[0020] 图2为实施定量PCR检测各处理组的脯肽酶基因表达水平的改变；
[0021] 图3为经血干细胞移植入肝脏后的免疫荧光失踪图。 (一）【具体实施方式】
[0022] 下面以小鼠肝纤维化模型为例，结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描 述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0023] 实施例1 :经血干细胞注射液的制备
[0024] 收集供者的经血样品，进行常规微生物和传染病病原体安全检测，采用1. 0779/ml 的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞，用PBS将分离到的单个核细胞洗 涤3次，调节细胞密度至（3-5) X 106个细胞/ml，接种于底面积为75cm2的培养瓶中置37°C、 5 % C02培养箱中扩增培养，用DMEM培养基，体积含量为1 %的双抗培养基，体积含量为1% 两性霉素B，体积含量为1%谷氨酰胺和体积含量为20%胎牛血清的细胞培养液孵育细胞； 细胞培养48小时后，0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化5min，加入适当体积完全培养基中和胰蛋 白酶活性，并用吸管轻轻吹打，悬浮贴壁细胞。PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新接种于新的 培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。
[0025] 将收集的经血干细胞分三组，用生理盐水调节细胞数目为IX 106个细胞/ml、 2父106个细胞/!111和4\106个细胞/1111，每组中分别加入（0.1~0.2)1^/1111趋化因子 CXCL8，配制成经血干细胞注射液。
[0026] 上述的经血干细胞呈成纤维样贴壁生长，流式细胞仪检测显示该细胞大多数表达 ⑶29,⑶44,⑶73和⑶90,不表达⑶34,⑶45,⑶117和HLA-DR。体外可以诱导为成骨细胞 和成脂细胞，体内移植可以快速达到肝脏组织。
[0027] 实施例2 :小鼠肝纤维化模型建立
[0028] ICR小鼠腹腔注射CC14(以1mlCCl4/kg的剂量注射含10%CC14的橄榄油）建 立肝纤维化模型，每周注射2次，连续注射4周。
[0029] 实施例3 :经血干细胞的移植试验
[0030] 尾静脉注射移植实验：肝纤维化模型小鼠分为3组，分别通过尾静脉注射移植 1 X 106个细胞/100y1、2X 10 6个细胞/100y1和4X 10 6个细胞/100y1的细胞剂量，另注 射100y1 PBS作为对照，均为1次注射。移植期间保持0：14注射直至小鼠麻醉处死取样。
[0031] 小鼠生活状况评价：对照组小鼠活动活跃，皮毛有光泽，饮食量正常。模型组小鼠 活动减少，皮毛干涩，饮食量也减少。治疗组小鼠活动逐渐活跃，皮毛干涩程度降低，饮食量 有所增加。
[0032] 肝功能指标：细胞移植后第28天，将模型组、对照组和移植组小鼠乙醚麻醉后眼 眶取血，采用放射免疫法测定血清III型前胶原、IV型胶原、层黏连蛋白和透明质酸酶水 平，详见表1.。采用全自动生物化学分析仪测定ALT、AST和总胆红素。详见表2.
[0033]表1 :血清学检测结果
[0034]
【主权项】
1. 一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述的干细胞制剂是由人经血间 充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成。
2. 根据权利要求1所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于人经血间充质 干细胞的浓度为（1~3) X l〇7ml，趋化因子CXCL8的浓度为（0. 1~0. 2) ng/ml，所述生理 盐水为150~250ml。
3. 根据权利要求1或2所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述的趋 化因子CXCL8的体积含量为0. 1 %。
4. 根据权利要求1或2所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其特征在于所述人经 血间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞表达⑶29,⑶44,⑶73和⑶90,不表达 CD34, CD45, CD117 和 HLA-DR。
5. -种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)单核细胞分离：将收集到的经血样品进行常规微生物和传染病病原体安全检测， 采用I. 0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞； ⑵间充质干细胞分离培养：用PBS将分离到的单核细胞洗涤3次，调节细胞密度至 (3~5) X IO6个细胞/ml，接种于培养瓶中置37°C、5% C02培养箱中培养，用细胞培养液孵 育细胞；细胞培养48小时后，胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新接种 于新的培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。 (3)经血间充质干细胞制剂配制：将收集的经血干细胞用150~250ml的生理盐水调 节细胞数目为（1~3) X 106/ml并加入浓度为（0. 1~0. 2) ng/ml体积含量为0. 1的趋化 因子CXCL8配制成经血干细胞注射液。
6. 根据权利要求5所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于步 骤2)中用到的细胞培养液包括DMEM培养基，双抗培养基，两性霉素 B，谷氨酰胺和胎牛血清 混合物。
7. 根据权利要求6所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，其特征在于细 胞培养液为DMEM培养基，体积含量为1 %的双抗培养基，体积含量为1 %两性霉素 B，体积含 量为1 %谷氨酰胺和体积含量为20%胎牛血清的混合物。
【专利摘要】本发明提供了一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂及其制备方法，所述的治疗肝纤维化的干细胞制剂，是由人经血间充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成，该经血间充质干细胞获取方法简单，不受伦理限制，且其细胞活力高，增殖力强，具有多向分化潜能，制备简便；本发明的经血间充质干细胞制剂输注技术操作简单方便，利用经血间充质干细胞治疗肝纤维化，开发用于治疗组织损伤的干细胞制剂街制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。
【IPC分类】A61P1-16, A61K35-28, C12N5-0775
【公开号】CN104622902
【申请号】CN201510024090
【发明人】吴晓星, 刘广平, 项春生, 戴玲华
【申请人】杭州易文赛科拓干细胞技术研究有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月17日