专利名称：高分子聚合物三维氨基基片及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高分子聚合物三维氨基基片及其制备方法与应用。
背景技术：
生物芯片技术作为一种高效、大规模获取相关信息的重要手段，是生物技术、 医学技术、微加工技术、微电子技术、材料技术的综合，而材料技术的应用集中体 现在生物芯片片基(载体)上，也即基片的制备。基片是芯片的基础，基片的制备 尤为重要。
目前点制芯片常用的硅垸化氨基基片，在点制高密度芯片存在稳定性问题，在 点样环境下长时间点样出现点样刚开始时点直径正常、往后绝大部分点直径越来越 小的现象，也即星星点现象，导致芯片杂交后刚开始点样的区域信号正常、往后绝 大部分点基本没有信号，而且点样时间越长，这种问题越严重。因此，需要一种稳 定性更高的基片。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种生物芯片的基片及其制备方法。 本发明所提供的制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在玻片片基表面连
接富含氨基的聚合物，得到表面连接上富含氨基的聚合物的基片。
上述过程中，所述连接的方法可包括如下步骤将所述玻片片基置于所述富含
氨基的聚合物的溶液中，吸附，得到所述基片。将此技术方案记作方法I。 上述方法I中，所述吸附的温度可为10-50°C。 上述任一所述方法I中，所述吸附的时间可为0. 5-30小时。
上述任一所述方法I中，在置于富含氨基的聚合物溶液中之前，先将玻片片基
清洗和表面亲水改性，这样片基可以直接用于连接富含氨基的聚合物；如果最终的 基片要求具有一定疏水性，则将玻片进行烘烤以达到所需的疏水要求，然后再置于
富含氨基的聚合物溶液中，烘烤的温度、时间随疏水要求变化而变化。
上述制备方法中，所述连接的方法还可为包括如下步骤的方法将所述玻片片 基环氧基化，得到环氧基化的玻片片基；将所述环氧基化的玻片片基置于所述富含 氨基的聚合物的溶液中，接枝反应，得到所述基片。将此技术方案记作方法II。上述方法II中，所述将玻片片基环氧基化的方法可为包括如下步骤的方法将 所述玻片片基置于环氧基硅烷化试剂的溶液中，进行环氧基化反应，得到所述环氧 基化的玻片片基。
上述任一所述方法II中，所述环氧基硅烷化试剂的溶液的溶剂可为异丙醇、乙 醇、甲苯或水。
上述任一所述方法II中，所述环氧基化反应的温度可为15-70°C。所述环氧基
化反应的时间可为0. 5-30小时。
上述任一所述方法n中，所述环氧基硅垸化试剂的溶液中环氧基硅垸化试剂的
浓度可为0. 01%-10% (体积百分含量)。
上述任一所述方法II中，所述环氧基硅烷化试剂可为
(3-Glycidyloxyp:ropyl)trimethoxysilane (简禾尔GPTMS)、
(3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane (简称GPDMES)或
(3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane (简称GPD顧S)。
上述方法II中，所述将玻片片基环氧基化的方法还可为包括如下步骤的方法 将环氧基聚硅氧烷涂敷在所述玻片片基的表面，得到环氧基化玻片片基。
上述涂敷过程中，所述环氧基聚硅氧烷可为 Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 或 Poly(dimethylsiloxane)，diglycidyl ether terminated。
上述涂敷过程中，所述环氧基聚硅氧垸具体可以是先被制成环氧基聚硅氧烷的 二氯甲烷溶液，然后再进行涂敷；所述环氧基聚硅氧烷的二氯甲垸溶液中环氧基聚 硅氧垸的浓度可为0. 005~5% (体积百分含量)，具体可为1% (体积百分含量)。
上述任一所述方法II中，所述接枝反应的温度可为10-50°C。
上述任一所述方法II中，所述接枝反应的时间可为0. 5-30小时；
上述任一所述方法i和方法n中，所述富含氨基的聚合物的溶液中富含氨基的
聚合物的浓度可为0. 001%-0. 3% (质量百分含量)。
上述任一所述方法I和方法II中，所述富含氨基的聚合物的溶液为水相。 上述任一所述方法中，所述富含氨基的聚合物包括但不限于壳聚糖 (chitosan)、多聚赖氨酸(polylysine)、聚亚乙基亚胺(polyethyleneimine)、
聚烯丙基胺(polyallylamine)。
上述任一所述方法中，所述富含氨基的聚合物的分子量为0. 1万-50万Da。其中，所述壳聚糖的分子量可为5-19万、19-31万、31-37. 5万；所述多聚赖 氨酸的分子量可为O. 1-0.4万、0.4-1.5万、1.5-3万、3万-7万、7-15万、15-30 万；所述聚亚乙基亚胺的分子量可为O. 13万、0.2万、2.5万；所述聚烯丙基胺的 分子量可为1.5万、1.7万、6.5万、7万。
上述任一所述方法中，当所述富含氨基的聚合物为壳聚糖时，所述壳聚糖的溶 液具体可以是按照包括如下步骤的方法制得的先用醋酸溶解壳聚糖，得到溶液I ，
再用O. 1XPBS缓冲液稀释所述溶液I ，得到壳聚糖的溶液；所述壳聚糖的溶液的 pH值为5.0-6.0。
由上述任一所述方法制备得到的生物芯片基片也属于本发明的保护范围。 由上述任一所述基片制得的生物芯片也属于本发明的保护范围。 本发明的基片是一种高分子聚合物三维氨基基片，具体的说是一种富含氨基的 高分子聚合物三维氨基基片。该基片是在玻璃片基上先进行预处理然后通过静电吸 附直接涂敷上富含氨基的聚合物高分子从而形成高分子三维氨基分布的基片，也可 以选择不同的方法先进行表面环氧基修饰，然后通过环氧基活性基团接枝上富含氨 基的聚合物高分子，最终使片基表面为高分子三维氨基分布的基片。这里，可以分 别采用chitosan (即脱乙酰基化的甲壳素)、polylysine、 polyethyleneimine、 polyallylamine，本专利分别将这种高分子聚合物三维氨基基片称为甲壳素基片、 PLL基片、PEI基片、PAA基片。这类基片上的富含氨基的聚合物高分子其较长的亲 水连接臂有足够柔韧度，能够使通过共价或高亲和力的方式固定于基片表面的样品 分子同目标分子充分接触而结合，因此，该基片能较快的实现分子之间的结合而平 衡，从而提高点样环境下基片的稳定性。其中像chitosan和polylysine等聚合物 具有天然无毒、良好的生物亲和性和生理活性等特性。实验证明，本发明的基片生 物分子固定灵敏度大大提高、样品点饱满、基片表面性质更稳定、确保长时间样品 点制过程中样品点的形状始终保持均一、非特异性吸附和自发荧光背景均非常低。 本发明基片适合长时间点样的高密度芯片的点制，解决了普通氨基基片存在的长时 间点制的高密度芯片中遇到的大部分样品固定不上的问题。本发明基片是一种性能 优良的生物芯片基底材料，可广泛应用于各种生物芯片的制备上。
图l是高分子聚合物三维氨基基片表面分子的结构示意图2是普通氨基基片点制高密度Oligo的芯片(31K)点制效果6图3是高分子聚合物三维氨基基片点制高密度OligO的芯片(31K)点制效果图4是高分子聚合物三维氨基基片点制高密度Oligo的芯片(31K)杂交效果图； 图5是高分子聚合物三维氨基基片点制高密度Oligo的芯片(22K)点制效果图； 图6是高分子聚合物三维氨基基片点制高密度miRNA芯片的杂交效果图。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
壳聚糖(chitosan)、多聚赖氨酸(polylysine)、聚亚乙基亚胺 (polyethyleneimine)、聚烯丙基胺(polyallylamine)均购自Sigma。
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane)(简称GPTMS)购自Sigma; (3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane)(简称GPDMES)购自Sigma; (3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane)(简称GP醒S)购自Sigma;
Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-印oxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 购自Sigraa。
下述实施例中的壳聚糖均为先用1% (体积百分比)醋酸溶解，然后根据所需浓 度要求配制成O. 1XPBS的相应浓度的壳聚糖稀溶液，且pH值调为5.(T6.0。
实施例1、通过在玻片片基上吸附壳聚糖，制备甲壳素基片
1、 玻璃片基的预处理
将玻片片基在Piranha溶液(浓H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡过夜，然后用 去离子水清洗、干净；在120度的真空烘箱中真空烘烤lh;
2、 吸附壳聚糖高分子
所用的壳聚糖的分子量为31万-37.5万Da (高分子量)；
壳聚糖反应液为终浓度为O. 1% (质量百分含量)的壳聚糖的O. IX PBS缓冲
液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应液的pH值调至为
6.0。
将步骤l得到的干净疏水玻片片基浸入壳聚糖反应液中，在3(TC、以120 rpm 的速度摇动的条件下浸泡30小时；停止浸泡，将玻片用去离子水洗涤、甩干，得 到甲壳素基片。
玻片片基通过表面清洗和表面改性，与富含氨基的聚合物高分子壳聚糖上的部 分氨基发生静电吸附作用从而使玻片片基表面吸附上壳聚糖高分子，这样，每个壳聚糖分子上还剩下多数氨基，从而使二维玻片表面形成三维的氨基，该三维氨基基 片即为甲壳素基片。
实施例2、通过在玻片片基上吸附壳聚糖，制备甲壳素基片
1、 玻璃片基的预处理 同实施例1中的实验1;
2、 吸附壳聚糖高分子
所用的壳聚糖的分子量为5万-19万Da (高分子量)；
壳聚糖反应液为终浓度为0.3% (质量百分含量)的壳聚糖的O. IX PBS缓冲 液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应液的pH值调至为 5. 0。
将步骤l得到的干净疏水玻片片基浸入壳聚糖反应液中，在10'C、以120 rpm 的速度摇动的条件下浸泡0.5小时；停止浸泡，将玻片用去离子水洗涤、甩干，得 到甲壳素基片。
实施例3、通过在玻片片基上吸附壳聚糖，制备甲壳素基片
1、 玻璃片基的预处理 同实施例l中的实验l;
2、 吸附壳聚糖高分子
所用的壳聚糖的分子量为19万-31万Da (高分子量)；
壳聚糖反应液为终浓度为0.001% (质量百分含量)的壳聚糖的O. IX PBS缓 冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应液的pH值调至 为6.0。
将步骤l得到的干净疏水玻片片基浸入壳聚糖反应液中，在5(TC 、以120rpm 的速度摇动的条件下浸泡15小时；停止浸泡，将玻片用去离子水洗涤、甩干，得 到甲壳素基片。
实施例4、在玻璃片基上吸附聚烯丙基胺(polyallylamine)或聚亚乙基亚胺 (polyethyleneimine)，制备PAA基片、PEI基片 1、玻璃片基的预处理同实施例1中的实验l; 2、吸附聚烯丙基胺高分子 所用的聚烯丙基胺的分子量为6. 5万；
聚烯丙基胺反应液为终浓度为0.03% (质量百分含量)的聚烯丙基胺的水溶 液，所述终浓度为聚烯丙基胺在聚烯丙基胺反应液中的浓度。
将步骤1得到的干净疏水玻片片基浸入聚烯丙基胺反应液中，在25°C 、以120 rpm的速度摇动的条件下浸泡15小时；停止浸泡，将玻片用去离子水洗涤、甩干， 得到PAA基片。
在上述方法中，将聚烯丙基胺替换为聚亚乙基亚胺(分子量为2.5万)，得到 PEI基片。
实施例5、用化学方法制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备PLL基片
1、 片基的环氧基化
1) 片基的预处理目的是使玻片表面裸露出活性的羟基； 将玻片片基在Piranha溶液(浓H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡过夜，然后用
去离子水清洗、甩干；或将玻片片基用去离子水清洗、甩干后进行通氧条件下Plasma 处理2min;
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片片基置于含有GPTMS的乙醇溶液中， GPTMS在乙醇溶液中的浓度为1% (体积百分含量)，在5(TC、 120rpm摇动条件下 反应15小时；用乙醇清洗、甩干；
2、 接枝多聚赖氨酸(Polylysine)高分子 所用的多聚赖氨酸的分子量为7万-15万Da
多聚赖氨酸反应液:为终浓度为0. 08%(质量百分含量)的多聚赖氨酸的0. IX PBS 缓冲液，所述终浓度为多聚赖氨酸在多聚赖氨酸反应液中的浓度。
将步骤1得到的环氧基化的玻片片基浸入多聚赖氨酸反应液中，在5(TC、以120 rpm的速度摇动的条件下反应30小时；停止反应，将玻片用去离子水洗涤、甩干；
3、 封闭未连接多聚赖氨酸的环氧基团
封闭方法以含0.01% (体积百分比)二乙胺的O. 1XPBS缓冲液作为封闭液， 室温封闭l小时；洗涤干燥，得到PLL基片。
玻片通过表面清洗和表面改性露出硅羟基，硅羟基与GPTMS反应使玻片表面为环氧基团分布，然后每个多聚赖氨酸分子上的一个氨基或多个氨基与玻片表面上的 环氧基团反应形成共价键，每个多聚赖氨酸分子上剩下的氨基使玻片表面形成三维 的氨基，该三维氨基基片即为PLL基片。
实施例6、用化学方法制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备甲壳素基片
1、 片基的环氧基化
同实施例5中的实验1;
2、 接枝壳聚糖(chitosan)高分子 所用的壳聚糖的分子量为5万-19万Da (中分子量)；
壳聚糖反应液为终浓度为0.3% (质量百分含量)的壳聚糖的O. IX PBS缓冲 液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应液的pH值调至为 5. 5。
将步骤l得到的环氧基化的玻片片基浸入壳聚糖反应液中，在1(TC、以120rpm 的速度摇动的条件下反应0.5小时；停止反应，将玻片用去离子水洗涤、甩干；
3、 封闭未连接壳聚糖的环氧基团
封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到甲壳素基片。
实施例7、用化学方法制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备PEI基片
1、 片基的环氧基化
1) 片基的预处理-
将玻片片基在Piranha溶液(浓H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡过夜，然后用 去离子水清洗、甩干；或将玻片用去离子水清洗、甩干后进行通氧条件下Plasma 处理2min;
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片片基置于含有GPD醒S的异丙醇溶液 中，GPD醒S在异丙醇溶液中的浓度为O.OP/。(体积百分含量)，在70。C、 150 rpm 摇动条件下反应0.5小时；用异丙醇清洗、甩干；
2、 接枝聚亚乙基亚胺(polyethyleneimine)高分子 所用的聚亚乙基亚胺的分子量为25,000 Da (低分子量)
聚亚乙基亚胺反应液为终浓度为0.001% (质量百分含量)的聚亚乙基亚胺的 水溶液，所述终浓度为聚亚乙基亚胺在聚亚乙基亚胺反应液中的浓度。
10将步骤l得到的环氧基化的玻片片基浸入聚亚乙基亚胺反应液中，在25。C、以
150rpra的速度摇动的条件下反应15小时；停止反应，将玻片用去离子水洗漆、甩 干；
3、封闭未连接聚亚乙基亚胺的环氧基团 封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到PEI基片。
实施例8、用化学方法制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备PAA基片
1、 片基的环氧基化
1) 片基的预处理
将玻片在Piranha溶液(浓H2S 04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡过夜，然后用去离 子水清洗、甩干；或将玻片用去离子水清洗、甩干后进行通氧条件下Plasma处理 2min;
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片片基置于含有GPDMES的甲苯溶液中， GPDMES在甲苯溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15i:、 150rpm摇动条件 下反应30小时；用甲苯清洗、甩干；
2、 接枝polyallylamine高分子
所用的polyallylamine的分子量为65, 000 Da (低分子量)
polyallylamine反应液为终浓度为0. 05%(质量百分含量)的polyallylamine
的水溶液，所述终浓度为polyallylamine在polyallylamine反应液中的浓度。 将步骤l得到的环氧基化的玻片浸入polyallylamine反应液中，在10°C、以
150rpm的速度摇动的条件下反应30小时；停止反应，将玻片用去离子水洗涤、甩
干；
3、 封闭未连接polyallylamine的环氧基团 封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到PAA基片。
实施例9、用化学方法(水相中)制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备 甲壳素基片
1、片基的环氧基化
1) 片基的预处理同实施例5中的实验1中的1);
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS在水溶液中的浓度为0.5% (体积百分含量)，在50。C、 120 rpm摇动条件下反应 20小时；用去离子水清洗、甩干；
2、 接枝壳聚糖(chitosan)高分子 所用的壳聚糖的分子量为5万-19万Da (中分子量)；
壳聚糖反应液为终浓度为0.05% (质量百分含量)的壳聚糖的0. IX PBS缓冲 液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应液的pH值调至为 6.0。
将步骤l得到的环氧基化的玻片浸入壳聚糖反应液中，在25'C、以120rpm的 速度摇动的条件下反应3小时；停止反应，将玻片用去离子水洗涤、甩干；
3、 封闭未连接壳聚糖的环氧基团
封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到甲壳素基片。
实施例10、用化学方法(水相中)制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备 甲壳素基片
1、 片基的环氧基化
1) 片基的预处理同实施例5中的实验1中的l);
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS 在水溶液中的浓度为10% (体积百分含量)，在15'C、 120 rpm摇动条件下反应30 小时；用去离子水清洗、甩干；
2、 接枝壳聚糖(chitosan)高分子 同实施例9中的实验2;
3、 封闭未连接壳聚糖的环氧基团
封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到甲壳素基片。
实施例11、用化学方法(水相中)制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备 甲壳素基片
1、片基的环氧基化
1) 片基的预处理同实施例5中的实验1中的1);
2) 环氧基化将步骤l)预处理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS 在水溶液中的浓度为0.01% (体积百分含量)，在70"C、 120 rpm摇动条件下反应0.5小时；用去离子水清洗、甩干；
2、 接枝壳聚糖(chitosan)高分子
同实施例9中的实验2;
3、 封闭未连接壳聚糖的环氧基团
封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到甲壳素基片。
实施例12、用物理方法制备环氧基化的玻璃片基，再用此片基制备甲壳素基片
1、 片基的环氧基化
1) 片基的预处理将玻片片基在Piranha溶液(浓H2S04/30%H202， V/V二7:3)中 浸泡过夜，然后用去离子水清洗、甩干；
2) 环氧基化用终浓度为1% (体积百分含量)的
Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 的二氯甲烷溶液，通过提拉法在步骤l)预处理后的玻片片基表面物理吸附一层环 氧基团；所述终浓度为Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane]在二氯甲烷溶液中的浓度；用去离子水清洗、甩干；
2、 接枝壳聚糖(chitosan)高分子 所用的壳聚糖的分子量为19万-31万Da (中分子量)；
壳聚糖反应液壳聚糖反应液为终浓度为0.06% (质量百分含量)的壳聚糖 的O. 1XPBS缓冲液，所述终浓度为壳聚糖在壳聚糖反应液中的浓度；壳聚糖反应 液的pH值调至为6.0。
将步骤l得到的环氧基化的玻片浸入壳聚糖反应液中，在3(TC、以120rpm的 速度摇动的条件下反应5小时；停止反应，将玻片用去离子水洗涤、甩干；
3、 封闭未连接壳聚糖的环氧基团
封闭方法同实施例5中的实验3;洗涤干燥，得到甲壳素基片。
由实施例1-12制得的高分子聚合物三维氨基基片的表面分子结构示意图如图 l所示，基片每个点上去是一条含有几个、几十个或更多氨基的长链聚合物，所以 整个基片表面形成一种高分子聚合物三维氨基分布。
实施例13、高分子聚合物三维氨基基片以及普通氨基基片应用于高密度的核酸芯片的制备
本实施例所用的普通氨基基片为目前常用的玻片氨基硅烷化方法制得，即玻片 先进行氨基硅垸化后烘烤交联，即得普通氨基基片。
本实施例所用的高分子聚合物三维氨基基片是分别由实施例1-12中方法得到的。
1. 将31K种46-55mer的01igo样品(购自德国operon公司，产品编号 Cat#852102，商品名Homo sapiens (human) Promoter CoRe)进行点样，每种样 品取出10ul转移加入384孔板中；
2. 通过自动点样装置将准备好的点样样品点到高分子聚合物三维氨基基片以 及普通氨基基片表面。每张芯片包括48个点阵，每个点阵包含702个点，点间距 是160uM，普通氨基基片、实施例1制得的甲壳素基片以及实施5制得的PLL基片 的点制效果分别如图2、图3(a)、图3(b)所示；实施例2-4、 6-12制得的高分子聚 合物三维氨基基片具有相似效果。
3. 将点样后芯片于125-400 mj紫外交联进行固定，随后清洗、甩干；
4. 样品制备、扩增、标记；
5. 向每个芯片点阵上加入带有标记样品的杂交液，在100%湿度下，于42。C下 杂交12-16小时；杂交液0. 1%SDS、 3XSSC、 25%甲酰胺、5XDenhardt， s。
6. 反应后芯片分别用两种洗液清洗，离心甩干；两种特定洗液I和II的组成分 别为洗液I: 0. 3XSSC/0. 1%SDS;洗液II: 0. 06XSSC。
7. 芯片扫描和数据处理。实施例l制得的甲壳素基片以及实施5制得的PLL 基片检测扫描结果如图4(a)、图4(b)所示。实施例2-4、 6-12制得的高分子聚合 物三维氨基基片具有相似效果。
在本实验中，用本发明高分子聚合物氨基基片和普通氨基基片分别制作芯片 时，所用的探针与反应液都完全相同，相应的反应条件等也都相同。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奥生物有限公司)扫描点样后的芯片，扫描参数 均设定Laser/PMT=90/900。扫描结果表明，在点制高密度Oligo芯片过程中，对于 普通氨基基片，刚开始点样时，普通氨基基片的点直径在100土3um，然后每个点阵 点直径开始变小，趋势非常明显，变小的点直径在20-50mn之间；对于本发明的高 分子聚合物三维氨基基片，在整个长时间点样过程中(点样环境湿度大)，点直径 几乎没有变化，说明基片表面性质更稳定，如甲壳素基片一直在135士3咖，PLL基片一直在145±3um。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奥生物有限公司)扫描杂交后的芯片，扫描参数 均设定Cy3通道Laser/PMT=85/850， Cy5通道Laser/PMT=93/940。扫描结果表明， 本发明的高分子聚合物三维氨基基片的样品分子固定灵敏度高，样品点饱满，且所 有点的直径大小几乎相等，如甲壳素基片均为135士3um， PLL基片均为145士3um， 且界限非常明显，易于提取数据和数据分析。普通氨基基片由于从点制效果可以判 断杂交效果很差，且即便杂交有信号但大部分点因为点直径太小(20-50uin)难于 提取数据，所有没有进行杂交实验。
实施例14、高分子聚合物三维氨基基片应用于高密度的核酸芯片的制备 本实施例所用的高分子聚合物三维氨基基片是分别由实施例1-12中方法得到的。
1. 将22K种70mer的01igo样品(购自德国operon公司，产品编号GS-500-16， 商品名Homo sapiens (human) AROS V2.1)进行点样，每种样品取出lOul转移加 入384孔板中；
2. 通过自动点样装置将准备好的点样样品点到高分子聚合物三维氨基基片表 面。每张芯片包括48个点阵，每个点阵包含482个点，点间距是185uM，实施8 制得的PAA基片以及实施例7制得的PEI基片的点制效果分别如图5 (a)、图5 (b) 所示；实施例1-6和9-12制得的高分子聚合物三维氨基基片具有相似效果。考虑 到实施例13中的普通氨基基片点制高密度Oligo芯片效果很差，所以本实施例中 点制高密度Oligo芯片没有加入普通氨基基片。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奥生物有限公司)扫描点样后的芯片，扫描参数 均设定Laser/PMT^90/900。扫描结果表明，在点制高密度Oligo芯片过程中，对于 本发明的高分子聚合物三维氨基基片，在整个长时间点样过程中(点样环境湿度 大)，PEI基片和PAA基片点直径几乎没有变化，PAA基片点直径为130土3uM， PEI 基片点直径为160土3uM，都没有随点样先后顺序，样点点直径变小趋势，说明基片 稳定性高。
实施例15、将高分子聚合物三维氨基基片应用于哺乳动物miRNA芯片的制备 生物芯片的制备过程如下
151. 哺乳动物microRNA芯片V3. 0，针对人677 (包含jVa"re杂志预测的有122 个，#3fwre 2005， 434， 338-345.)、大鼠292、小鼠461个成熟microRNA，(由 于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集)， 一共设计了 924条探针(数据来自Sanger miRNA数据库miRBaselO. 0)。将这924种核酸探 针用博奥核酸点样液配制成相应924种样品，每种样品取出lOuM转移加入384孔 板中；
2. 通过自动点样装置将准备好的点样样品分别点到实施例l-12制备的高分子 聚合物三维氨基基片表面。每张基片点制两个点阵。每个点阵分成8个亚阵，点阵 示意如图5:每个亚阵有22行，21列，点间距为245um，点的直径为150 ii ra。每 条探针对每种基片重复三次。
3. 将点样后芯片于125-400 mj紫外交联进行固定，随后清洗、甩干；
4. 样品制备、标记；
5. 向每个芯片点阵加入含有标记的样品杂交液，杂交液组成为0. 2%SDS、 3X SSC， 25%甲酰胺、5XDenhardt， s。在100%湿度下，于42°C下杂交12-16小时；
6. 反应后芯片分别用两种洗液清洗，离心甩干；两种特定洗液I和II的组成分 别为洗液I: 0. 3XSSC/0. 1%SDS;洗液II: 0. 06XSSC。
7. 芯片扫描和数据处理。使用晶芯tm Luxscan-10K/A (博奥生物有限公司)扫 描杂交后的miRNA芯片，扫描参数均设定Laser/PMT^95/710。实施例9制得的甲壳 素基片检测扫描结果如图6所示。实施例1-8和10-12制得的其它高分子聚合物三 维氨基基片具有相似效果。
扫描结果表明，本发明的高分子三维氨基基片所有点的直径大小几乎相等，没 有随点样顺序减小的趋势，说明基片稳定性高，点形状饱满，均为130土3um，且界 限非常明显，易于提取数据和数据分析。
权利要求
1、一种制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在玻片片基表面连接富含氨基的聚合物，得到表面连接上富含氨基的聚合物的基片。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述连接的方法包括如下步骤: 将所述玻片片基置于所述富含氨基的聚合物的溶液中，吸附，得到所述基片。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述吸附的温度为10-50°C。
4、 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述吸附的时间为0.5-30小时。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述连接的方法包括如下步骤: 将所述玻片片基环氧基化，得到环氧基化的玻片片基；将所述环氧基化的玻片片基 置于所述富含氨基的聚合物的溶液中，接枝反应，得到所述基片。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述将玻片片基环氧基化的方 法包括如下步骤将所述玻片片基置于环氧基硅烷化试剂的溶液中，进行环氧基化 反应，得到所述环氧基化的玻片片基。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述环氧基化反应的温度为15-70。c。
8、 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化试剂的溶液的溶剂为异丙醇、乙醇、甲苯或水。
9、 根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化试 剂的溶液中环氧基硅烷化试剂的浓度为0.01%-10% (体积百分含量)。
10、 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述环氧基硅烷化 试剂为(3-Glycidyloxypropyl) triraethoxysilane、(3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane或 (3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane。
11、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述将所述玻片片基环氧基化的方法为将环氧基聚硅氧烷涂敷在所述玻片片基的表面，得到所述环氧基化的玻片 片基。
12、 根据权利要求5-11中任一所述的方法，其特征在于所述接枝反应的温 度为10-5(TC。
13、 根据权利要求5-12中任一所述的方法，其特征在于所述接枝反应的时间为0. 5-30小时。
14、 根据权利要求2-13中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物的溶液中富含氨基的聚合物的浓度为0.001%-0.3% (质量百分含量)。
15、 根据权利要求2-14中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物的溶液为水相。
16、 根据权利要求1-15中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物为壳聚糖、多聚赖氨酸、聚亚乙基亚胺或聚烯丙基胺。
17、 根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述壳聚糖的溶液是按照包 括如下步骤的方法制得的先用醋酸溶解壳聚糖，得到溶液I，再用O. 1XPBS缓 冲液稀释所述溶液I ，得到壳聚糖的溶液；所述壳聚糖的溶液pH值为5. 0-6. 0。
18、 根据权利要求1-17中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚合物的分子量为0. 1万-50万Da。
19、 由权利要求1-18中任一所述方法制备得到的生物芯片基片。
20、 由权利要求19中所述基片制得的生物芯片。
全文摘要
本发明公开了一种高分子聚合物三维氨基基片及其制备方法与应用。该制备生物芯片基片的方法，包括如下步骤在玻片片基表面连接富含氨基的聚合物，得到表面连接上富含氨基的聚合物的基片。实验证明，本发明的基片生物分子固定灵敏度大大提高、样品点饱满、基片表面性质更稳定、确保长时间样品点制过程中样品点的形状始终保持均一、非特异性吸附和自发荧光背景均非常低。本发明基片适合长时间点样的高密度芯片的点制，解决了普通氨基基片存在的长时间点制的高密度芯片中遇到大部分样品固定不上的问题。本发明基片是一种性能优良的生物芯片基底材料，可广泛应用于各种生物芯片的制备上。
文档编号C03C17/28GK101643321SQ20091009214
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者品 吕, 周玉祥, 佳 王, 王素珍, 甘五鹏, 京 程, 黄明贤 申请人:博奥生物有限公司;清华大学