显微镜或激光共聚 焦显微镜观察并照相。
[0099] 结果：图4至图11结果显示miR-127可以促进C2C12细胞的分化。具体结果如下， [0100] 如图4所示：C2C12细胞分化24h后未转染miR-127的对照组(NC)与稳定转染miR-127 实验组 (OE)MyoG 的细胞免疫荧光染色结果。可见， OE 组 MyoG 阳性细胞明显多于 NC 组。 [0101] 如图5所示:稳定转染miR-127实验组中，MyoG阳性细胞数目显著高于对照组。
[0102] 如图6所示:C2C12细胞分化24h后，以GAPDH为内参基因，稳定转染miR-127实验组 的My oG在转录水平的表达量明显高于对照组。
[0103] 如图7所示:C2C12细胞分化24h后，以β-actin为内参蛋白，稳定转染miR-127实验 组My oG在蛋白水平表达量明显高于对照组。
[0104] 如图8所示:C2C12细胞分化36h后，对照组与稳定转染miR-127实验组表达MHC的细 胞免疫荧光染色结果。可见稳定转染miR-127实验组，MHC阳性细胞明显多于对照组。
[0105] 如图9所示:稳定转染miR-127实验组中，MHC阳性细胞数目显著高于对照组。
[0106] 如图10所示:C2C12细胞分化36h后，以GAPDH为内参基因，实验组MHC在转录水平的 表达量明显高于对照组。
[0107] 如图11所示:C2C12细胞分化36h后，以β-actin为内参蛋白，实验组MHC在蛋白水平 的表达量明显高于对照组。
[0108] 实施例3:miR-127促进骨骼肌损伤再生的进程。
[0109] (1)骨骼肌组织损伤再生模型的建立
[0110] miR-127转基因小鼠由南京模式动物所构建。为确定miR-127在骨骼损伤再生中的 功能，首先构建了miR-127小鼠 CTX损伤再生模型;小鼠右腿胫骨前肌注射50yLX10yM CTX， 左腿注射相同量的PBS做对照。
[0111] 骨骼肌损伤后首先是炎症反应，大量的炎症因子被释放，处于静息状态的骨骼肌 干细胞被激活，激活的骨骼肌干细胞大量增殖然后进入分化程序与损伤的肌纤维融合。该 模型利用MyoD阳性细胞数目来评估激活的骨骼肌干细胞数目；骨骼肌组织损伤3天后骨骼 肌干细胞大量增殖，可以通过检测My 〇D/Pax7双阳性的骨骼肌干细胞的数目来评估骨骼肌 干细胞增殖的进程;损伤7.5天后形成大量核在中央的新形成的肌纤维（中央核纤维），通过 比较核在中央的新形成的肌纤维横的截面积大小及胚胎期MHC(eMHC)的动态变化来评估分 化的进程。因此，可在损伤后1、3、5、7天分别收取骨骼肌组织，通过册染色观察肌肉再生的 进程和形态。
[0112] (2)冰冻切片制备
[0113] 将取下的新鲜胫骨前肌肌肉组织放入盛有包埋剂(樱花，4583)的模具中，将模具 浸入液氮使其凝固，用全自动切片机(Leica CM3050)将包埋块切片至10微米厚并贴至载玻 片上，放入-70 °C冰箱中保存。
[0114] (3)Pax7免疫荧光染色
[0115] 将冰冻切片从-70 °C冰箱中拿出室温平衡Ih;于4 %多聚甲醛中固定20min; I3BS中 清洗3次，每次5min;在-20°C甲醇中渗透6min;PBS中清洗3次，每次5min;配置0.0IM柠檬酸 钠缓冲液，预热至90°C;将切片浸入其中，80°C孵育5min;重复该步骤一次后，室温冷却切 片，PBS清洗3次，每次5min;在4 % BSA中室温封闭2-3h; PBS中清洗2min;稀释FAB (Jackson) 1:100至PBS中，在FAB中室温封闭30min;PBS中清洗2min;与Pax7抗体(DSHB，1:20溶于4% BSA中）于4°C孵育过夜；PBS中清洗2min;在0.1 %BSA中洗3次，每次IOmin;于GaM-Biotin (Jackson，1:1000溶于4%BSA中）室温孵育45min;PBS中清洗2min;在0.1 %BSA中洗3次，每 次 IOmin;于 Cy3_Strep(Jackson，1:1000 溶于 4%BSA 中）室温孵育 30min;PBS 中清洗 3 次，每 次I Om i η; DAP I染核，PB S中清洗I Om i η;封片照相。
[0116] (4)My〇D免疫荧光染色
[0117] 将冰冻切片从-70 °C冰箱中拿出放置室温晾干;于4 %多聚甲醛中固定20min; I3BS 中清洗3次，每次5min;在-20 °C甲醇中渗透6min; PBS中清洗3次，每次5min; 5 %BSA室温封闭 2h;与MyoD抗体（Santa Cruz，1:50溶于5 % BSA中）于4°C孵育过夜；PBS中清洗3次，每次 I Omin;二抗，室温孵育I h; PBS中清洗3次，每次I Omin; DAP I染核，PBS中清洗I Omin;封片照 相。
[0118] 结果:miR-127促进骨骼肌损伤再生的进程，具体结果如下，
[0119] 如图12所示:CTX诱导8-10周野生型(WT)和miR-127转基因小鼠（TG)胫骨前肌(TA 肌)损伤再生7.5天后Laminin免疫荧光染色结果。
[0120] 如图13所示:TA损伤7.5天后，胫骨前肌横切面上新生肌纤维(具有中央核的肌纤 维，即中央核纤维)面积比例统计。结果显示，miR-127转基因小鼠（TG)的新生肌纤维面积显 著大于野生型小鼠(WT)。
[0121 ] 如图14所示:TA损伤5.5天后，miR-127转基因小鼠（TG)的胚胎型MHC(myh3)的相对 表达量显著高于野生型小鼠(WT)。该结果表明，miR-127促进骨骼肌的损伤修复进程。
[0122] 如图15所示:miR-127转基因小鼠（TG)及野生型小鼠（WT)在CTX损伤3.5天后MyoD、 Pax7的双免疫荧光染色结果，DAPI染色定位细胞核。
[0123] 如图16所示:基于图15的染色结果，转基因小鼠（TG)中MyoD/Pax7双阳性细胞相对 数目显著高于野生型小鼠(WT)。
[0124] 结论：图12至14显示miR-127转基因小鼠的新生肌纤维面积显著大于野生型小鼠， miR-127转基因小鼠的胚胎型MHC(myh3)的相对表达量显著高于野生型小鼠，这说明miR-127具有促进骨骼肌损伤再生修复的功能；图15-16显示转基因小鼠中MyoD/Pax7双阳性细 胞相对数目显著高于野生型小鼠，这说明miR-127具有促进骨骼肌干细胞增殖的功能。
[0125] 实施例4:miR-127促进骨骼肌卫星分化。
[0126] 为了确认miR-127促进骨骼肌干细胞的分化的功能，分离miR-127转基因小鼠及野 生型小鼠的骨骼肌干细胞，以相同的密度种植在12孔板中，在分化36h后，通过染色分化标 记基因 MCH阳性细胞及检测MHC mRNA的表达量同时还分离了单根肌纤维的离体培养，用 Pax7、MyoD分别染色不同类型的骨骼肌干细胞。
[0127] 结果：
[0128] 如图17所示：从miR-127转基因小鼠（TG)与野生型小鼠（WT)中分离骨骼肌干细胞 后培养分化36h后MHC的细胞免疫荧光染色结果。
[0129] 如图18所示:基于图17的染色结果，由miR-127转基因小鼠（TG)中分离得到的骨骼 肌干细胞分化36h后MHC阳性细胞的相对数目显著高于野生型小鼠(WT)。
[0130] 如图19所示：由miR-127转基因小鼠（TG)中分离的得到骨骼肌干细胞分化36h后 MHC的转录水平表达显著高于野生型小鼠(WT)。
[0131] 结论：图17-19所示，由miR-127转基因小鼠中分离得到的骨骼肌干细胞分化36h后 MHC阳性细胞的相对数目显著高于野生型小鼠；由miR-127转基因小鼠中分离得到的骨骼肌 干细胞分化36h后骨骼肌分化标志基因 MHC的转录水平表达显著高于野生型小鼠。这说明， miR-127可以促进骨骼肌干细胞的分化。
[0132] 实施例5:miR-127可以显著改善mdx小鼠的病理生理表型。
[0133] miR-127可以通过促进骨骼肌干细胞的分化加速骨骼肌损伤再生过程，为进一步 证实miR-127是否可以在一定程度上缓解mdx疾病模型小鼠的病理表型，首先将mdx小鼠与 miR-127转基因小鼠进行交配，得到的雄性mdx; miR-127 (即mdx; TG)与mdx小鼠用于实验，B6 小鼠正常对照小鼠。通过检测肌细胞中肌酸激酶外泄到血清中的浓度及伊文思蓝透过破损 的肌纤维膜渗入骨骼肌细胞中的情况来判断mdx小鼠肌肉组织的损伤程度。同时，通过小鼠 的跑步测试及离体的骨骼肌纤维拉力的测试来评估mdx小鼠骨骼肌功能。
[0134] (1)血清中CK水平的检测
[0135] 小鼠跑步后2-4h眼球采血。将血样4°C静置l_2h，12,000rpm离心10min将血清转移 至噺的EP管中，取上清检测CK值。
[0136] 配置反应液:每孔加 IOyL底物，IOOyL的反应缓冲液及IyL的酶；
[0137] 在酶标版中加 IlOyL: IOOyL H2O和IOyL标准品（Calibrator)及IOOyL反应液和10μ L血37°C孵育20min利用酶标仪读取340nm的吸光值，然后继续孵育20min读取340nm的吸光 值，然后利用一下的公式计算CK值。
[0138]
[0139] (2)小鼠跑步实验
[0140] mdx;miR-127,mdx和B6小鼠在完全相同的饲养条件下，跑步测试实验在平板跑步 机上进行(Exer3/6Columbus Instruments)。实验分为训练和正式测试，实验期间使用20度 下坡倾斜角。在正式测试前训练两次，隔天进行。跑步条件设置如下：起始速度10米/min， 3min后，以1米/min的速度加速到20米/min，然后以20米/min速度一直跑到小鼠疲劳为止， 一般设置NOS(小鼠停在刺激器上的次数)为100。在训练之后，开始正式测试，总共测试4次， 每次都是隔天进行。
[0141] (3)骨骼肌离体拉力试验
[0142] 配置电解液调节到PH