本发明属于天然产物应用领域，具体涉及低聚多酚类化合物在制备抗革兰氏阳性耐药菌产品的应用。
背景技术：
二聚体和三聚体白藜芦醇低聚多酚类化合物，是具有1,2-二苯乙烯骨架单元及其聚合物的总称。大量文献报道，该类低聚多酚结构具有强的抗菌作用。随着分离技术和光谱分析技术的进步，植物化学研究报道，越来越多的该类聚合体化合物被发现。自1995年迄今为止，文献报道分别从百部、大麻、蝶形花、豆科锦鸡属、菊科、苦瓜科、兰科、买麻藤科、葡萄科、桑科、芍药科等不同科的33属植物中共分离得到此类低聚多酚类化合物已有500多个。该类化合物的活性主要表现在：抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋病及保肝作用；对环氧酶、前列腺素H2合成酶、蛋白激酶C等均有强的抑制活性及抗真菌和抗细菌活性等。近年来我们研究发现，由于该类化合物具有结构多样性和生物活性的多样性，部分这类低聚体的分子还展现出强烈的抗耐药菌活性，因而具有的抗生素样作用。大量文献研究报道的自然界低聚多酚类化合物具有广泛的抗菌活性。我们曾发现了反式-D-葡萄素和龙胆H具有的抗耐药菌活性，并且已经申报了专利“含有龙胆H的天然抗生素饲料添加剂及其制备方法和应用”（申请号：2015108551149）。
技术实现要素：
本发明的发明目的是公开低聚多酚类化合物在制备抗革兰氏阳性耐药菌产品的应用，且所述的低聚多酚类化合物为反式结构的二聚体和三聚体低聚多酚类化合物。
更进一步的，所述的二聚体和三聚体白藜芦醇低聚多酚类化合物为化合物1：反式-D-葡萄素和化合物2：龙胆H，结构式分别为：
化合物1
化合物2
更进一步的，所述的二聚体抗耐药菌性较三聚体的抗耐药菌性更强，所述的二聚体反式-D-葡萄素的抗耐药菌MIC值为8μg/mL，三聚体龙胆H的抗耐药菌MIC值为16μg/mL。
与现有技术相比，本发明至少具有下述优点及有益效果：
本发明首次公开两个化合物抗耐药菌谱为革兰氏阳性耐药菌，及抗耐药菌最小抑菌浓度MIC值的评价结果，是具抗生素效力的天然化合物，该结果对该类天然低聚多酚化合物的研究有重要科学意义和应用价值。该类化合物以葡萄科、桑科和芍药科这些植物的籽食含量最高，他们广泛存在于药食两用植物的果实和籽食中，可作为功能保健品添加剂和重要抗生素样药用原料，即低聚多酚类化合物将在制备抗革兰氏阳性耐药菌药物、添加剂、保健品、食品等产品上具有广泛的应用。
具体实施方式
一、关于两个化合物的抗耐药菌评价
最小抑菌浓度MICs (Minimum Inhibitory Concentration) 采用体外常量肉汤连续稀释法测定。具体方法如下。
1．抗菌药物贮存液制备
阳性对照抗生素万古霉素和所有菌株，直接购自北京中国医学科学院医药生物技术研究所。
具体配置参考NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，被测抗菌药物式I和式II两个低聚酚类配置浓度为不应低于1000μg/ml。如需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，设定其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过4-6个月。
2.药敏试验培养基制备
根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，培养基使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。另外在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠。按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
3. 接种物的制备采用直接菌落悬液配制法。
耐甲氧西林葡萄球菌直接取培养18~24h。即取1-2个耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培养液中，调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
取用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
4. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取无菌试管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入式I抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同样，式II低聚酚类化合物和阳性对照万古霉素如上同样操作。将接种好的稀释管塞好塞子孵育，置35℃普通空气孵箱中孵育满24h。
5、结果判断与解释
在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
表1. 天然低聚多酚化合物I和II抗耐药菌测定(MIC平皿法，单位μg/ml)
如上，天然低聚多酚化合物I和II抗耐药菌测定结果见表1.所示。
从表1中可知，1）化合物式I （Trans-ε-Viniferin，反式-D-葡萄素）抗耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA）和耐表皮葡萄球菌（MSSE）均为8μg/ml； 式II （Gentin H，龙胆H）抗耐表皮葡萄球菌（MSSE）为16μg/ml，抗耐药屎肠球菌 （VRE）的MIC值为16μg/ml。它们均显示强的抗革兰氏阳性耐药菌活性，对所有的革兰氏阴性耐药菌均大于128μg/ml，因此无抗革兰氏阴性耐药菌的活性。2）从化合物式I到式II，实际上是从二聚体到三聚体的改变，水溶性逐渐减小，抗耐药菌活性减弱。因此化合物I二聚体抗耐药菌性更强。3）通过对两个化合物构效关系对比研究可知，化合物I和II都为反式构型；相反顺式构型无论是I还是结构式II，实验显示均没有抗耐药菌活性。
二、天然低聚多酚化合物I和II抗耐药菌测定操作实施例：
实施例1. 从葡萄籽提取化合物I和II及抗耐药菌测定
（1）化合物I和II的提取：
葡萄籽7公斤，用70% 乙醇常温浸泡，持续3天，重复两次。将得到的浸出液减压蒸馏，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，将乙醇浸膏用溶剂溶解后，取大孔树脂脱色后，再用800 g硅胶（100-200目）拌样装住。首先用5倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，然后用5倍柱体积的丙酮进行洗脱。洗脱液分别做减压蒸馏，得到乙酸乙酯浸膏80 g和丙酮87 g浸膏。
取丙酮提取物，通过Waters高效液相制备色谱（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得组分F1 ，F2，F3和F4. 组分F1通过Waters高效液相色谱（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II（Gnetin H）；组分F3通过Waters高效液相色谱（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I （Trans-ε-Viniferin反式-D-葡萄素）。
（2）化合物I和II的抗耐药菌测定：
1．抗菌药物贮存液制备
阳性对照抗生素万古霉素和所有菌株，直接购自北京中国医学科学院医药生物技术研究所。
具体配置参考NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，被测抗菌药物式I和式II两个低聚酚类配置浓度为不应低于1000μg/ml。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为171.2mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（171.2mg×750μg/ml）/1200μg/ml=107.0ml，然后将171.2mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过4-6个月。
2.药敏试验培养基制备
根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，培养基使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。另外在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠。按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
3. 接种物的制备采用直接菌落悬液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培养18~24h。即取1-2个耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培养液中，调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
取用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
4. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取无菌试管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入式I抗菌药物原液（如1200μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同样，式II低聚酚类化合物和阳性对照万古霉素如上同样操作。将接种好的稀释管塞好塞子孵育，置35℃普通空气孵箱中孵育满24h。
5、结果判断与解释
在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC值。
本实施例所得两个化合物抗耐药菌MIC值测试结果如表 1所示。
实施例2. 从凤丹白牡丹籽中提取化合物I和II及抗耐药菌测定
（1）化合物I和II的提取：
购置凤丹白牡丹籽7公斤，干燥脱壳。将牡丹籽壳粉碎用70%乙醇常温浸泡，持续3天，重复两次。将得到的浸出液减压蒸馏，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，将乙醇浸膏用溶剂溶解后，取大孔树脂脱色后，再用800 g硅胶（100-200目）拌样装住。首先用5倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，然后用5倍柱体积的丙酮进行洗脱。洗脱液分别做减压蒸馏，得到乙酸乙酯浸膏110 g和丙酮150 g浸膏。
取丙酮提取物，通过Waters高效液相制备色谱（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得组分F1 ，F2，F3和F4. 组分F1通过Waters高效液相色谱（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II（Gnetin H）；组分F3通过Waters高效液相色谱（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I （Trans-ε-Viniferin反式-D-葡萄素）。
（2）化合物I和II的抗耐药菌测定：
1．抗菌药物贮存液制备
阳性对照抗生素万古霉素和所有菌株，直接购自北京中国医学科学院医药生物技术研究所。
具体配置参考NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，被测抗菌药物式I和式II两个低聚酚类配置浓度为不应低于1000μg/ml。如需配制100 ml浓度为1150μg/ml的抗生素贮存液，设定其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为164.1mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（164.1mg×750μg/ml）/1150μg/ml=107.0ml，然后将164.1 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过4-6个月。
2.药敏试验培养基制备
根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，培养基使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。另外在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠。按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
3. 接种物的制备采用直接菌落悬液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培养18~24h。即取1-2个耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培养液中，调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
取用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
4. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取无菌试管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入式I抗菌药物原液（如1150μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/ml. 同样，式II低聚酚类化合物和阳性对照万古霉素如上同样操作。将接种好的稀释管塞好塞子孵育，置35℃普通空气孵箱中孵育满24h。
5.结果判断与解释
在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC值。
本实施例所得两个化合物抗耐药菌MIC值测试结果如表 1所示。
实施例3. 从紫斑牡丹籽中提取化合物I和II及抗耐药菌测定
（1）化合物I和II的提取：
购置凤丹牡丹籽7公斤，干燥脱壳。将牡丹籽壳粉碎用70%乙醇常温浸泡，持续3天，重复两次。将得到的浸出液减压蒸馏，得到乙醇浸膏400 g。取300 g乙醇浸膏，将乙醇浸膏用溶剂溶解后，取大孔树脂脱色后，再用800 g硅胶（100-200目）拌样装住。首先用5倍柱体积的乙酸乙酯进行洗脱，然后用5倍柱体积的丙酮进行洗脱。洗脱液分别做减压蒸馏，得到乙酸乙酯浸膏110 g和丙酮150 g浸膏。
取丙酮提取物，通过Waters高效液相制备色谱（甲醇：水55:45，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm）, 得组分F1 ，F2，F3和F4. 组分F1通过Waters高效液相色谱（甲醇：水50:50，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物II龙胆H（Gnetin H）； 组分F3通过Waters高效液相色谱（甲醇：水45:55，流速8ml/min，YMC ODS C18，250*20mm），得化合物I 反式-D-葡萄素（Trans-ε-Viniferin）。
（2）化合物I和II的抗耐药菌测定：
1．抗菌药物贮存液制备
阳性对照抗生素万古霉素和所有菌株，直接购自北京中国医学科学院医药生物技术研究所。
具体配置参考NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，被测抗菌药物式I和式II两个低聚酚类配置浓度为不应低于1000μg/mL。如需配制100 mL浓度为1150μg/mL的抗生素贮存液，设定其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为164.1μg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（164.1μg×750μg/mL）/1150μg/mL=107.0mL，然后将164.1μg抗生素粉剂溶解于107.0mL稀释剂中。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过4-6个月。
2.药敏试验培养基制备
根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，培养基使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。另外在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠。按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
3. 接种物的制备采用直接菌落悬液配制法。耐甲氧西林葡萄球菌直接取培养18~24h。即取1-2个耐甲氧西林葡萄球菌菌落置上述2的培养液中，调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
取用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
4. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种
取无菌试管（13x100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1mLl，在第1管加入式I抗菌药物原液（如1150μg/mL）0.4ml混匀，然后吸取1mL至第2管，混匀后再吸取1mL至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1mL弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/mL。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 、0.125μg/mL. 同样，式II低聚酚类化合物和阳性对照万古霉素如上同样操作。将接种好的稀释管塞好塞子孵育，置35℃普通空气孵箱中孵育满24h。
5.结果判断与解释
在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC值。
本实施例所得两个化合物抗耐药菌MIC值测试结果如表 1所示。