一种抗菌型蛋白肽‑纳米粒复合体的制备方法与流程

本发明涉及复合材料制备技术领域，具体是一种抗菌型蛋白肽-纳米粒复合体的制备方法。

背景技术：

纳米颗粒材料又称为超微颗粒材料，由纳米粒子(nanoparticle)组成。纳米粒子也叫超微颗粒，一般是指尺寸在1～100nm间的粒子，是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，从通常的关于微观和宏观的观点看，这样的系统既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，是一种典型的介观系统，它具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应。当人们将宏观物体细分成超微颗粒（纳米级）后，它将显示出许多奇异的特性，即它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的性质和大块固体时相比将会有显著的不同。

纳米材料具有一定的独特性，当物质尺度小到一定程度时，则必须改用量子力学取代传统力学的观点来描述它的行为，当粉末粒子尺寸由10微米降至10纳米时，其粒径虽改变为1000倍，但换算成体积时则将有10的9次方倍之巨，所以二者行为上将产生明显的差异。

纳米粒子异于大块物质的理由是在其表面积相对增大，也就是超微粒子的表面布满了阶梯状结构，此结构代表具有高表面能的不安定原子。这类原子极易与外来原子吸附键结，同时因粒径缩小而提供了大表面的活性原子。

在抗生素滥用，耐药菌株不断产生的今天，抗菌肽的研究吸引着国内外学者的目光，人们在不断寻找新的抗菌肽，探索抗菌肽新的作用机制。抗菌肽(antibacterialpeptide，ABP) 又称抗微生物肽(antimicrobial peptide，AMP) 广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分。AMP 多数是一类分子量小于10kDa 小分子肽，在链长、序列及结构有多样性的阳离子型两亲性肽类(Boman H G.Antibactericidal peptides ：key components needed in immunity[J].Cell，1991，65 ：205-207 ；Hultmark D.Drosophila immunity ：paths and patterns[J].Current Opinion in Immunology，2003，15 ：12-19.)。现有技术如授权公告号为CN102051398B的中国发明专利，公开了一种以纯天然的海产低值鱼黄鲫为原料来制备抗菌肽，黄鲫蛋白抗菌肽富含人体必需氨基酸，理化性能稳定，以食物源蛋白酶解所得的抗菌肽安全性高、吸收性好、抑菌效果好，可以在食品中作为营养和功能型添加剂或开发为耐药菌抗生素。

现有技术如授权公告号为CN103433484B的中国发明专利，公开了一种牛血清白蛋白-铂复合纳米材料模拟过氧化物酶及其制备方法和应用，以牛血清白蛋白为模板，通过生物矿化作用，制备牛血清白蛋白- 铂复合纳米材料模拟过氧化物酶。其牛血清白蛋白- 铂复合纳米材料由下述方法制备而成的：在浓度为牛血清白蛋白水溶液中加入氯铂酸水溶液，混匀后加入氢氧化钠水溶液得混合溶液，水浴加热；将此溶液经过超滤并水洗，得到牛血清白蛋白- 铂复合纳米材料水溶液；牛血清白蛋白- 铂复合纳米材料具有优良的过氧化酶活性，可催化过氧化氢氧化3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺盐酸盐显色。同时该模拟酶耐酸碱、耐高温、耐高盐，具有优异的短期室温稳定性和长期室温稳定性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种性质稳定，比表面积大，抑菌效果超强的抗菌型蛋白肽-纳米粒复合体的制备方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种抗菌型蛋白肽-纳米粒复合体的制备方法，具体制备步骤：

1）氧化锌胶体的制备：在无水乙醇中加入乙酸锌，超声助溶，得到乙酸锌乙醇溶液，乙酸锌乙醇溶液的浓度为0.08~0.12mol/L，配置时在密闭容器中进行，防止乙醇挥发。搅拌，将氢氧化钠乙醇溶液逐滴加到氢氧化钠乙醇溶液中，氢氧化钠乙醇溶液浓度为0.16~0.24 mol/L，氢氧化钠乙醇溶液：氢氧化钠乙醇溶液体积比为1:0.8~1.3，水浴温度为75~90℃，振荡搅拌1.5~3h，乙酸锌水解、溶胶、凝胶得到氧化锌胶体溶液；

2）纳米锌材料的制备：在胶体溶液中加入正己烷和乙二醇单甲醚，正己烷：胶体溶液体积比为1:0.6~1.5，乙二醇单甲醚：正己烷体积比为1:100~500，在正己烷中加入少量的乙二醇单甲醚能使乙醇在正己烷中的溶解度提高，氧化锌胶体的析出率提高，并且改善纳米颗粒的粒径，提高复合体产品性能；搅拌，离心，用无水乙醇洗涤沉淀，采用真空低温干燥，真空度为5000~10000pa，温度为30~40℃，干燥时间为1.2~2.9h，得到纳米氧化锌粉末，置于干燥器中避光保存；

3）蛋白肽-纳米粒的制备：调节黄鲫蛋白肽的pH为2.5~3.5，离心，在上清液中加入纳米氧化锌粉末，使其终浓度为18~21mg/mL。水浴振荡，水浴温度为30~42℃，水浴振荡6~9h，转速为120~200rpm。离心，上清液留用，得到可溶性黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌。纳米氧化锌对有抗菌作用的黄鲫蛋白肽有特异性吸附作用，起到纯化的效果；黄鲫蛋白肽吸附在纳米氧化锌上，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且比表面积成指数倍增加，具有超强的抗菌效果；纳米材料具有轻微的毒性，在外表面包裹一层多肽，能降低其毒性，有利于身体健康。

与现有技术相比，本发明的优点在于：在正己烷中加入少量的乙二醇单甲醚能使乙醇在正己烷中的溶解度提高，氧化锌胶体的析出率提高；纳米氧化锌对有抗菌作用的黄鲫蛋白肽有特异性吸附作用，起到纯化的效果；黄鲫蛋白肽吸附在纳米氧化锌上，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且比表面积成指数倍增加，具有超强的抗菌效果；纳米材料具有轻微的毒性，在外表面包裹一层多肽，能降低其毒性，有利于身体健康；制备方法简单，成本低廉，制备的产品抑菌效果好，且不会产生抗药性，绿色健康，安全性高，适合大规模生产。

附图说明

图1为纳米氧化锌透射电镜图；

图2为纳米氧化锌XRD分析图谱；

图3为黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌复合物的透射电镜图；

图4为黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌复合物的高分率透射电镜图；

图5为未经黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌复合物处理的大肠杆菌扫描电镜图；

图6为经黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌复合物处理3h的大肠杆菌扫描电镜图。

具体实施例

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种抗菌型蛋白肽-纳米粒复合体的制备方法，具体制备步骤：

1）氧化锌胶体的制备：在无水乙醇中加入乙酸锌，超声助溶，得到乙酸锌乙醇溶液，乙酸锌乙醇溶液的浓度为0.08~0.12mol/L，配置时在密闭容器中进行，防止乙醇挥发。搅拌，将氢氧化钠乙醇溶液逐滴加到氢氧化钠乙醇溶液中，氢氧化钠乙醇溶液浓度为0.16~0.24 mol/L，氢氧化钠乙醇溶液：氢氧化钠乙醇溶液体积比为1:0.8~1.3，水浴温度为75~90℃，振荡搅拌1.5~3h，乙酸锌水解、溶胶、凝胶得到氧化锌胶体溶液；

2）纳米锌材料的制备：在胶体溶液中加入正己烷和乙二醇单甲醚，正己烷：胶体溶液体积比为1:0.6~1.5，乙二醇单甲醚：正己烷体积比为1:100~500，在正己烷中加入少量的乙二醇单甲醚能使乙醇在正己烷中的溶解度提高，氧化锌胶体的析出率提高。搅拌，离心，用无水乙醇洗涤沉淀，采用真空低温干燥，真空度为5000~10000pa，温度为30~40℃，干燥时间为1.2~2.9h，得到纳米氧化锌粉末，置于干燥器中避光保存；

3）蛋白肽-纳米粒的制备：调节黄鲫蛋白肽的pH为2.5~3.5，离心，在上清液中加入纳米氧化锌粉末，使其终浓度为18~21mg/mL。水浴振荡，水浴温度为30~42℃，水浴振荡6~9h，转速为120~200rpm。离心，上清液留用，得到可溶性黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌。纳米氧化锌对有抗菌作用的黄鲫蛋白肽有特异性吸附作用，起到纯化的效果；黄鲫蛋白肽吸附在纳米氧化锌上，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且比表面积成指数倍增加，具有超强的抗菌效果；纳米材料具有轻微的毒性，在外表面包裹一层多肽，能降低其毒性，有利于身体健康。

实施例2：

一种抗菌型蛋白肽-纳米粒复合体的制备方法，最优选制备步骤：

1）氧化锌胶体的制备：在无水乙醇中加入乙酸锌，超声助溶，得到乙酸锌乙醇溶液，乙酸锌乙醇溶液的浓度为0.1mol/L，配置时在密闭容器中进行，防止乙醇挥发。搅拌，将氢氧化钠乙醇溶液逐滴加到氢氧化钠乙醇溶液中，氢氧化钠乙醇溶液浓度为0.2mol/L，氢氧化钠乙醇溶液：氢氧化钠乙醇溶液体积比为1:1，水浴温度为80℃，振荡搅拌2h，乙酸锌水解、溶胶、凝胶得到氧化锌胶体溶液；

2）纳米锌材料的制备：在胶体溶液中加入正己烷和乙二醇单甲醚，正己烷：胶体溶液体积比为1:1，乙二醇单甲醚：正己烷体积比为1:200，在正己烷中加入少量的乙二醇单甲醚能使乙醇在正己烷中的溶解度提高，氧化锌胶体的析出率提高。搅拌，离心，用无水乙醇洗涤沉淀，采用真空低温干燥，真空度为7000pa，温度为35℃，干燥时间为2.3h，得到纳米氧化锌粉末，置于干燥器中避光保存。有图1和图2可知纳米氧化锌的化学成分和结构；

3）蛋白肽-纳米粒的制备：调节黄鲫蛋白肽的pH为3.0，离心，在上清液中加入纳米氧化锌粉末，使其终浓度为19.78mg/mL。水浴振荡，水浴温度为37℃，水浴振荡6.9h，转速为160rpm。离心，上清液留用，得到可溶性黄鲫蛋白抗菌肽-纳米氧化锌。由图3和图4可知抗菌型黄鲫蛋白肽很好的吸附在纳米氧化钛上。纳米氧化锌对有抗菌作用的黄鲫蛋白肽有特异性吸附作用，起到纯化的效果。由图5和图6对比可看出黄鲫蛋白肽-纳米复合体能使大肠杆菌表面褶皱，使其失去活性。黄鲫蛋白肽吸附在纳米氧化锌上，保持相对独立的空间结构和生物活性，并且比表面积成指数倍增加，具有超强的抗菌效果；纳米材料具有轻微的毒性，在外表面包裹一层多肽，能降低其毒性，有利于身体健康。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

步骤2中乙二醇单甲醚：正己烷的体积比不仅限于1:100~500，还包括1:102或1:104或1:106，……，或1:496或1:498或1:500。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。