专利名称：大蹼铃蟾抗菌肽及其制备方法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种大蹼铃蟾抗菌肽及其制备方法和在制药中的应用，属生物医学领域。
自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题。三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌，肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效，正成为新一类抗生素，其研制目前受到广泛重视。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点，据国外文献报道，从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；最近，Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78用于治疗926例糖尿病患者因多种细菌感染而引起足部溃疡的III期临床结果表明，MSI-78与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；AppliedMicrobiology公司与Astra公司合作用抗菌肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效。国外学者也已报道从东方铃蟾(Bombina orientalis)和花铃蟾(Bombina variegata)中分离出若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还较少。对两栖类皮肤抗菌肽的研究还未见报道。大蹼铃蟾(Bombina maxima)主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。
发明人将本发明的大蹼铃蟾抗菌肽全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有广谱抗微生物(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌)活性的大蹼铃蟾抗菌肽及其制备方法和在制药中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案大蹼铃蟾抗菌肽，为我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697.6，等电点10.2，多肽一级全序列结构为甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-酰胺化天冬酰胺(NH2-GIGGVLLSAGKAALKGLAKVLAAKYANN-NH2)。
大蹼铃蟾抗菌肽的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥后，经DEAE-Sephadex A-50离子交换后，收取所得峰I经Sephadex G-50凝胶过滤后取峰IV，峰IV再经CM-Sephadex C-25离子交换，取第三步柱层析分离出的峰II，再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第四步HPLC反相C18柱层析分离出的峰II即可(如图4箭头所示)。然后用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
大蹼铃蟾抗菌肽作为制备广谱抗微生物药的应用。
下面用本发明的大蹼铃蟾抗菌肽的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有益效果1，大蹼铃蟾抗菌肽抑制细菌生长的作用抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。
2，大蹼铃蟾抗菌肽抑制真菌生长的作用抗真菌活性检测，采用杯碟法。培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基，分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。真菌株来源于云南大学微生物研究所，此试验重复三次，取平均值，结果如表2。
表1，大蹼铃蟾抗菌肽抑制细菌生长的作用
由表1可见，大蹼铃蟾抗菌肽第一步DEAE-Sephadex A-50离子交换粗品及纯化大蹼铃蟾抗菌肽均具有显著的抑制细菌(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌)生长的作用，而且与文献报道的其他来源抗菌多肽相比，大蹼铃蟾抗菌肽的抗菌活性平均高5-20倍。
表2，大蹼铃蟾抗菌肽抑制真菌生长的作用
由表2可见，除抑制细菌生长外，大蹼铃蟾抗菌肽第一步DEAE-SephadexA-50离子交换粗品及纯化大蹼铃蟾抗菌肽均具有显著的抑制真菌生长的作用，而且与其他来源抗菌多肽相比，抗真菌活性平均也高5-20倍。
从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾抗菌肽的有益效果在于大蹼铃蟾抗菌肽粗品及纯化大蹼铃蟾抗菌肽均有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，所用微生物菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、白色念珠菌、青霉、米曲霉等，结果表明大蹼铃蟾抗菌肽具广谱抗微生物活性(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌；MIC在1-15μg/ml范围内)，而且与其他来源抗菌多肽相比，抗菌活性平均也高5-20倍。因此，本发明的大蹼铃蟾抗菌肽是一种首次从中国特色药用生物资源中研制的具有广谱抗微生物活性的生物活性多肽。
下面结合附图用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
图1为本发明大蹼铃蟾抗菌肽的DEAE-Sephadex A-50离子交换层析图。
图2为本发明大蹼铃蟾抗菌肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。
图3为本发明大蹼铃蟾抗菌肽的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。
图4为本发明大蹼铃蟾抗菌肽的HPLC反相C18柱层析图。
实施例1，制备大蹼铃蟾抗菌肽活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。第一步DEAE Sephadex A-50离子交换，按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉，冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mMEDTA，pH7.3的缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；DEAESephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经0.05MTris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集穿透峰I。
第二步，Sephadex G-50凝胶过滤第一步得到的活性成分穿透峰I冻干，溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，上样于Sephadex G-50(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集峰IV。
第三步，CM Sephadex C-25离子交换凝胶过滤得到的活性成分峰IV上样品于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的CH Sephadex C-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰II。
第四步，反相高压液相层析(RP-HPLC)CM Sephadex C-25离子交换得到的活性成分峰II以水(含0.1％三氟乙酸)乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集高压液相层析HPLC反相C18柱层析峰(如图4箭头标记)即为大蹼铃蟾抗菌肽。
2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油间硝基苄醇二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
3，纯化的大蹼铃蟾抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
通过上述方法制备的大蹼铃蟾抗菌肽，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697.6，等电点10.2，多肽全序列一级结构为甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-酰胺化天冬酰胺(NH2-GIGGVLSAGKAALKGLAKVLAAKYANN-NH2)。大蹼铃蟾抗菌肽具有广谱抗微生物活性和显著的抑制细菌和真菌生长作用，作为广谱抗微生物物质在制备治微生物感染疾病药物的应用。
权利要求
1，大蹼铃蟾抗菌肽，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2697.6，等电点10.2，多肽全序列一级结构为甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-亮氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丙氨酸-甘氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-酰胺化天冬酰胺。
2，大蹼铃蟾抗菌肽的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。
3，大蹼铃蟾抗菌肽作为广谱抗微生物物质在制备治微生物感染疾病药物的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学领域。大蹼铃蟾抗菌肽,为从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽,分子量2697.6,等电点10.2,多肽一级全序列结构为:NH
文档编号C07K14/435GK1336383SQ0012241
公开日2002年2月20日 申请日期2000年7月29日 优先权日2000年7月29日
发明者张云, 赖仞 申请人:中国科学院昆明动物研究所