括，例如大腿或上臂。
[0177] 通常皮下注射限制在大约2 ml或小于2 mL的体积。这是由于粘弹性组织抵抗和 背压（注射时产生）以及患者感觉到的疼痛。因此，由于单次皮下注射仅可提供小体积的 抗体制剂，具有包含至少160 mg/mL的抗-CD 20抗体例如维妥珠单抗抗体的制剂可能是有 利的。这可允许以适于皮下注射的小液体体积施用高剂量的抗体。
[0178] 本发明的液体药物制剂或HCLF可以单位计量形式（例如在安瓿或预装注射器或 笔式注射器中）或以多剂量形式（例如在多剂量容器或输注泵中）提供。
[0179] 本发明的液体药物制剂或HCLF可单独或与本领域技术人员认为适于治疗上文提 到的任一疾病的任何其它治疗剂组合施用。所述其它治疗剂可与根据本发明的制剂单独、 同时或相继施用。此类其它治疗剂的实例是例如细胞毒素剂、抗血管生成剂、皮质类固醇、 抗体、化疗、激素、抗炎药和免疫调节剂。
[0180] 可单独或与所述液体药物制剂组合施用的此类治疗剂的实例可选自抗有丝分裂 剂、抗激酶试剂、烷化剂、抗代谢药、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、细胞凋亡剂及其组合。 化疗药例如可选自：药物，例如长春花生物碱、蒽环类抗生素、表鬼白毒素、紫杉烷类、抗代 谢药、烷化剂、抗激酶试剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和细胞凋亡 剂，尤其是阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、CPT-II、喜树碱，以及来自这些和其它类抗癌剂的其 它药物。
[0181] 此类治疗剂的其它实例描述于例如国际专利申请W02003/068821中，其内容并入 本文中并特此引用。
[0182] 本发明进一步描述于以下实施例中，其仅仅是用于说明本发明的具体实施方案的 目的，并且也不被解释为以任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0183] 实施例1 高度浓缩的液体制剂的制备 将维妥珠单抗的药物物质整体浓缩并经由切向流过滤（TFF)渗滤到最终的缓冲系统 中。示例性药物物质整体包含60 g/L维妥珠单抗、10 mM组氨酸、120 mM蔗糖，pH为5. 5， 如图2所描绘。然后将最终的药物物质整体无菌过滤并储存在-40 °C以下。
[0184] 本发明使用的赋形剂通常是符合药典规范（例如欧洲药典）的高纯度和高质量 的。
[0185] 所述高度浓缩的液体制剂的制备用30 kDa膜经由切向流过滤来进行。首先，用根 据本发明的新制剂缓冲系统交换最终整体（bulk)的缓冲液。该渗滤（DF)步骤示例性地示 于图2中。通常，进行8倍体积交换以除去原缓冲液。在下一步骤（UF，超滤）中，将溶液 浓缩至大约285 g/L的维妥珠单抗。然后用渗滤缓冲液冲洗过滤单元以使损失最小化。冲 洗后浓度为大约200 g/L。然后加入剩余的赋形剂作为储备溶液。在mAb药物产品混合物 下，通过用制剂缓冲液稀释将最终浓度调节至160 g/L，如图2所描绘的。
[0186] 然后通过孔径0. 2 Mm的过滤器无菌过滤药物产品混合物阶段的所有制剂并在无 菌条件下填充入2 mL玻璃小瓶中。用涂有ETFE的橡胶塞塞住小瓶并用铝螺旋盖密封。
[0187] 将不同制剂经受各种胁迫条件：例如升高的温度（25和40 °C )、机械胁迫（摇动 24 h)和冻融胁迫。此外，在冷藏温度（2-8 °C )下测试所有样品的长期稳定性。
[0188] 在施加胁迫测试之前和之后通过以下分析方法分析样品。
[0189] 表1分析方法概述
[0190] 根据本发明的用于提供抗体的高浓度液体制剂的进一步示例性方法在图1和3中 描绘。
[0191] 实施例2 为维妥珠单抗的高度浓缩液体制剂的两种制剂比较：制剂A (磷酸盐-柠檬酸盐-甘露 醇缓冲液）与制剂B(组氨酸-llj梨醇缓冲液） 以下制剂在25 °C储存三个月后进行比较： 制剂A:150 mg/mL维妥珠单抗、甘露醇12 mg/mL、氯化钠6.2 mg/mL、磷酸氢二钠七水 合物2. 3 mg/mL、磷酸二氢钠一水合物0. 76 mg/mL、朽1檬酸一水合物1.3 mg/mL、朽1檬酸钠二 水合物 〇? 34 mg/mL、聚山梨酯 80 1. 0 mg/mL，pH 5. 2 制剂B :150 mg/mL维妥珠单抗、山梨醇50 mg/mL、L-组氨酸30 mM、聚山梨醋20 0? 1 mg/mL、乙酸适量，pH 5.2。
[0192] 表2制剂A和B在25 °C储存三个月后的比较
[0193] 如可从表2获得的，制剂B (其为根据本发明的包含组氨酸缓冲系统的制剂）明显 优于制剂A，尤其是考虑到参数：聚集、片段和有效浓度。含量测定、显微镜下才能看见的微 粒和效力在可比范围内。
[0194] 因此明确显示，组氨酸不仅作为缓冲物质，还在较高浓度下稳定维妥珠单抗。
[0195] 实施例3 关于组氨酸和pH的制剂优化 使用长期储存条件对实施例2中定义的制剂B进行优化。
[0196] 特别地，研宄以下两个因素：组氨酸浓度（10至50 mM)和pH(4. 8至6. 2)。
[0197] 响应为如表5中所示的分析参数。使用采用软件Modde(Umetrics)的实验的全因 子统计设计。证明聚集是受两个因素组氨酸浓度和pH显著影响的唯一分析参数（响应）。 所有其它响应不受实验范围内的因素影响。
[0198] 图4中描绘对聚集的响应等值线图。在相当低的pH和高组氨酸浓度下，可减慢聚 集倾向。然而，可在另一组实验中显示（这里未示出），组氨酸浓度高于50 mM(估计高达 1〇〇禮）不再进一步减少聚集。进一步考虑，对于皮下制剂，pH应接近7. 4的生理pH。因 此可调整山梨醇的浓度以提供溶液的生理张力。
[0199] 实施例4 关于聚山梨酯20浓度的制剂优化 通常已知，蛋白质溶液在机械胁迫时倾向于形成不溶性聚集体。通常将这种现象解释 为表面诱导的蛋白降解并可通过将非离子表面活性成分例如聚山梨酯引入到制剂中来减 少。
[0200] 将制剂C (维妥珠单抗160 g/L、山梨醇40 g/L、L-组氨酸30 mM，pH 5. 5)用于这 些实施例中以确定将需要哪种浓度的聚山梨酯20来稳定液体制剂以对抗机械胁迫和冻融 胁迫时的微粒形成。测试四个水平的聚山梨酯20 1、0. 2和0. 3 g/L。
[0201] 表3制剂C和不同的聚山梨酯20浓度
[0202] 结果总结于下表中： 表4具有不同水平的聚山梨酯20的制剂C的比较
[0203] 正如预期的，聚山梨酯20的加入对通过微流成像（MFI)所测定的（显微镜下才能 看见的）微粒的形成有很大影响。冻融后微粒计数仅轻微升高且〇. 1 mg/mL的聚山梨酯20 足以防止微粒形成。然而，摇动胁迫后微粒计数要高得多。0.1 mg/mL的聚山梨酯20的加 入不足以完全避免溶液中的显微镜下才能看见的微粒。
[0204] 具有不同水平的聚山梨酯20的四种制剂也置于长期储存条件（2_8°C )下以验证 正常储存期间维妥珠单抗与表面活性剂的相容性。储存12个月后，显而易见的是，所研宄 的聚山梨酯水平对任何测试的质量属性（参数）均无影响。因此，0.2 mg/mL的聚山梨酯 20似乎是稳定维妥珠单抗以对抗微粒形成的理想量（优化制剂C)。
[0205] 实施例5 $丨侧中不同抗体浓度的稳定性测试 在优化制剂C(维妥珠单抗160/190/220 g/L，山梨醇40 g/L，L-组氨酸30 mM，pH 5. 5， 聚山梨酯20 0.2g/L)中测试不同浓度的维妥珠单抗，并在不同温度和湿度条件下经特定 时间段测定稳定性。
[0206] 表5至11的稳定性结果分别显示对于观察的时间段、温度和相对湿度，优化制剂 C中维妥珠单抗的所有测试浓度的可接受值。
[0207] 实施例6 用优化制剂C中的维妥珠单抗治疗患者 在用甲氨蝶呤（MTX)或甲氨蝶呤加抗肿瘤坏死因子（抗TNF)生物治疗控制不足的中 至重度类风湿关节炎（RA)受试者中进行随机、双盲、安慰剂对照、多中心、多国II期、4臂平 行组试验，比较三种不同皮下（s.c.)剂量的抗CD20单克隆抗体维妥珠单抗与安慰剂作为 甲氨蝶呤的附加治疗。筛选400例受试者以允许320例合格受试者以1:1:1:1的比例随机 分配到四个处理臂中（每臂80例受试者）。
[0208] 维妥珠单抗是靶向CD20表位的人源化单克隆IgGl抗体，其在成熟B细胞表面广 泛表达，从而导致它们耗尽。通过皮下注射施用维妥珠单抗，不用类固醇前驱给药，且相比 于其他抗CD20疗法预期提供改善的便利性和成本效益。
[0209] 所述试验设计为三种不同剂量水平（160 mg、320 mg和640 mg)的维妥珠单抗与 安慰剂的比较，每周施用一次达四周（第1、8、15和22天）通过皮下注射至中至重度RA受 试者（累积的维妥珠单抗剂量分别为640 mg、1280 mg和2560 mg)。所有受试者继续用甲 氨蝶呤稳定联合给药。在第24周评估主要终点-美国风湿病学会20 (ACR20)响应率。
[0210] 预期通常良好耐受皮下维妥珠单抗。预期无临床显著观察或治疗相关的严重不良 事件。
[0211] 皮下施用至个体患者的总体积是每次注射2.0 mL。总之，预期皮下维妥珠单抗快 速地、舒适地和安全地递送至患者。预期患者体验是良好的，其是III期试验中维妥珠单抗 的支持测试。
【主权项】
1. 一种用于制备具有抗体浓度Ch的抗体的高浓度液体制剂的方法，所述方法包括步 骤： a) 提供含有起始浓度Cs的抗体的溶液； b) 超滤步骤（a)的溶液以获得具有抗体中间浓度C1的溶液，其中C1为至少约260 mg/ HlL ;和 C)将步骤（b)的溶液稀释至抗体浓度Ch以获得高浓度液体制剂。2. 根据权利要求1的方法，其中步骤（a)的溶液进一步含有缓冲剂，所述缓冲剂任选 为氨基酸，例如组氨酸。3. 根据权利要求1或2的方法，所述方法进一步包括在步骤（a)与步骤（b)之间用缓 冲溶液渗滤步骤（a)的溶液的步骤，其中所述缓冲剂任选为氨基酸，例如组氨酸。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（b)中经受超滤的溶液含有40 mM 组氨酸并且具有5. 45的pH值。5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（b)中经受超滤的溶液基本上不 含或不含有张力改性剂，例如蔗糖。6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（b)中经受超滤的溶液基本上不 含或不含有表面活性剂，例如聚山梨酯。7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体为抗-CD20抗体和/或IgG抗 体，任选所述抗体为维妥珠单抗抗体。8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述高浓度液体制剂具有至少155 mg/mL 的抗体浓度Ch。9. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤（b)在超滤装置中进行并且进一步 包括在步骤（b)与步骤（c)之间用缓冲溶液冲洗超滤装置的步骤，其中所述缓冲剂任选为 氨基酸，例如组氨酸。10. -种通过将未冷冻干燥的抗体或其片段与包含氨基酸的水溶液混合来稳定液体 药物制剂中浓度为至少155 mg/mL的抗-CD20抗体或其片段的方法，所述氨基酸任选为组 氨酸。11. 根据权利要求7的方法，其中所述抗-CD20抗体为维妥珠单抗抗体。12. -种维妥珠单抗抗体或其片段的液体药物制剂，所述液体药物制剂包含至少155 mg/mL维妥珠单抗抗体或其片段和氨基酸，任选组氨酸。13. 根据权利要求12的液体药物制剂，其中所述维妥珠单抗抗体或其片段的浓度为 至少175 mg/mL，优选至少190 mg/mL。14. 根据权利要求12或13的液体药物制剂，其中所述维妥珠单抗抗体或其片段的浓 度为至少200 mg/mL，优选至少220 mg/mL。15. 根据权利要求12至14中任一项的液体药物制剂，其中所述氨基酸，任选组氨酸， 的浓度在I niM至100 niM的范围内。16. 根据权利要求15的液体药物制剂，其中所述氨基酸，任选组氨酸，的浓度在10 mM 至60 mM的范围内，任选在20 mM至50 mM的范围内。17. 根据权利要求12至16中任一项的液体药物制剂，其进一步包含表面活性剂，任选 非离子表面活性剂。18. 根据权利要求17的液体药物制剂，其中所述表面活性剂，任选非离子表面活性 剂，为聚山梨醋，任选聚山梨酯20或聚山梨酯80。19. 根据权利要求17或18的液体药物制剂，其中所述表面活性剂，任选非离子表面活 性剂，以至少〇. 01 mg/mL的浓度存在，任选在0.1 mg/mL至I mg/mL的范围内。20. 根据权利要求12至19中任一项的液体药物制剂，其进一步包含张力改性剂。21. 根据权利要求20的液体药物制剂，其中所述张力改性剂为山梨醇和/或甘露醇， 任选所述张力改性剂的浓度在5. 5 mM至550 mM的范围内。22. 根据权利要求12至21中任一项的液体药物制剂，其具有4. 8至7. 0范围内的pH 值，任选5. 5 ± 0. 3的pH值。23. 根据权利要求12的液体药物制剂，其包含 a) 至少160 mg/mL维妥珠单抗抗体或其片段； b) 220 mM山梨醇； c) 30 mM组氨酸； d) 0? 2 mg/mL聚山梨醋20 ;和 具有5. 0至6. 0范围内的pH值，任选5. 5±0. 3。24. 根据权利要求12至23中任一项的液体药物制剂，所述液体药物制剂用作药剂。25. 根据权利要求24的液体药物制剂，其中所述药剂用于皮下施用。26. 根据权利要求12至25中任一项的液体药物制剂，其用于治疗癌症或非恶性疾病， 任选炎性或自身免疫性疾病。27. 根据权利要求12至26中任一项的液体药物制剂，其用于治疗选自以下的疾病：伯 基特淋巴瘤、EB病毒感染、B-细胞白血病、慢性淋巴细胞性B细胞白血病、急性淋巴细胞性 白血病、淋巴白血病、幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、边缘 区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、免疫母细胞型大细胞淋巴瘤、套细 胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、浆细胞瘤、前体细胞淋巴细胞白血病-淋巴 瘤、肿瘤病毒感染、华氏巨球蛋白血症、类风湿性关节炎、免疫增生性障碍、幼淋巴细胞淋巴 瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、免疫母细胞型大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、 淋巴增生性障碍、异型蛋白血症、前体细胞淋巴细胞白血病-淋巴瘤、血小板减少性紫癜、 特发性血小板减少性紫癜（ITP)、血液凝固障碍、血小板疾病、血蛋白病、血液病、出血性障 碍、凝血障碍、淋巴疾病、紫癜、血小板减少、血栓性微血管病、凝血障碍、血管疾病、系统性 红斑狼疮（SLE)、多发性硬化症、风湿性疾病、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银肩病关 节炎、银肩病、炎性肠病，例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎，结缔组织疾病、疱瘆病毒感染和/ 或DNA病毒感染。
【专利摘要】本发明提供一种用于制备抗体或其片段的高浓度液体制剂(HCLF)的方法。本发明还涉及一种用于稳定液体药物制剂中的抗-CD20抗体或其片段的方法。此外，本发明涉及一种维妥珠单抗抗体或其片段的液体药物制剂，所述液体药物制剂包含至少155 mg/mL的维妥珠单抗抗体或其片段。
【IPC分类】C07K16/28, A61K39/395
【公开号】CN104955478
【申请号】CN201380056798
【发明人】M.莱斯特, P.斯库夫卡, W.施泰因希尔博, G.贝克, J.沃尔兹, W.伊势
【申请人】塔科达有限责任公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2013年10月31日
【公告号】CA2888579A1, EP2727602A1, EP2914288A1, US20140120086, US20150266965, WO2014068021A1