aP)以及人类毛发真皮乳突细胞被使用遍 及实验性研究。人类前列腺癌细胞株（PC-3与LNCaP)被培养于补充有10%胎牛血清（fetal bovine serum)的杜贝可氏最低基本培养基（Dulbecco's minimum essential medium)中。 人类毛发真皮乳突细胞（HHDPC)被维持于具有10%胎牛血清（fetal calf serum)的RPMI 培养基中。前列腺癌细胞（lx IO5)被接种于24-井培养盘（24-well plate)的各井中并 且于一具有5% 0)2的37°C培养箱中被培养过夜。
[0067] 细胞转录分析（Cell Transcription Assay):在实施例1、3、4以及6中，小鼠乳 腺肿瘤病毒-焚光酶（mouse mammary tumor virus-luciferase, MMTV-Luc)报导子分析 (Promega，Madison，WI)被用来测量荧光酶活性。荧光酶通常被用来作为一报导子以评估在 细胞中AR所调控的转录活性。
[0068] 在实施例2中，前列腺特异性抗原-焚光酶（prostate specific antigen-luciferase，PSA_Luc)报导子分析（Promega, Madison, WI)被用来测量焚光酶活 性。
[0069] 统计学分析（Statistical Analysis):统计学显著性（statistical significance)是借由变异数分析（analysis of variance) [t_试验（t-test)]而被计算。 若p值< 0. 05,组别之间的差异被认为是显著的。
[0070] 实施例
[0071 ] 实施例1.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR转录活性
[0072] 敏诺西迪在前列腺癌细胞AR转录活化上的活体外效用评估被进行。前列腺 癌细胞是如先前所述而被培养。PC-3细胞是依据制造商的操作指南来使用Superfect 套组（购自于Qiagen Science, MD, USA)而被转染以300ng的pSG5-AR以及700ng的 MMTV-LUC 报导子质体（被描述于 K. Nishimura et al·，（2003) "Modulation of androgen receptor transactivation by gelsoI in:a newly identified androgen receptor coregulator· "Cancer Res 63(16):4888-4894 以及 S. Yeh et al·，（1996) "Cloning and characterization of a specific coactivator, ARA70, for the androgen receptor in human prostate cells. nProc Natl Acad Sci USA 93(11) :5517-5521 中），而LNCaP 细胞 是使用Superfect套组而被转染以1000 ng的MMTV-LUC报导子质体（描述于K. Nishimura et al. 2003 以及 S. Yeh et al. 1996 中）。
[0073] 该多个经转染的前列腺癌细胞被培养历时16h，接着在具有或没有10 3至10 6M的 敏诺西迪下被处理以乙醇和/或InM DHT历时另一 16h。
[0074] 该多个前列腺癌细胞被收取以及荧光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测 量。图IA与IB显示DHT增强荧光酶活性以及在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录，而敏 诺西迪以一剂量依赖性（dose-dependent)的方式减低在DHT存在下的AR所调控的焚光酶 活性。
[0075] 实施例2.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录以及转译
[0076] 敏诺西迪在AR转录上的活体外效用评估被进行。前列腺癌细胞是如前面所述而 被培养。
[0077] PC-3细胞是使用Superfect套组而被转染以300ng pSG5-AR以及700ng PSA-Luc (I. 5kb)质体（被描述于 Κ· Nishimura et al. 2003 以及 S. Yeh et al. 1996 中）以 及被培养历时16h。该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10 3至10 6M的敏诺西迪下 被处理以乙醇、PSG5-AR和/或InM DHT历时另一 16h，以及为了荧光酶活性而被收取。图 2A显示增强荧光酶活性以及在前列腺癌细胞中的AR所调控的转录，而敏诺西迪在以一剂 量依赖性的方式减低在DHT存在下的荧光酶活性以及AR所调控的荧光酶活性上是有效的。
[0078] 前列腺癌细胞（LNCaP)被处理以DMSO或10 3至10 5M的敏诺西迪历时24h。该多 个细胞被制备而用于在SDS/PAGE凝胶上的电泳（electrophoresis)，接而被转印至硝化纤 维素（nitrocellulose) (Minipore，Billerica, USA)上。
[0079] AR、PSA以及β -肌动蛋白（beta-actin)蛋白质是分别使用抗-AR (来 自于 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA 的 N-20)、抗 _PSA(来自于 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA 的 C-19)或抗-微管蛋白（来自于 Millipore，Billerica，USA的MAB1501)而被鉴别。影像是使用碱性磷酸酶受体彩色套组 (alkaline phosphatase substrate color kit) (Bio-Rad, Hercules, USA)而被显不。
[0080] 图2B显示敏诺西迪在以一剂量依赖性的方式来抑制在DHT存在下的AR所调控的 PSA蛋白质表现上是有效的。
[0081] 为了评估敏诺西迪在高浓度下可能的非专一性作用，一控制研究被进行而在 糖皮质素受体（glucocorticoid receptor, GR)转录活性上测试不同浓度的敏诺西迪 (1-100 μ M)。如图2C所示，在报导子分析中最高浓度的敏诺西迪（100 μ M)有影响在PC-3 细胞中的GR转录活性，而较低的浓度（1-10 μΜ)则没有。该多个数据暗示：当于高浓度下 使用时，敏诺西迪（一小疏水性分子）可在细胞中具有多重标的。
[0082] 实施例3.敏诺西迪抑制在前列腺癌细胞中的AR辅因子（cofactor)交互作用
[0083] 许多AR共活化剂透过似FxxLF要素（FxxLF-like motif)结合至AR的配位子-结 合领域以增强AR转录活化。ARA54C是一已被显示具有对于AR的高配位子所诱导的亲和 性的AR共活化剂。在ARA54C与AR之间的交互作用是借由在该AR配位子-结合领域中的 FxxLF要素所媒介。
[0084] 敏诺西迪在AR辅因子交互作用上的活体外评估是于前列腺癌细胞中所进行。前 列腺癌细胞（PC-3)是如前面所述而被培养。PC-3细胞是使用Superfect套组而被转染 以300ng的pG5_LUC报导子基因质体（被描述于K. Nishimura et al. 2003以及S. Yeh et al. 1996中）、350ng的在pCMX-GAL4载体中的AR共活化剂（ARA54C)或肽（FxxLF)以及 350ng的VP16-AR，并且被培养历时16h。
[0085] 该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10 3至10 5M的敏诺西迪下被处理以 乙醇以及InM DHT历时16h。AR-FxxLF肽与AR-ARA54C的交互作用是使用哺乳动物二-杂 和分析（Mammalian two-hybrid assay)而被检测，而焚光酶活性是使用MMTV-Luc报导子 分析而被测量。
[0086] 图3A显示敏诺西迪抑制在DHT存在下的含FxxLF的肽与AR的交互作用，因此以 一剂量依赖性的方式减少荧光酶活性。图3B显示敏诺西迪抑制在DHT存在下的ARA54C共 活化剂与AR的交互作用，因此以一剂量依赖性的方式减少荧光酶活性。
[0087] 实施例4.敏诺西迪抑制AR的NH2-端与COOH-端（N-C)交互作用
[0088] 对于由该AR的N-端FxxLF要素所媒介的整个与AR有关的功能，AR的NH2-端与 COOH-端（N-C)交互作用是重要的。敏诺西迪在AR的N-C交互作用上的活体外评估在前列 腺癌（PC-3)细胞中被进行。
[0089] PC-3细胞是如前面所述而被培养并且是使用Superfect套组而被转染以300ng 的PG5-LUC报导子基因质体、350ng的质体pCMX-GAL4-AR-C(a. a. 663~919)(被描述于 K. Nishimura et al. 2003 以及 S. Yeh et al. 1996 中）以及 350ng 的 VP16-AR-N(a. a 1 ~ 506)，并且被培养历时16h。
[0090] 该多个经转染的前列腺癌细胞在具有或没有10 3至10 6M的敏诺西迪下被处理以 乙醇以及InM DHT历时另一 16h。该N-C交互作用是使用哺乳动物二-杂和分析而被检测， 而焚光酶活性是使用MMTV-Luc报导子分析而被测量。
[0091] 图4显示呈一范围落在10至100 μΜ的浓度的敏诺西迪抑制在DHT存