于37℃水浴孵育20min后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入4mL浓度为0.5，1，2mg/mL的ALG溶液(0.5M NaCl)，恒温水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，直至吸附3个双层为止。
实施例2
一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，它含有下列步骤：
1)制备负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子：其制备方法与实施例1中相同。
2)天然聚电解质壳聚糖和海藻酸在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装：配制含有0.5M NaCl的ALG溶液(2mg/mL)。向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时加入4mL含有0.5M NaCl的壳聚糖溶液(2mg/mL)，于37℃水浴孵育20min后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入含有0.5M NaCl的ALG溶液(2mg/mL)，恒温水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，直至吸附3个双层为止。
实施例3
一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，它含有下列步骤：
1)制备负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子：其制备方法与实施例1中相同。
2)天然聚电解质壳聚糖和海藻酸在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装：向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时加入4mL的壳聚糖溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴孵育20min后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入4mL的ALG溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，直至吸附1个双层为止。
实施例4
一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，它含有下列步骤：
1)制备负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子：其制备方法与实施例1中相同。
2)天然聚电解质壳聚糖和海藻酸在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装：向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时加入4mL的壳聚糖溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴孵育20min后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入4mL的ALG溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，直至吸附2个双层为止。
实施例5
一种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒的制备方法，它含有下列步骤：
1)制备负载盐酸多柔比星的乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子：其制备方法与实施例1中相同。
2)天然聚电解质壳聚糖和海藻酸在DOX-PLGA NPs表面迭层自组装：向离心管中加入2mL的DOX-PLGA NPs溶液，同时加入4mL的壳聚糖溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴孵育20min后高速离心去上清，并清洗；以2mL去离子水重悬纳米粒，加入4mL的ALG溶液(2mg/mL，0.5M NaCl)，于37℃水浴吸附相同时间后高速离心。如此完成一个双层循环，重复上述操作，直至吸附3个双层为止。
对于这种表面迭层自组装盐酸多柔比星共聚物纳米粒，我们制定了如下评价方法：
1)粒径及分布的测定
取DOX-PLGA NPs和聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs胶体溶液，以5％葡萄糖溶液稀释至适当浓度，于25℃下以激光散射粒径分析仪测定，每个样品重复测定3次，分别记录粒径、多分散系数各均值。
测得DOX-PLGA NPs粒径为172.3±3.9nm，多分散性系数为0.156±0.002；聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs粒径为196.3±6.7nm，多分散性系数为0.179±0.007。
2)渗透压的测定
取DOX-PLGA NPs和聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs胶体溶液，以5％葡萄糖溶液稀释至适当浓度，测定溶液渗透压。
测得DOX-PLGA NPs渗透压为302mOsm/kg；聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs渗透压为311mOsm/kg。
3)zeta电位的测定
取DOX-PLGA NPs和聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs胶体溶液，以5％葡萄糖溶液稀释至适当浓度，于25℃下以zeta-电位分析仪测定，每个样品重复测定3次，分别记录电位各均值。
测得DOX-PLGA NPs表面zeta电位为-30.48mV；聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs壳聚糖层的平均zeta电位为+36.26mV，海藻酸层的平均zeta电位为-43.3mV。
4)DOX-PLGA NPs及聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs的形态学表征
透射电镜法
取DOX-PLGA NPs和聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs胶体溶液，以去离子水稀释至适当浓度，吸取样品10μL置于铜网上，室温下干燥后在透射电子显微镜下观测其形态并拍照。
具体照片见附图。
5)体外释药行为的研究
①包覆不同层数聚电解质的DOX-PLGA NPs的释药行为
分别称取DOX-PLGA NPs、DOX-PLGA(CHI/ALG)NPs、DOX-PLGA(CHI/ALG)2NPs、DOX-PLGA(CHI/ALG)3NPs各三份，加入等渗磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)1mL，37℃下恒温振荡(100rpm)。定时取样，高速离心后收集上清液，再补加等量的新鲜PBS。用紫外分光光度法在波长480nm处测定吸光度，计算药物累积释放百分率，考察聚电解质层数对药物释放的影响。将1h处的药物累计释放百分率定义为药物突释；将50％药物累积释放百分率处所对应的的释放时间定义为药物释放半衰期(t1/2)。
测定结果如下表：
结果显示，与裸DOX-PLGA NPs的释放相比，经过聚电解质包覆的纳米粒，其药物突释明显降低；并且随着壳聚糖/海藻酸层数的增加，DOX的释放速率及累积释放百分率逐渐降低；且半衰期增大。以上现象表明，在纳米粒表面进行天然聚电解质迭层包覆不仅可以降低药物突释，而且还可以延长药物释放时间。
②聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs在不同pH介质中的释药行为
称取三份DOX-PLGA(CHI/ALG)3NPs，分别加入不同pH的等渗磷酸盐缓冲液pH(pH7.4，pH6.8，pH5.0)1mL，37℃下恒温振荡(100rpm)。定时取样，高速离心后收集上清液，再补加等量的新鲜PBS。用紫外分光光度法在波长480nm处测定吸光度，计算药物累积释放百分率，考察介质pH对药物释放的影响。将1h处的药物累计释放百分率定义为药物突释；将50％药物累积释放百分率处所对应的的释放时间定义为药物释放半衰期(t1/2)。
测定结果如下表：
结果显示，纳米粒的释放具有pH依赖特性，低pH环境下药物释放较快，而在生理pH下，释放则较为缓慢，较有利于抗肿瘤药物的应用。
附图说明
下图为本发明所述DOX-PLGA NPs(a)和聚电解质包覆的DOX-PLGA NPs(b，c)胶体溶液的透射电镜图。