miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的用图
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及肌肉疾病的治疗领域，具体涉及miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物 中的用途。
【背景技术】
[0002] 骨生物体的生命活动中离不开骨骼肌的运动和支持功能。不仅如此，我们身体所 摄取的糖和脂类等物质均在骨骼肌中代谢产生能量，这对维持整个身体的稳定状态起着非 常重要的作用。许多的疾病如肿瘤、HIV感染、慢性心衰等患者在晚期多伴随有骨骼肌减少 的症状。
[0003] 骨骼肌组织的一个显著特征是损伤后能够再生修复，这个过程是高度协调统一 的，骨骼肌干细胞(卫星细胞)在该过程中发挥了重要功能。骨骼肌干细胞位于肌纤维膜和 基底膜之间[1]，是骨骼肌干细胞最主要的类型。骨骼肌干细胞的数目在不同物种及不同发 育阶段是不同的：在新生小鼠中骨骼肌干细胞数目约为肌细胞的30%;成年后骨骼肌干细 胞的比例减少到约4%;年老小鼠骨骼肌干细胞的比例下降到2%左右。正常生理状态下骨 骼肌干细胞处于静息状态，一旦受到外界刺激如损伤或运动，处于静息状态的骨骼肌干细 胞被激活。激活的骨骼肌干细胞经过增殖、分化及融合形成新的骨骼肌纤维并执行正常的 生理功能。然而很多肌病的发生是因为骨骼肌干细胞自我更新受阻导致骨骼肌干细胞库的 耗竭或者骨骼肌干细胞的激活、增殖功能受到抑制。
[0004] microRNA(也写作miRNA或miR)作为一类具有调控活性的非编码小分子RNA(通常 18-25nt)，广泛参与各种组织器官的发育与疾病发生。miRNA参与骨骼肌发育的直接证据来 自于在骨骼肌组织条件性敲除Dicer基因后小鼠的骨骼肌发育发生异常，例如骨骼肌纤维 数目减少等。Di cer基因编码的蛋白是miRNA成熟加工过程中所必需的核酸内切酶，这表明 miRNA在骨骼肌发育过程中发挥重要作用。目前已经报道有许多miRNA参与骨骼肌损伤再生 的过程[2-5]。第一个报道在损伤修复过程中发生表达改变的是miR-181，在损伤再生的最 后阶段miR-181表达量显著上调[6]。11^1?-351在蛇毒心脏毒素(Cardiotoxin，CTX)诱导的骨 骼肌损伤再生的早期表达量瞬时增加，miR-351通过抑制细胞周期抑制因子E2F3促进骨骼 肌干细胞的增殖[7] miR-206在CTX损伤后，表达量显著上调，这提示miR-206在骨骼肌损伤 再生中发挥功能，这与miR-206基因敲除小鼠中骨骼肌损伤再生功能严重受损相一致[8]。 miR-206的表达量上调可以抑制许多基因的表达，其中包括Pax7、Notch3、IGFBP5[8RP HMGB3[9]，而所有这些基因都抑制分化过程。此外，在损伤过程中miR-1的表达量上调也有 助于抑制Pax7的表达[10]。同样地在CTX损伤后，miR-26a表达量上调。当在胫骨前肌中敲低 miR-26a后，骨骼肌损伤再生的进程减慢[11 ]。在相同的模型中，miR-125b在CTX损伤后表达 量上调，miR-125b下游的靶基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)表达增加[12LIGF-2可以调控 成肌分化过程并抑制后损伤再生进程[12]。此外，再生期间，miR-133表达量的增加以防止 骨骼肌干细胞变成棕色脂肪细胞[13 ]。
[0005]肌肉疾病(muscular disorders)通常是指骨豁肌疾病。肌营养不良是一组原发于 肌肉组织的遗传病。临床上表现为进行性加重的骨骼肌萎缩与无力、腱反射消失、肌肉假性 肥大。根据患者肌肉萎缩累及部位可分为多种类型:Duchenne/Becker型肌营养不良（DMD/ BMD)、面肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头肌型肌营养不良、远端型肌营养不 良、进行性眼外肌麻痹型肌营养不良、眼肌-咽肌型肌营养不良。DMD型肌营养不良是最常见 的一类进行性肌营养不良症。患病率为3.3/10万，占出生男婴的20-30/10万，为X-连锁隐性 遗传。主要是男孩发病，女性为致病基因的携带者。通常5岁左右发病。肌萎缩是进行性的肌 肉疾病，预后差，一般在20-30岁时伴随心肌功能衰竭或呼吸困难等致死。目前针对该病，医 学界尚无有效疗法。
[0006] Mdx小鼠是肌营养不良蛋白（dystrophin)缺陷鼠，是研究骨骼肌干细胞激活、增 殖、分化调控机制及骨骼肌损伤-再生机理的常用模型。目前改善mdx小鼠肌营养不良表型 的治疗方案有多种，但都存在缺陷。如移植自体骨骼肌干细胞到mdx小鼠中，但自体移植的 骨骼肌干细胞仍然不能表达肌营养不良蛋白。如果使用异体移植的骨骼肌干细胞来补偿 mdx小鼠缺失的dystrophin蛋白，就会存在如下的问题：1)宿主的免疫排斥反应;2)移植后 的骨骼肌干细胞后存活率、自我更新能力及迀移能力降低。
[0007] 因此，研究治疗肌肉疾病的分子基础及治疗方法是十分必要的。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miR-127在制备治疗肌肉疾病的药物中的 用途。
[0009] 基于上述目的本发明提供了如下1)至3)中任一物质在制备治疗肌肉疾病的药物 中的用途：
[0010] l)miR-127；
[0011] 2)含有miR-127的编码基因的重组载体；
[0012] 3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。
[0013] 优选地，所述miR-127的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0014] 可选地，所述肌肉疾病是肌肉损伤，优选是急性肌肉损伤。
[0015] 可选地，所述肌肉疾病是肌营养不良，任选是Duchenne/Becker型肌营养不良、面 肩-肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良、股四头肌型肌营养不良、远端型肌营养不良、进行 性眼外肌麻痹型肌营养不良或眼肌-咽肌型肌营养不良。
[0016] 可选地，所述药物通过促进成肌细胞的分化治疗所述肌肉疾病，所述促进成肌细 胞的分化优选是提高成肌素和/或肌球蛋白重链的表达。
[0017] 可选地，所述药物通过促进骨骼肌损伤再生治疗所述肌肉疾病，所述促进骨骼肌 损伤再生优选是促进骨骼肌干细胞的增殖和分化。
[0018] 可选地，所述药物通过改善病理和生理表型治疗所述肌肉疾病，所述改善病理和 生理表型优选是降低血清肌酸激酶水平、和/或改善肌肉疲劳、和/或提高肌纤维张力及爆 发力。
[0019] 基于相同的发明构思，本发明还提供了如下1)至3)中任一物质在促进骨骼肌干细 胞分化的药物中的用途：
[0020] l)miR-127；
[0021] 2)含有miR-127的编码基因的重组载体；
[0022] 3)含有miR-127的编码基因的重组病毒。
[0023]本发明还提供了一种重组细胞，其是将miR-127、含有miR-127的编码基因的重组 载体或含有miR-127的编码基因的重组病毒导入至出发细胞中得到的重组细胞。
[0024] 可选地，将所述的重组细胞用于制备治疗肌肉疾病的药物，或用于制备促进骨骼 肌干细胞分化的药物。
【附图说明】
[0025] 图l:miR-127在成年小鼠的不同组织中的表达丰度；
[0026] 图2:miR-127在C2C12细胞分化过程中的表达变化；
[0027]图3:miR-127在骨骼肌干细胞分化过程中的表达变化；
[0028] 图4:C2C12细胞分化24h后未转染miR-127的对照组(NC)与稳定转染miR-127的实 验组(OE)MyoG的细胞免疫荧光染色结果；
[0029] 图5:相对于对照组，实验组MyoG阳性细胞数目；
[0030] 图6: C2C12细胞分化24h后对照组与稳定转染miR-127实验组MyoG在转录水平的表 达量；
[0031] 图7:C2C12细胞分化24h后对照组与稳定转染miR-127实验组MyoG在蛋白水平的表 达量；
[0032] 图8: C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组表达MHC的细胞免疫 荧光染色结果；
[0033] 图9:相对于对照组，实验组MHC阳性细胞数目；
[0034] 图10 :C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组MHC在转录水平的表 达量；
[0035] 图11 :C2C12细胞分化36h后对照组与稳定转染miR-127实验组MHC在蛋白水平的表 达量；
[0036] 图12:CTX诱导8-10周小鼠肌肉损伤再生7.5天后胫骨前肌横切面染色结果；
[0037] 图13:肌肉损伤后7.5天胫骨前肌横切面上核在中央的肌纤维（中央核纤维)数目 比例统计；
[0038]图14:肌肉损伤后7.5天胚胎型MHC(myh3)的相对表达量；
[0039] 图15:在CTX损伤3.5天后MyoD、Pax7的双免疫荧光染色结果，DAPI染色定位细胞 核，图片显示为代表性视野；
[0040] 图16:相对于野生型小鼠（WT)，转基因小鼠（TG)中MyoD/Pax7双阳性细胞相对数 目；
[0041 ]图17:从miR-127转基因小鼠（TG)与野生型小鼠（WT)中分离骨骼肌干细胞后培养 分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果；
[0042]图18:从miR-127转基因小鼠（TG)与野生型小鼠（WT)中分离骨骼肌干细胞后培养 分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果；
[0043]图19:相对于野生型小鼠（WT)，从miR-127转基因小鼠（TG)中分离的骨骼肌干细胞 分化36h后MHC阳性细胞的相对数目；
[0044] 图20:野生型小鼠（FT)、miR-127转基因小鼠（TG)、mdx;miR-127(mdx;TG)小鼠和 mdx小鼠血清中肌酸激酶(CK)水平检测结果；
[0045] 图21:mdx;miR-127和mdx胫骨前肌伊文思蓝（EBD)浸润面积及层粘连蛋白 (Laminin)的免疫荧光染色；
[0046]图22:mdx;miR-127和mdx胫骨前肌胫骨前肌中伊文思蓝浸染的面积统计结果；
[0047] 图23: mdx; miR-127和mdx小鼠跑步时间记录结果；
[0048] 图24:m