FastBac/ PCV2a-Cap-PCV2b-Cap 的 BamH I、Not I 双酶切产物。
[0044] 图5显示重组杆状病毒转染Sf9细胞，其中A为正常Sf9细胞（200X)，B为rBac/ PCV2a-PCV2b-Cap 转染 Sf9 细胞（200X)。
【具体实施方式】
[0045] 本发明基于PCV2a_2b双亚型的亚单位疫苗。
[0046] 本发明所用的"免疫原性或免疫原性组合物"指包含至少两种抗原的组合物，所述 抗原能在宿主中引发针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通 常，"免疫应答"包括但不限于以下一种或多种作用：产生或激活抗体、B细胞、辅助T细胞、 抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞，其特异性针对感兴趣组合物或疫苗中 包含的抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，而提高对新发感染的抵抗力和 /或降低疾病的临床严重程度。可通过感染宿主通常所显示症状的减轻或缺失、恢复时间较 短和/或感染宿主中病毒效价降低来表明这种保护作用。
[0047] 本文中，"穿梭载体"或"穿梭质粒"指一种DNA分子，其包含至少一个复制起点、异 源基因（在本文中是PCV20RF2)和允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列。允许 将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列优选侧接于该异源基因。更优选的是，这些侧 接序列至少与该病毒载体序列部分同源。这种序列同源性可允许病毒载体和穿梭载体的分 子之间发生重组，而产生含有该异源基因的重组病毒载体。所述穿梭载体优选包含PCV2a 和 PCV2b 的 0RF2DNA。
[0048] 在更优选的形式中，本发明将从分离PCV2a和PCV2b的0RF2DNA开始。通常，该 DNA可来自已知或未知毒株，因为0RF2DNA似乎在不同分离物中高度保守，序列相同性至少 约为95%。本领域已知的任何PCV2a和PCV2b的0RF2DNA均可用于本发明。SEQ ID N0:1 和3分别显示了 PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的实例。
[0049] 因此，本发明提供了构建含有PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的重组病毒载体 的方法。此方法包括以下步骤：i)将重组PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA克隆入穿梭载 体；和ii)将含有重组PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA的穿梭载体转染到病毒载体中，产 生重组病毒载体。
[0050] 在步骤i)之前还可包括以下步骤：体外扩增PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA ; 将体外扩增获得的PCV2a 0RF2DNA和PCV2b 0RF2DNA克隆到转移质粒中；和用该转移质粒 转化宿主细胞（例如大肠杆菌），使之与杆状病毒骨架载体在该宿主细胞中发生同源重组， 从而制备得到所述穿梭载体。
[0051] 用于构建转移质粒的载体例子包括pFastBac-Dual载体。通常，在pFastBac-Dual 载体的Ppltl启动子下游插入PCV2a的0RF2, P pH启动子下游插入PCV2b的0RF2,获得重组转 移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。或者，也可在P pic^动子下游插入PCV2b的0RF2， 而在Pph启动子下游插入PCV2a的0RF2。此外，可将上述ORF进行合适次数的重复插入。
[0052] 用于构建转移质粒的骨架可以是杆状病毒骨架载体Bacmid。
[0053] 前述步骤ii)通常在昆虫细胞中进行，例如在Sf9细胞中进行。
[0054] 基于制备得到的重组蛋白，本发明提供了一种用于引发抗PCV2a和PCV2b的免疫 应答的药物组合物或免疫原性组合物，该组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。 本文所用术语"药学上可接受的载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释 剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
[0055] 稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露 醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白、乙二胺四乙酸的碱金属盐、海藻糖、和蔗糖等。
[0056] 此外，本发明的药物或免疫原性组合物（例如疫苗）可包含佐剂。本文所用"佐 剂"可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、QS-21，油包水乳液，水包油乳液，水包油包 水乳液。具体说，乳液可基于轻质石蜡油；类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯；链烯，具体是 异丁烯或癸烯硫代寡聚化产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸乙 酯、二（辛酸/癸酸）丙二醇酯、三（辛酸/癸酸）甘油酯或二油酸丙二醇酯；支链脂肪酸 或醇的酯，具体是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活 性剂，具体是山梨聚糖、二缩甘露醇（如油酸脱水甘露醇酯）、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、 异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯（任选乙氧基化），以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共 聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。
[0057] 佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯二酸酐与烯 基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联 的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆。以名称卡巴浦尔出售的产品 (BF Goodrich，Ohio,USA)尤其合适。它们与稀丙基鹿糖或与稀丙基戊赤藓醇交联。其中， 可提及的有卡巴浦尔974P、934P和971P。最优选采用卡巴浦尔971P。在马来酸酐和烯基 衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水 中的溶解产生的酸溶液应予中和，优选中和至生理pH，以产生其中可掺入免疫原性、免疫或 疫苗组合物本身的佐剂溶液。
[0058] 优选每剂量加入约100 μ g-10mg量的佐剂。更优选每剂量加入约500 μ g-5mg量 的佐剂。更优选每剂量加入约750 μ g-2. 5mg量的佐剂。最优选每剂量加入约Img量的佐 剂。
[0059] 在一个优选的实施例中，使用法国SEPPIC MONTANIDE ISA 28VG优质水性佐剂。 在更优选的实施例中，使用法国SEPPIC公司M0NTANIDE ISA28VG水性佐剂与CAM高级聚合 物Carbopol971P的混合物（本文称该混合物为"NeB复合缓释水性佐剂"）。该NeB复合 缓释水性佐剂具有复合缓释双重作用。所述MONTANIDE ISA 28VG能诱发高免疫力，且无副 反应。Carb〇p〇1971P高聚物能使病毒颗粒均匀的分布在交联的高聚合物中，同时在整体和 复微粒释放系统中均具有高效控释作用。优选的，每毫升免疫组合物（例如疫苗成品）中， Carbopol971P添加的比例约为1 μ g-ΙΟΟ μ g，更优选每毫升加入约5 μ g_50 μ g，最优选每 毫升加入约20 μ g的Carbopol971P。
[0060] 本发明组合物中包含的PCV2a和PCV2b Cap蛋白的水平至少为0.2yg抗原/ ml最终免疫原性组合物（μ g/ml)，更优选约0. 2-400 μ g/ml，更优选约0. 3-200 μ g/ml， 更优选约〇. 35-100 μ g/ml，更优选约0. 4-50 μ g/ml，更优选约0. 45-30 μ g/ml，更优选约 0· 6-15 μ g/ml，更优选约 0· 75-8 μ g/ml，更优选约 L 0-6 μ g/ml，更优选约 L 3-3. 0 μ g/ml， 更优选约 I. 4-2. 5 μ g/ml，更优选约 I. 5-2. 0 μ g/ml。
[0061] 本文所述组合物可制成已知的可注射、生理可接受的无菌溶液。对于制备用于胃 肠道外注射或输注的即用型溶液而言，易于获得等渗水溶液，如盐水或相应的血浆蛋白质 溶液。
[0062] 本发明的该免疫原性组合物还可包含一种或多种其它免疫调节剂，如白介素、干 扰素或其它细胞因子。该免疫原性组合物也可含庆大霉素和硫柳汞。
[0063] 本发明还提供一种药盒，其装有本发明免疫原性组合物和说明手册，用以指导技 术人员将所述免疫原性组合物给予所需的对象，如猪。
[0064] 本发明还包括将本文所述任何组合物用作药物，优选用作兽用药物，更优选用作 疫苗的应用。而且，本发明也涉及本文所述任何组合物用于制备能减轻PCV2感染相关性 临床症状的严重性的药物的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，尤其是PCV2a和 PCV2b单独或混合感染，更优选用于小猪。
[0065] 本发明还包括用于（i)预防PCV2感染或再次感染或（ii)减少或消除PCV2所致 对象临床症状的方法，所述方法包括将本文所述任何免疫原性组合物给予需要的对象。所 述对象优选猪。优选通过肌肉内给予该免疫原性组合物。优选给予一个剂量或两个剂量的 该免疫原性组合物，其中一个剂量优选含有至少约3 μ g PCV2a和PCV2b 0RF2蛋白，更优选 约3-4 μ g，和至少约10-100 μ g卡巴浦尔，优选约40 μ g卡巴浦尔。通常，一个剂量的体积 约为2ml。
[0066] 下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并 不限制本发明的保护范围。实施例中所用的实验条件、试剂，除非另有说明，否则为本领域 常规的实验条件和试剂。
[0067] 1、共表达载体的构建