胞铺预先放圆玻片（多聚赖氨酸处理）的12孔板，培养过夜待 细胞贴壁。
[0073] (2)次日，将以上培养基弃掉。
[0074] (3) PBS 洗 5 遍。
[0075] (4)用TRB3和P62 -抗4°C孵育过夜。
[0076] (5)次日 PBS 洗 5 遍。
[0077] (6)用特异性二抗(购自北京中衫金桥有限公司），37度孵育半小时，PBS洗5遍
[0078] (7)将圆玻片从孔板中取出，用含有抗淬灭剂的DAPI (购自北京中衫金桥有限公 司）封片。
[0079] (8)待片子风干后用激光共聚焦显微镜TRB3蛋白与P62蛋白之间的共定位，结果 见图2。
[0080] 结果如图2所示，在游离脂肪酸处理48h的AML-12细胞中TRB3蛋白与P62蛋白 存在明显的共定位。其中图2左侧代表TRB3的染色，中间代表P62的染色，右侧代表TRB3 和P62重叠后的颜色。
[0081] 实施例3免疫共沉淀验证P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3可以阻断P62蛋白与TRB3 蛋白的结合。
[0082] 免疫共沉淀试剂如下：
[0083]裂解液 A 液：0?6057g Tris 碱，I. 7532g NaCl，0. 1017g MgCl2?6H20,0. 0742g EDTA，IOmL甘油，10mL10%NP40,加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7. 6,定容至191mL， 充分混匀，0. 45 ii m滤膜过滤，4°C储存。
[0084]裂解液B液：200iiL2M P -磷酸甘油，4mL2. 5M NaF，2mL100mMNaV03, 2mL100mM PMSF，200iiLlMDIT，lmg/mL 的 Leu、P印、Apr 各 200iiL，总体积共 9mL。母液于-20°C储存。 使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。
[0085] Protein A/G Plus-Agarose 购自美国 Santa cruz 公司。
[0086] 具体操作步骤如下：
[0087] (1)将肝癌HepG2细胞(购自美国ATCC公司）铺90mm2大皿，培养24小时后，将 P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3多肽干粉用生理盐水溶解，直接加入到培养孔中，使终浓度为 5 y M，加药12小时后收集细胞。
[0088] (2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4mg，将各组蛋白调整至 I U g/ U L。每组各取200 y g蛋白留作"输入细胞裂解液"，以作为对照。
[0089] (3)剩余蛋白（除"输入细胞裂解液"之外的总蛋白，大约3800 ii g)加入2 ii g P62 抗体或者与P62抗体种属相同的正常IgG抗体，同时加入IOii LProtein A/G Plus-Agarose 充分重悬，4°C缓慢旋转摇动过夜。4°C、3000rpm离心5min,小心吸除上清，宁可留下少量上 清也不能吸到Agarose。冰浴静置lmin，4°C、3000rpm离心30sec,小心吸除上清。重复洗 涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30 ii L2 X SDS凝胶加样缓冲液， 混匀，95°C变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白 样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0090] 结果如图3所示，在肝癌HepG2细胞内TRB3蛋白与P62蛋白存在明显的结合，而 P印-Al，Pep-A2，Pep-A3可以显著干扰这种结合。其中输入代表初始细胞裂解液，输出代表 经过P62抗体及对照抗体IgG沉淀过的裂解液。
[0091] 实施例4免疫印迹实验验证肽段P印2-Al，P印2-A2和P印2-A3可以恢复游离脂肪 酸损伤的自噬流。
[0092] 细胞处理以及免疫印迹具体操作步骤同实施例1，在48h时间点使用肽段 P印2-A1，P印2-A2 和 P印2-A3 治疗 24h。
[0093] 结果如图4所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著抑制游离脂肪酸增加 的TRB3蛋白表达水平，上调LC3II、PI3KC3、Beclinl蛋白表达水平，同时自噬底物p62蛋白 表达水平降低，说明自噬流恢复。
[0094] 实施例5油红0染色实验验证肽段Pep2_Al，P印2-A2和P印2-A3可以降低肝细胞 中脂肪含量。
[0095] 细胞处理具体操作步骤同实施例1，在48h时间点使用肽段P印2-A1，P印2-A2和 P印2-A3治疗24h，对AML-12细胞进行油红0染色，具体操作如下：
[0096] (1)秤取0. 4g油红0染料，用100%异丙醇加热溶解。
[0097] (2)冷却至室温，滤纸过滤。成为油红0储存液(储存液可于4度保存)。
[0098] (3)将储存液和双蒸水以3 :2比例充分混合，室温静置10分钟，取上清液过滤方 可使用。工作液现用现配，超过4小时即需重新配置。
[0099] (4)弃去细胞培养基，PBS洗去悬浮细胞及培养基。4%多聚甲醛在4°C固定12小 时。
[0100] (5)移去多聚甲醛，PBSMdH2O清洗细胞，60%异丙醇润洗细胞。
[0101] (6)每孔加油红0工作液40 ii 1染色15分钟。
[0102] (7)洗净油红工作液，用CldH2O清洗孔壁残留油红0染料颗粒。
[0103] (8)正置显微镜拍照。
[0104] 结果如图5所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著抑制游离脂肪酸增加 的细胞内油红〇阳性细胞数目。
[0105] 实施例6H&E染色法验证肽段P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3可以改善高脂饮食小 鼠非酒精性脂肪肝。
[0106] (一）C57/BL6小鼠代谢综合征模型
[0107] 实验动物及分组：55周龄C57/BL6雄性小鼠100只（购自北京维通利华实验动物 有限公司），随机分为四组：正常饲料喂养20只（SD)，高脂饲料喂养20只（HC)，高脂饲料喂 养与P印2-A1给药组20只（HCPl )，高脂饲料喂养与P印2-A2给药组20只（HCP2)，高脂饲料 喂养与P印2-A3给药组20只（HCP3)。
[0108] 高脂饲料成分：蛋白质20%、碳水化合物35%、脂肪45%。
[0109] 正常饲料成分：蛋白质20%、碳水化合物74. 7%，脂肪5. 3%。
[0110] 模型制备参照文献"Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet，Vol444 116November2006 I doi : 10. 1038/nature0535" 中所述方法。
[0111] SD组小鼠给予正常饲料喂养12周，其余各组给予高脂饲料喂养8周后，模型组小 鼠出现代谢综合征症状，如肝脏内油脂增加，空泡面积增大，心脏、肾脏、肝脏、主动脉炎症 指标NF-kBp65磷酸化增加，胰岛素水平增加，糖耐量损伤增加等。之后给予模型组小鼠 腹腔注射P印2-Al、P印2-A2、P印2-A3共计4周，处死小鼠，取血浆、心、主动脉、血浆、肾、肝。
[0112] (二）小鼠肝脏H&E染色
[0113] 肝脏石蜡切片委托北京嘉兰海公司加工，H&E染色步骤如下：
[0114](1)配制1%的伊红酒精溶液：称取伊红lg，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直 至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精100毫升溶解；
[0115] (2)配制苏木素染液：苏木精6g;无水乙醇IOOrnl;硫酸错钾150g;蒸馈水2000ml; 碘酸钠L 2g ;冰醋酸120ml ;甘油900ml ;
[0116] 将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合， 最后加入冰醋Ife和鹏Ife纳；
[0117] (3)配制1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可；
[0118] (4)脱蜡：依次将石蜡切片放入二甲苯（I