抗体的时间顺序。 因此，"初始剂量"是在治疗方案开始时施用的剂量（也称为"基线剂量第二剂量"是 初始剂量之后施用的剂量；并且"第三剂量"是第二剂量之后施用的剂量。所述初始、第二 和第三剂量可以含有相同量的抗H)GFR-f3抗体，但一般可以在施用频率方面彼此不同。然 而在某些实施方案中，初始、第二和/或第三剂量中含有的抗I 3DGFR-β抗体的量在治疗过 程中彼此不同（例如适当时上调或下调）。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两次 或多次（例如，2、3、4或5次）剂量作为"负荷剂量"，随后是在更不频繁基础上施用的后续 剂量（例如，"维持剂量"）。
[0104] 在本发明的某些示例性实施方案中，在紧接先前剂量之后1-26(例如，1、172、2、 27 2、3、372、4、472、5、572、6、67 2、7、772、8、872、9、972、10、107 2、11、1172、12、1272、13、 1372、14、147 2、15、1572、16、1672、17、1772、18、187 2、19、1972、20、2072、21、2172、22、 22 1/2、23、231/2、24、2472、25、25 1/2、26、261/2或更多）周施用每个第二和/或第三剂量。如 本文所用，短语"紧接先前剂量"表示在多次施用的顺序中，以没有介于其中的剂量的顺序 在紧接着施用下次剂量之前向患者施用的抗I 3DGFR- β抗体的剂量。
[0105] 本发明该方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗 TOGFR-β抗体。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单次第二剂量。在其他实施方案 中，向患者施用两次或多次（例如，2、3、4、5、6、7、8或多次）第二剂量。同样，在某些实施方 案中，仅向患者施用单次第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或多次（例如，2、 3、4、5、6、7、8或多次）第三剂量。
[0106] 在涉及多次第二剂量的实施方案中，以与其他第二剂量相同的频率施用每次第二 剂量。例如，可以在紧接先前剂量之后向患者施用每次第二剂量1-2周或1至2月。类似 地，在涉及多次第三剂量的实施方案中，以与其他第三剂量相同的频率施用每次第三剂量。 例如，可以在紧接先前剂量之后向患者施用每次第三剂量2-12周。在本发明的某些实施方 案中，向患者施用第二和/或第三剂量的频率在治疗方案期间可以变化。还可以由医生在 临床检查后根据个体患者的需要在治疗期间调整施用频率。
[0107] 本发明包括这样的施药方案，其中以第一频率（例如，一周一次，每两周一次，每 三周一次，每月一次，每两月一次，等）对患者施用2至6次负荷剂量，随后以较不频繁的基 础对患者施用两次或更多次维持剂量。例如，根据本发明的此方面，如果以例如，每月一次 的频率施用负荷剂量（例如，每月施用两次、三次、四次或更多次负荷剂量），那么可以以每 五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十二周一次 等对患者施用维持剂量。 抗体的诊断用途
[0108] 本发明之抗I3DGFR-β抗体还可用于检测和/或测量样品中的TOGFR-β或表达 TOGFR-β的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗TOGFR-β抗体或其片段可用于诊断特征 为TOGFR-β的异常表达（例如过度表达、表达不足、缺乏表达等）的病症或疾病。典型 的TOGFR-β诊断测定法可包括例如用本发明之抗TOGFR-β抗体与获自患者的样品接触， 其中该抗TOGFR-β抗体以可检测的标记或报告分子标记。被许多，在诊断应用中也可以 将未标记的抗roGFR-β抗体与本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。该可检测的 标记或报告分子可以是放射性同位素，如 3H、14C、32P、35S或125I ;荧光或化学发光部分，如异 硫氰酸荧光素，或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素 酶。可用于检测或测量样品中roGFR-β的具体的示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法 (ELISA)、放射免疫测定法（RIA)，以及荧光激活细胞分选（FACS)。
[0109] 可依照本发明用于TOGFR-β诊断测定法的样品包括获自患者的在正常或病理条 件下含有可检测量TOGFR-β蛋白或其片段的任何组织或液体样品。一般而言，测量从健康 患者（例如未患与异常I 3DGFR-β水平或活性相关的疾病或病症的患者）获得特定的样品 的roGFR- β水平，以初始地建立roGFR- β水平的基线或标准。然后，可将这一 roGFR- β 基线水平与从获自疑为患有roGFR- β相关性疾病或病症的个体的样品中测得的roGFR- β 的水平进行比较。 实施例
[0110] 举出以下实例是为了向本发明所属领域普通技术人员就如何利用本发明之方法 和组合物提供完整的公开和描述，并非是为了限制本发明人视为其发明的范围。已作出努 力以确保所用数据（例如剂量、温度等）的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除 非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压强是指处于或接近 大气压。 实施例1.生成I3DGFR-β的人类抗体
[0111] 直接对VELOOMMUIVE?小鼠（含有编码人类免疫球蛋白重链与κ轻 链可变区的DNA)施用包含TOGFR-β胞外结构域的免疫原与佐剂以刺激免疫反应。藉由 TOGFR- β -特异性免疫测定法监测抗体免疫反应。当达到所欲的免疫反应时，收取脾脏细 胞并且与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并形成融合瘤细胞系。筛选并挑选杂交瘤细胞 系以鉴定生产I 3DGFR- β -特异性抗体的细胞系。使用此技术获得数种抗TOGFR- β嵌合抗 体（g卩，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体）；以此方式生成的示例性抗体命名如 下：H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N 和 H2M3374N。然后将来自嵌合抗体的人可变结构域克隆到人恒定结构域上以制造如本文描述 的完整人抗I3DGFR-β抗体。
[0112] 如US 2007/0280945Α1中所述，亦在不融合至骨髓瘤细胞的情况下直接从抗 原-阳性B细胞分离抗TOGFR- β抗体。使用此方法，获得数种完整人抗TOGFR- β抗体（亦 即具有人可变结构域与人类恒定结构域的抗体）；以此方式所生成的示例性抗体命名如 下：Η4Η3394Ρ、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、 H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S。
[0113] 依据本实施例方法所生成的示例性抗I3DGFR-β抗体的某些生物性质详细描述于 下面的实施例中。 实施例2.重链与轻链可变区氨基酸序列
[0114] 表1显示所选的抗H)GFR-f3抗体的重链与轻链可变区氨基酸序列及其对应的抗 体标识符号。 表1
[0115] 抗体在本文中通常以下列命名法来意指：Fe前缀（例如〃HIM，〃〃H2M，〃〃H4H〃），接 着是数字标识符号（例如表1中所示的〃3299, 〃〃3363, 〃或〃3094〃），然后为〃P，〃〃N〃或〃S〃 后缀。因此，依据这个命名法，抗体在本文可称作例如〃H1M3299N，〃〃H2M3363N，〃〃H4H3094, 〃 等。本文中所用抗体命名的H1M、H2M和H4H前缀表示抗体的特定Fe区同种型。例如，〃 HIM" 抗体具有小鼠 IgGIFc，而〃H4H〃抗体具有人类IgG4Fc。如本领域普通技术人员所理解，具 有特别的Fe同种型的抗体可转换成具有不同Fe同种型的抗体（例如，具有小鼠 IgGlFc的 抗体可转换成具有人类IgG4Fc的抗体，等.），但在任何情况下，可变结构域（包括CDR)-由 表1中所示数字标识符号所提示-保持相同，并且预期结合性质为相同或基本相似的，无论 Fe结构域的性质如何。 下列实施例中所用的对照构建体
[0116] 下面实施例中包括抗I3DGFR-β对照抗体供比较之用。对照抗体在此侖名为对照 I:人类抗I3DGFR-β抗体，具有〃2C5〃的重链和轻链可变结构域序列如US 7, 740, 850中所 述。 实施例3.如通过表面等离子共振测定的抗体与人TOGFR-β的结合
[0117] 使用实时表面等离子共振生物传感器（Biacore Τ100, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)测定法在25 °C和37 °C测定抗原结合选择的纯化的抗人 TOGFR-β单克隆抗体的结合亲和力和动力学常数。表达为小鼠 Fe (前缀HIM ;H2M)或人 Fe (前缀H4H)的抗体捕获在其各自的抗Fe传感器表面上（Mab捕获形式）。以50 μ L/min的 流速在捕获有抗I3DFR-β单克隆抗体的表面上注射不同浓度的可溶单体TOGFR-β构建体 (hPDGFRb·mmh[SEQIDN0:337]、食蟹猴PDGFRb·mmh[SEQIDN0:340])或二聚体PDGFR-β 构建体（人 PDGFRb. mFc [SEQ ID NO: 338]或人 PDGFRb. hFc[SEQ ID NO: 339])。通过处理 并使用Scrubber 2. 0曲线拟合软件将数据拟合至1:1结合模型测定动力学缔合（ka)和解 离（kd)速率常数。结合解离平衡常数（K d)与解离半寿期（t1/2)是由如下的动力学速率常 数计算的：心(1〇=1^/\;且1:1/2(111；[11) = (1112/(60*1^)。不同抗^^1?-|3单克隆抗体的动 力学结合参数显示于表2至5中。（NB =在使用的条件下未观察到结合；NT =未测试）。 表2:25°C时抗I3DGFR- β抗体（小鼠 Fc形式）与单体和二聚体TOGFR- β构建体的结 合特征
表3:25°C时抗roGFR-β抗体（人Fc形式）与单体和二聚体TOGFR-β构建体的结合 特征
[0118] 如表2-5中所示，本发明的若干抗I3DGFR-β抗体展示了对人和食蟹猴I 3DGFR-β 构建体的亚纳摩尔亲和力。此外，若干克隆显示较之参照（对照I)抗体更紧（较低的Kd) 的与roGFR-β构建体的结合。 实施例4.抗TOGFR- β抗体阻断TOGF配体对TOGFR- β的结合 Α.使用基于ELISA的免疫测定法评价的受体/配体阻断
[0119] 首先用基于ELISA的免疫测定法评价本发明的某些抗人TOGFR-β抗体阻断受体 与其配体I 3DGF-BB结合的能力。简而言之，用人roGF-BB(2yg/mL)包被平板。单独地，在 室温（25°C )将 250pM 的生物素化的可溶 hPDGFR- β · mmh (〃biot-hPDGFR- β -mmh, 〃SEQ ID N0:337)与系列稀释的抗TOGFR-β抗体（O-IOOnM)预混合lhr。将经平衡的TOGFR-β/抗 体溶液添加至配体包被的平板，允许孵育lhr，并洗涤。使用HRP缀合的链霉亲和素检测结 合的biot-hFOGFR-IB . mmh的水平。使用Prism软件分析数据并将1(：5(|值计算为达到与配 体结合的1^06?1?-|3-1111]111降低50%所需要的抗体的量。也计算最大阻断值并反映相对于 基线抗体阻断的能力。在剂量曲线上的恒定量250pM bi〇t-hroGFR-f3-mmh处测量的吸光 度被定义为〇%阻断，并且没有添加的I3DGFR-β的吸光度被定义为100%。含有最高抗体 浓度的孔的吸光度测定了最大阻断百分比。结果在表6中显示。（〃Ε〃提示抗体是增强剂， 即，在存在一些浓度的抗体时，较之缺乏抗体时信号更高。） 表6:抗TOGFR- β抗体阻断TOGF-BB与TOGFR- β的结合
*指示三次单独实验的平均IC5Q。
[0120] 如表6中所示，本发明的若干抗体有力地阻断了 TOGFR- β与其天然配体TOGF-BB 的相互作用，IC5tl值从约7. 6ηΜ(Η1Μ3299Ν)至约66pM(H4H3107S)，并且某些抗体增强了受 体-配体相互作用（例如，H4H3097S, H4H3098S和H4H3102S)。 B.使用实时生物传感器测定法评估受体/配体阻断
[0121] 也使用实时SPR生物传感器测定法（Biacore 3000)评价了选择的抗人TOGFR- β 抗体阻断配体（PDGF-BB，H)GF-DD和TOGF-AB)与人TOGFR-β结合的能力。
[0122] 简而言之，在用多克隆兔抗小鼠 Fc抗体衍生（共价偶联）的Biacore传感 器表面上捕获 400RU 的可溶人 PDGFR-0.mFc(SEQ ID NO: 338) (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)。用300nM的选择的抗F1DGFR-β抗体饱和捕获的表面4分钟， 然后在25°C注射30ηΜ配体（PDGF-BB，TOGF-DD或TOGF-AB)额外4分钟。贯穿于测定法过 程中监控实时结合响应并与在不存在捕获的抗体的条件下在衍生化的捕获的对照表面上 应用I 3DGF配体时测量的结合响应比较。结果在图1中说明。
[0123] 如图1中所见，全部抗体展示出阻断I3DGF-BB和TOGF-AB配体的能力，较少的抗 体能够有效率地阻断I 3DGF-DD，当与无抗体对照比较时。值得注意的是抗体H4H3094P、 H4H3374N和对照I，其展示了当配体在Biacore传感器表面上应用时最少量的RU响应。 实施例5.抗TOGFR-β抗体的交叉竞争分析
[0124] 实施交叉竞争测定法以评价选择的抗体彼此竞争结合人TOGFR-β的能力。简而 言之，在抗 Penta-his Octet 传感器尖端（ForteBio Corp. ,Menlo Park, CA)上捕获可溶 人 roGFR-0.mmh(SEQ ID N0:337)。用第一抗 PDGFR-β 抗体（Mab#l ;50yg/mL)饱和每个 TOGFR- β . mmh包被的传感器尖端5分钟。随后，用第二抗TOGFR- β抗体（Mab#2)的溶液 饱和每个传感器尖端。然后监控Mab#2结合与Mab#l预复合的TOGR- β . mmh的实时响应。 根据制造商的说明（ForteBio Corp. ,Menlo Park, CA)在Octet HBST缓冲液中的Octet RED384生物传感器上在25°C进行全部测定法，流速为lOOOrpm。结果在图2中说明。
[0125] 低于0.1 nM的结合响应在图2中以黑色或灰色阴影显示并提示对应的抗体对彼此 竞争结合I3DGFR-β。大于0.2nM的结合响应（在图2中的白框中显示）指示不彼此竞争结 合TOGFR-β的抗体对。
[0126] 此实施例的结果提示本发明的抗H)GFRf3抗体可以基于表位结合特征分组为两 个不同的"箱子"：箱1包括对照I，H4H3365N、H4H3374N、H4H3103S和H4H3094P。箱2包括 H4H3099S、H4H3107S、H4H3305N和H4H3310N。此实施例的结果提示箱1的抗体与箱2的抗 体结合I 3DGFR-β上的不同区域。 实施例6.用抗TOGFR-β抗体抑制配体介导的受体激活和MPK信号传递
[0127] 为了进一步表征本发明的抗roGFR-β抗体，开发生物测定法以检测roGFR-β 通过其已知的结合配体中的两种，I3DGF BB和DD的激活。TOGFR-β受体及其配体之间 的相互作用对于诱导多种细胞过程包括增殖、存活、迀移和形态发生是必要的（Hoch和 Soriano, 2003, Development 130:5769-4784) JDGF 受体是受体酪氨酸激酶并在由 PDGF BB 和DD激活后通过α和β受体的同源或异源二聚化形成。在激活后，诱导自体磷酸化并引 发若干信号转导途径级联，包括Ras-MPK(促细胞分裂原活化的蛋白激酶）途径。
[0128] 为了检测通过配体结合H)GFRf3的MAPK信号转导途径的激活，生成稳定的ΗΕΚ293 细胞系以表达全长人roGFR-β连同荧光素酶报告子（血清响应性元件[SRE-荧光素酶])。 在96孔板中接种HEK293/hroGFR-f3细胞并在含有0. 1 % FBS的低血清培养基中培养过 夜。在孵育后，将浓度范围从IOOnM至0.002nM的1:3系列稀释的TOGF BB或DD添加至细 胞以测定剂量响应。为了检查配体激活的MPK信号传递级联的抑制，抗体以1:3系列稀 释并以范围从IOOnM至0. 002nM的浓度添加至细胞。I3DGF BB和DD浓度分别在250pM和 400pM保持恒定并且在5. 5h后检测荧光素酶活性。TOGF BB和DD激活人TOGFRb，EC5tl分别 为0. 04-1. IlnM和0. 34-1. 82nM。对于每种抗体测定了抑制50 %的TOGFR-β介导的信号 传递所需要的抗体浓度（IC5tl)。结果总结于表7中。（NB =无阻断；同种型1 =小鼠 IgG阴 性对照不相关抗体；同种型2 =人IgG阴性对照不相关抗体）。 表7:抗TOGFR- β抗体阻断TOGF-BB和TOGF - DD配体激活的ICwi值
[0129] 如表7中所示，本发明的若干抗TOGFR-β抗体强有力地阻断了配体依赖性 roGFR-β激活，IC5tl处于亚纳摩尔范围。此外，小鼠 IgG (同种型1)和人IgG (同种型2)阴 性对照均未阻断受体的配体激活。 实施例7. TOGFR-β表达细胞上的抗TOGFR-β抗体的内化
[0130] 为了研宄抗体介导的受体内化，使用经改造以表达人roGFR-β的细胞（ΗΕΚ293/ SRE-luc/PDGFRb细胞）进行试验。简而言之，在完全培养基（DMEM中10%FBS，Pen/StMp/ Glut，NEAA,和 G418)中铺板 20,000HEK293/SRE Luc/PDGFRb 细胞 / 孔并在 4°C用 IOyg/ ml的抗F1DGFR-β抗体染色30min。洗绦细胞两次并在4°C用Dylight 488缀合的Fab山 羊抗人 IgG 二抗（10ug/mL ;Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)染 色30min。之后，在37°C孵育细胞2小时以允许受体内化。通过在4°C用抗Alexa fluor 488 (Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)孵育洗绦的细胞 45min 淬灭 Alexa-488 焚光以 区分表面结合的抗体与内化的抗体。使用ImageXpress Micro XL(Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA)取得图像并使用 Columbus 软件（Perkin Elmer, Waltham, MA)进行点分 析。通过比较每个抗体的淬灭的染色（即内化的抗体）与对照1抗体的淬灭的染色计算相 对内化。结果在表8中总结。 表8:选择的抗TOGFR- β抗体的内化
[0131] 如表8中所示，在此测定法形式中研宄的全部抗roGFR-β抗体显示稳健的内化， 反映了抗体在多种治疗环境中有效地靶向H)GFR-f3表达细胞的潜在能力。 实施例8.抗TOGFR-β抗体在TOGFR-β上的不同结构域中结合
[0132] I3DGFR-β的胞外部分由称为D1-D5的5个Ig样C2型结构域组成。需要Dl至D3 用于高亲和力配体结合。在此实施例中，进行实验以测定哪（几）个胞外结构域与本发明 的某些抗I 3DGFR- β抗体相互作用。
[0133] 对于此实验，使用四种不同的TOGFR-β胞外结构域构建体：Dl (SEQ ID NO: 342)， D1-D2(SEQ ID N0:343)，D1-D3(SEQ ID N0:344)，和 D1-D4(SEQ ID N0:345)，以及全长 TOGFR-β。通过表面等离子共振（Biacore)就结合多种构建体测试四种不同的抗roGFR-β 抗体。简而言之，经由抗人Fe CM5芯片捕获150-200RU的抗TOGFR^抗体。接下来，以50nM 的浓度在抗体结合的表面上应用个别的结构域构建体，或全长PDGFR β。测量多种抗体结合 多种结构域构建体的能力。结果显示在表9中。（-)=未观察到结合；(+)=观察到结合； ND =未测定· 表9.观察到的选择的抗TOGFR- β抗体与TOGFR- β结构域和全长TOGFR- β蛋白的结 合
[0134] 如表9中所总结的，全部抗体结合全长TOGFR-β。两个抗体，H4H3094P和 H4H3374N，测定为结合结构域2。令人感兴趣的是这两个抗体也是基