dx;miR-127和mdx肌肉抽搐张力检测结果；
[0049] 图25:mdx;miR-127和mdx肌肉强直张力检测结果。
【具体实施方式】
[0050] 在以下实施例中，采用的肌肉损伤模型是以CTX肌肉注射胫骨前肌造成的急性肌 肉损伤模型。此模型较好地提供了肌肉损伤后骨骼肌干细胞发挥功能的进程。
[0051] 在以下实施例中，采用的肌营养不良模型是mdx小鼠模型，该小鼠模型以温和进行 性的方式模拟了人类肌肉疾病的发生，被广泛用做DMD肌营养不良疾病模型。
[0052] C2C12细胞为小鼠成肌细胞系。
[0053]实施例1 :miR-127在骨骼肌组织中高度富集并随着C2C12细胞及骨骼肌干细胞的 分化过程表达量增加。
[0054] 1.采用Northern印迹检测了miR-127在8周龄小鼠各个组织器官中的表达丰度。选 用8周龄的小鼠，分别收取肺、肝、心脏、脾、骨骼肌、肾、胰腺、小肠、脑、及胃组织。首先分别 提取RNA，然后进行Northern Blot杂交。具体步骤如下：
[0055] (I)RNA 提取
[0056]取新鲜或冰冻组织材料50-100mg，在研钵中加液氮研磨成粉末，将粉末用少量液 氮转移到15mL离心管中，加入5mL Trizol勾衆，室温静置5min;加 ImL氯仿(每毫升Trizo 1加 0.2mL氯仿)震荡混匀，室温静置10min;12000g，4°C离心15min。将上清液转移到新的离心管 加入2.51111^异丙醇（每毫升1'1^2〇1加0.51111异丙醇）混勾，室温静置1〇111；[11;1200(^，4 <€离心 IOmin;用5mL的75 %乙醇洗涤沉淀，室温干燥;视沉淀多少将其溶于适量DEPC水中，置于冰 上。
[0057] (2)RNA的甲醛变性凝胶电泳
[0058]①制备1.2%的甲醛变性胶:称取1.2g琼脂糖，加87mL DEPC H2O,加热融化;待冷 却到60°C时，加入IOmL的10 X MOPS缓冲液和37 %的甲醛3mL，混匀；加荧光染料EB至终浓度 0.5yg/mL，倒入准备好的琼脂糖凝胶槽中。
[0059]②RNA样品的准备（10-15yg):将2 · 5yL的 10 X MOPS缓冲液、4 · 4yL 37 % 甲醛、12 · 5μ L的甲酰胺混合；加入10-15yg的RNA，补加 DEPC H2O到25yL;在55°C水浴加热15min;加 5yL甲 酰胺的上样缓冲液，点样。
[0060] ③甲醛变性凝胶电泳:稀释10XM0PS缓冲液至I XM0PS，倒入清洁的电泳槽中；将 制备好的凝胶置于1XM0PS缓冲液的电泳槽中，预电泳以检测设备完好，点样;在2v/cm电压 降下电泳，至溴酚兰迀移到凝胶边缘停止;照相后转膜。
[0061] ⑶转膜
[0062]电泳结束后，将凝胶在去离子水中浸泡30min;将凝胶置于10 X SSC(或20 XSSC)浸 泡30min;将尼龙膜用水浸湿后，放入10 X SSC(或20 X SSC)中浸泡IOmin;将凝胶槽扣在托盘 中作为支架，放长条3MM滤纸桥，在支架上铺上两层与胶相同大小的3MM滤纸，把处理好的凝 胶倒扣在支架上，放上尼龙膜，再放两层3MM滤纸，放上一叠7-8cm厚的吸水纸;托盘中倒入 10 X SSC(或20 X SSC)，覆以保鲜膜，在吸水纸上面压上500g重物，过夜（>6h)。转膜结束后， 在暗室的紫外灯下观察核酸转移情况。对照凝胶用铅笔在尼龙膜上标记点样孔及分子量 Marker或28S rRNA、18S rRNA的位置。最后用两层3MM滤纸夹好尼龙膜，紫外交联固定膜上 的核酸，也可置80 °C烘箱热固定2h。固定好的膜可置于干燥处直至杂交。
[0063] (4)探针标记、纯化与变性
[0064] ①探针标记：用目的片段的PCR纯化产物或质粒酶切回收纯化产物作模板标记探 针，目前常用随机引物标记法，标记反应按说明书进行(Promega)。
[0065] ②探针纯化：纯化探针的目的是为了去除没有掺入的游离a-32p-dCTP，可通过 S印hadex G-50分子筛层析将没有掺入的游离a-32p-dCTP与标记的核酸片段分离，收集洗脱 液即含有标记好的核酸片段而游离的a- 32p-dCTP会滞留在层析介质中。目前有商品化的 S印hadex G-50分子筛层析柱，上样后离心即可收集到标记的核酸片段。
[0066] ③探针变性:纯化好的探针经100 °C煮沸5min变性，迅速置于冰上2min，离心少许。 储存于-20 °C备用。
[0067] (5)预杂交与杂交
[0068]①预杂交:将尼龙膜放入杂交管，加适量杂交液，68 °C (不加甲酰胺的杂交液)或42 °C (加50%甲酰胺的杂交液)预杂交半小时以上。
[0069] ②杂交：向杂交管中加入变性的探针，加入探针的量一般在每毫升杂交液2乂105-1 X 106cpm。68°C (不加甲酰胺的杂交液)或42°C (加50 %甲酰胺的杂交液)杂交8小时以上。
[0070] (6)洗膜
[0071] 杂交结束后洗膜，除去没有杂交的游离探针，即可压片自显影。
[0072] (7)压片自显影
[0073] 用保鲜膜将尼龙膜包好，固定在X-光暗盒中，覆以X-光片，将暗盒置于-70°C冰箱 放射自显影，一般自显影时间为3-5天，有时信号较弱可自显影一周以上。
[0074] (8)冲片
[0075]自显影结束后，在暗室中用显影液和定影液冲片，有杂交信号的泳道会在X-光片 相应位置出现一条黑色的带。
[0076]结果如图1所示，上排分别为miR-127在肺、肝、心脏、脾、骨骼肌、肾、胰腺、小肠、 脑、及胃组织中的表达丰度，下排为与之对应的tRNA凝胶电泳图。结果表明miR-127在骨骼 肌组织中高度富集。
[0077] 2.Real-time PCR检测miR-127在C2C12细胞及骨骼肌干细胞分化过程中的表达。
[0078] 提取增殖期(GM)和分化期(DM)不同时间（分化1、3、5天)细胞的总RNA，按以下步骤 操作：
[0079] (1)逆转录:在0.2mL的PCR反应管中加入下列试剂：
[0081 ] 16°C反应30min打开发卡结构，42°C反应30min，85°C灭活酶5min;
[0082] (2)ReaI-time PCR:在96孔板中加入下列试剂：
[0084] 图2为miR-127在C2C12细胞分化过程中的表达变化，图3为miR-127在骨骼肌干细 胞分化过程中的表达变化。如图2至图3所示，在本实施例中，miR-127的表达随C2C12细胞和 骨骼肌干细胞的增殖(GM)和分化(DM)I天、3天、5天逐渐增加，表明miR-127的表达随C2C12 细胞以及骨骼骨骼肌干细胞的分化增加。
[0085] 实施例2:miR-127促进C2C12细胞分化。
[0086]实施例1中miR-127的表达谱提示它可能在肌细胞分化中发挥重要功能。故首先构 建了 miR-127高表达的（12倍左右)的稳定转染细胞系，并利用该细胞系进行功能的检测。 [0087]以2X104/cm 2的密度种植稳定表达miR-127的C2C12细胞，培养24h后换分化培养 基，培养24h和36h后分别检测分化早期标记分子成肌素 (Myogenin ,MyoG)及晚期分化标记 分子肌球蛋白重链(MHC)的表达。通过细胞免疫荧光染色发现，分化24h后，过表达miR-127 显著增加了 MyoG阳性细胞的数量，同时MyoG的表达量在转录水平及蛋白水平显著增加;分 化36h后，过表达miR-127显著增加了MHC阳性细胞的数量，同时MHC的表达量在转录水平及 蛋白质水平显著增加。上述结果表明过表达miR-127促进C2C12细胞分化。具体步骤如下： [0088] (1)稳转细胞系的构建
[0089] 第一天：试验前将miR-127过表达的慢病毒（过表达miR-127，SEQ ID No.l， Genbank:AJ459738.1)以及带GFP标签的对照组慢病毒置于冰上解冻（病毒由汉恒生物提 供）；在35mm2的培养皿中加入ImL培养基，准备2个1.5mL的离心管；消化细胞计数，取ImL 2 X IO5个细胞于1.5mL的离心管;加20L病毒于离心管中，用枪头轻轻混匀；加3.2yL聚凝胺用 枪头轻轻混匀;将混合好的细胞滴加到在35_ 2的培养皿中，放入培养箱培养。
[0090] 第二天:将细胞转移到60mm2的培养皿中。
[0091]第三天:将细胞转移到IOcm2的培养皿中，加入终浓度为1.5yg/mL嘌呤霉素;两天 后转染慢病毒-GPF对照组的细胞几乎全部死掉，试验组的细胞保持良好的生长状态，表明 稳转细胞系构建成功。检测表达效率，传代保种。
[0092] (2)免疫荧光检测
[0093]①试剂配置
[0094] 固定液:？83稀释37%的甲醛溶液至终浓度2%-4%;
[0095] 透膜液：0 · 5 % TritonX-100/PBS;
[0096] 封闭液：1-3%BSA/PBS;
[0097] 封片剂：以预先配制的2%DABC0/PBS制备90%的甘油溶液。
[0098]②步骤:将转染或进行相应处理的细胞以PBS清洗3次，沥干水分；固定液室温固定 IOmin，PBS漂洗3次；室温下，用0.5%Triton-X100/PBS透化处理3 X IOmin;以 1-3 %BSA/PBS 封闭细胞，37°C30min;在Parafilm膜上加入40yL以PBS-T按一定比例稀释(通常1:50)的一 抗，密封于湿盒中，37 °C Ih。室温下，0 · 5 % Triton-X100/PBS漂洗3 X IOmin。在Paraf i Im膜上 加入40yL以PBS-T按一定比例稀释（通常1:80)的二抗，密封于湿盒中37°C，lh。室温下， 0 · 5 %Triton-X100/PBS漂洗3 X IOmin。第二次漂洗时加入1:10000DAPI (DAPI/0 · 5 % Triton);去离子水漂洗去盐。取IOyL封片剂滴在载玻片上。立刻用荧光