) 15min-二甲苯（II) 15min-100%乙醇 5min_95% 乙醇 5min_80% 乙醇 5min_75% 乙醇 5min_ 蒸馈水 5min ;
[0119] (5 )苏木精液染色5min;
[0120] (6)流水稍洗去苏木精液1~3s ;
[0121] (7) 1% 盐酸乙醇 l_3s ;
[0122] (8)稍水洗 10-30s ;
[0123] (9)蒸馏水过洗l_2s;
[0124] (10) 0? 5% 伊红液染色 l_3min ;
[0125] (11)蒸馏水稍洗l_2s;
[0126] (12)依次将石蜡切片放入二甲苯80%乙醇ls-95%乙醇3s_95%乙醇5s-无水乙醇 IOmin-二甲苯 2min_ 二甲苯 2min;
[0127] (13)中性树胶封固；
[0128] (14)正置显微镜拍照。
[0129] 结果如图6所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著减少高脂饮食小鼠肝 脏切片中的空泡面积，说明肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以改善高脂饮食小鼠非酒精 性脂肪肝病变。
[0130] 实施例7油红0染色法验证肽段P印2-Al，P印2-A2和P印2-A3可以改善高脂饮食 小鼠肝脏脂肪含量。
[0131] 模型制备具体操作步骤同实施例6,油红0染色具体操作步骤同实施例5。
[0132] 结果如图7所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著降低油红0阳性细 胞数目，表明对于高脂饮食小鼠肝脏脂肪性变的改善显著抑制高脂饮食小鼠肝脏中脂肪含 量。
[0133] 实施例8免疫印迹验证肽段P印2_A1，P印2-A2和P印2-A3可以恢复高脂饮食小鼠 肝脏中TRB3表达，恢复自噬流。
[0134] 模型制备具体操作步骤同实施例6,免疫印迹具体操作步骤同实施例1。
[0135] 结果如图8所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著抑制高脂饮食增加的 TRB3蛋白表达水平，上调LC3II、P13KC3、Bec I in 1蛋白表达水平，同时自噬底物p62蛋白表 达水平降低，说明自噬流恢复。
[0136] 实施例9ELISA (酶联免疫吸附实验）法验证肽段P印2-Al，P印2-A2和P印2-A3可 以降低1?脂饮食小鼠1?膜岛素血症。
[0137] 模型制备具体操作步骤同实施例6。具体操作步骤如下：
[0138] (1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4°C；
[0139] (2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 y L;
[0140] (3)待测样本孔先加样本小鼠血浆样本IOii L，再加样本稀释液试剂盒里的 40 ii L ;空白孔不加；
[0141] (4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的检测 抗体IOOii L,用封板膜封住反应孔,37°C水浴锅或恒温箱温育60min;
[0142] (5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上 拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板）；
[0143] (6)每孔加入底物A、B (购自Millipore公司，产品型号为S30037-M)各50iiL， 37°C避光孵育15min ;
[0144] (7)使用酶标仪检测吸光度，sigmaplotl0.0 作图。
[0145] 结果如图9所示，肽段P印2-A1，P印2-A2, P印2-A3可以显著抑制高脂饮食增加的 血浆胰岛素水平。
[0146] 实施例100GTT (口服葡萄糖耐量实验）法验证肽段P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3 可以降低高脂饮食小鼠糖耐量损伤。
[0147] 模型制备具体操作步骤同实施例6。
[0148] OGTT具体实验步骤如下：
[0149] (1)小鼠禁食过夜。
[0150] (2)小鼠尾腹腔注射葡萄糖水溶液（lg/kg)。
[0151] (3)开始计时，于服糖前和服糖后第15、30、60min分别在尾静脉取血测血糖。
[0152] (4)使用spssl2. 0计算血糖曲线下面积（AUC)，使用sigmaplotl0.0 作图。鼠i. g (即灌胃）葡萄糖溶液后，结果如图10所示，AUC显示，肽段P印2-Al，P印2-A2，P印2-A3可以 显著抑制高脂饮食小鼠中小鼠灌胃后血糖变化的线下面积，改善高脂饮食造成的糖耐量损 伤。
[0153] 实施例11免疫印迹法验证肽段P印2-A1，P印2-A2和P印2-A3可以降低高脂饮食 小鼠心脏、肾、主动脉、肝脏炎症指标NF-kBp65磷酸化。
[0154] 模型制备具体操作步骤同实施例6,免疫印迹具体操作步骤同实施例1。
[0155] 结果如图11所示，在肾脏、肝脏、主动脉、心脏蛋白中，检测到肽段P印2-A1， P印2-A2，P印2-A3可以显著抑制高脂饮食增加的NF- K B p65磷酸化水平，改善肾脏、肝脏、 主动脉、心脏蛋白中的炎症。说明炎症的改善。
【主权项】
1. 一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防代谢综 合征的药物中的应用； 所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列 中的任一种； 所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0:4~SEQ ID N0:9中的任一种所示。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一种的多肽的N端与细胞穿膜肽连接。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示序列中的任一种的多肽的C端与细胞穿膜肽连接。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽 的衍生物作为单一活性成分在制备治疗和/或预防代谢综合征的药物中的应用。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽和/或所述 多肽的衍生物与其他治疗和/或预防代谢综合征的药物联合作为活性成分在制备治疗和/ 或预防代谢综合征的药物中的应用。
7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢综合征包括非酒精性脂肪肝。
8. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢综合征包括糖尿病性心肌炎。
9. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢综合征包括糖尿病性肾炎。
10. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢综合征包括主动脉炎症、胰岛 素抵抗、糖耐量损伤和高胰岛素血症。
【专利摘要】本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防代谢综合征的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽和/或所述多肽配合药物辅料形成的药物组合物。本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，该肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以治疗高脂饮食诱导的小鼠代谢综合征。
【IPC分类】A61P3-10, A61K38-16, A61P13-12, A61P3-00, A61P9-00, A61P1-16, A61K38-10
【公开号】CN104740605
【申请号】CN201310727456
【发明人】胡卓伟, 余娇娇, 付小明
【申请人】胡卓伟
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月25日