专利名称：羊草抗旱基因hva1的克隆的制作方法
所属领域本发明涉及分子生物学、基因工程等领域，是一抗旱基因在新的抗旱物种中发现，预知有更强的抗旱功能。
背景技术：
地球上有三分之一以上的土地面积属于干旱和半干旱的地区[1]，我国大约有一亿亩盐碱地，我国西北地区、东北地区、黑龙江省的西部地区，均列入干旱或盐碱地带。近年来又由于森林砍伐过快，造林更新跟不上，干旱地区已经扩大不少，生态平衡失调，绿色覆盖度如果不快速增加，则有继续增加干旱的危险[2]。由于干旱将使全球粮食产量降低10％-20％，使树木的生长受到威胁，而地球上的淡水资源仅占地球表面水资源的1.6％。工业的发展和人口的不断增加，耕地面积越来越少。因此，迫切需要开发利用盐碱地和干旱地。并且研究植物的抗旱机理，应用分子生物学的方法克隆抗旱基因，运用基因工程的技术培育耐旱物种是利用干旱地的一条经济而有效的途径。
抗旱途径是多种多样的。目前学者认为，植物能够通过信号传递、渗透调节、代谢调整、脱水保护等多种机制适应干旱胁迫。在植物受到轻度干旱胁迫时，低分子量渗透调节物质积累，如糖醇、特殊氨基酸、甘氨酸甜菜碱等，是增强植物对渗透胁迫的适应和耐受的主要机制。在严重干旱条件下，超出渗透调节范围时，有些植物能够存活，恢复供水后迅速恢复生长，其机理在于，这些植物在失水时产生的一些大分子或小分子有机物具有脱水保护功能，能够在水分亏缺时保护膜系统及其他生物大分子免受破坏，晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA蛋白)及糖类是这类脱水保护物质的代表。LEA基因全称是晚期胚胎发生丰富蛋白(LateEmbryogenesis Abundant Protein)基因。是在种子胚胎发生后期种子中大量积累的一种蛋白质。LEA蛋白广泛存在于高等植物中。在植物个体发育的其他阶段，也能因ABA或脱水诱导而在其他组织中高水平表达。LEA蛋白被分为3组，即group1 LEA蛋白、group2 LEA蛋白、group3 LEA蛋白第三组LEA与植物抗脱水胁迫相关。LEA蛋白作为脱水保护剂一方面与胞内的其他蛋白发生作用，使他们的结构保持稳定，另一方面给细胞内的束缚水提供一个结合衬质，使细胞在脱水中免受迫害.LEA蛋白形成亲水的α螺旋结构，扩大了与离子结合的表面积；并存在着周期性的荷电离子空间结合位点，在脱水时荷电离子结合于这些位点，从而缓冲了因脱水使离子强度提高造成的细胞伤害。另外，它是植物渗透调节机制的一部分是糖醇、脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质合成和运输的调节蛋白。因而LEA蛋白具有较强的抗旱能力。
在所有已知的group3 LEA蛋白中的，对大麦的HVA1蛋白研究较多。HVA1蛋白最出在大麦的糊粉层里发现的，它晚期胚胎外周区域里特异地表达，可被ABA、干旱、冷热击和盐胁迫诱导表达。1996年，Xu等将其转入水稻，第二代转基因植株明显表现出对干旱的抵抗能力。并在去掉胁迫的时候，与对照植株相比，能迅速恢复生长。
经检索未发现任何公开或报道过羊草HVA1基因及蛋白序列。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新抗旱基因-羊草HVA1基因，该基因编码抗旱蛋白。
本发明的第二目的是提供产生上述羊草HVA1基因的方法。
为了达到上述目的本发明是一种分离出的羊草DNA分子，其特征在于，它包括编码据有LEA(晚期胚胎发生丰富蛋白)第三组的HVA1蛋白的功能区序列，所述的核苷酸序列与基因库中大麦的该基因有90％的同源性；它包含8个由11个氨基酸残基构成的基元序列。
本发明优点是1抗旱基因的选择。该基因在抗旱过程中具有以下优点LEA蛋白作为脱水保护剂一方面与胞内的其他蛋白发生作用，使他们的结构保持稳定，另一方面为亲水的α螺旋结构，给细胞内的束缚水提供一个结合衬质，使细胞在脱水中免受迫害；并存在着周期性的荷电离子空间结合位点，在脱水时荷电离子结合于这些位点，从而缓冲了因脱水使离子强度提高造成的细胞伤害；另外，它是植物渗透调节机制的一部分是糖醇、脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质合成和运输的调节蛋白，因而LEA蛋白具有较强的抗旱能力，区别与其他基因单一调节的抗旱机制。
2本发明运用简并引物与梯度PCR法协同筛选HVA1基因家族中的新成员。虽然利用简并PCR筛选基因家族新成员的方法早有报道。近年来，许多新基因的发现都是运用这一方法的结果，如JNK1的发现其原理是根据所有基因家族都具有其家族所特有的保守氨基酸区域，通过设计简并PCR引物结合于这一区域就可以选择性的扩增某一家族成员。继而克隆PCR产物，然后进行测序并与基因数据库比较分析，就能很快知道是不是新的基因家族成员。这一方法还能用于鉴定基因家族成员在某一组织或细胞的表达情况。然而运用简并PCR方法筛选基因家族新成员成功与否的关键在于简并PCR引物的设计已知HVA1家族的不同植物的氨基酸序列，根据序列分析发现保守氨基酸序列是AGETKA和GKDKTG。根据保守序列设计了两个长为17bp和18bp的简并核苷酸引物兼并引物15′GCT(GAC)GGT(GAC)GAA(G)ACT(GAC)AAA(G)GC3′兼并引物25′A(GCT)CCT(GAC)GTT(C)TTA(G)TCT(C)TTA(GTC)CC3′。因为设计引物1时，最后一个氨基酸为A，编码它的密码子有4种GCT(GAC)，因此在引物的第18位为4种核酸，这样易形成错配，因而去掉一个碱基，设计了17个bp长的引物。简并PCR反应是在非严谨条件下进行的，即反应的退火温度相当低，我们做了梯度PCR，即选择46-64℃之间设了11个梯度作为退火温度，PCR产物经电泳鉴定，能得到大约500bp和700bp一大一小的两条带。用这两个PCR引物扩增出来的DNA片段克隆进行测序分析。分析这些独立克隆的核苷酸序列就能知道对应的DNA片段是否是HVA1基因片段。梯度PCR的运用与简并引物的协同使用给了我们提供了便捷，以便能够很巧秒的克隆出目的片段。
3本发明的另一创新之处在于以羊草的DNA为模板。通常兼并PCR法都是与RT-PCR法联合应用，即提取植物的RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增，得到不含有内含子的目的基因片段。而本实验则具体问题具体分析HVA1基因内含子较短，在大麦中长109bp，故推测在与它们同一科的植物—羊草中也为100bp左右。所以省去了提取RNA、反转录cDNA的繁琐步骤，直接从DNA中获得目的片段。
图1是不同物种HVA1基因的同源性比较2是羊草的HVA1与大麦的HVA1的蛋白序列比较图
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述，由图1——图2可知本发明包括编码据有LEA(晚期胚胎发生丰富蛋白)第三组的HVA1蛋白的功能区序列，所述的核苷酸序列与基因库中大麦的该基因有90％的同源性；它包含8个由11个氨基酸残基构成的基元序列。
所述的核酸序列有497bp，其中包括86bp的内含子序列。要求保护序列如下GCCGGGGAGACCAAGGCCCGCACCGAGGTAACCGTCGTCTCCCGCAGTGCCTACCACTTCATCGTGCATCCGTGCTCAGTGATCTGAAATGTTCTCTTGGTTTGGCTGTGCAGGAGAAGACCGGGCAGATGATGGGCGTCACCAAGGACAAGGCGGGGCAGGCCACGGAGGCCACCAAGCAGAAGGCCGGCGAGACGACCGAGGTCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGACGGCCGAGGCCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGGCCAAGGACAAGACGGCACAGACGGCGCAGGCGGCCAAAGAAAAGACGTACGAGACGGCGCAGGCGGCCAAGGAGCGCGCCGCCCAGGGCAAGGACCAGACCGGCAGCACCCTCGCCGAGACCACGGAGGCGGCCAAGCAGAAGGCTGCCGAGGCAACCGAGACGGCCAAGCAGAAGGCGTCGGAGACGGCGCAGTACACCAAGGAGTCCGCCGTGGCCGGCAAAGACAAGACCGGAGTAACCGTCGTCTCCCGCAGTGCCTACCACTTCATCGTGCATCCGTGCTCAGTGATCTGAAATGTTCTCTTGGTTTGGCTGTGCAG为内含子该基因的核酸可编码137个氨基酸。该基因编码的氨基酸与大麦HVA1基因编码的氨基酸相比少一个基元序列。载体它包含权利要求1所述的DNA。
所述的载体转化的宿主细胞为JM109菌株。
一种产生新基因—羊草HVA1的DNA的方法其特征在于(1)比较基因HVA1在已知物种中的同源性，其同源性较高。根据保守部位设计混合引物，运用兼并-PCR的方法从羊草中克隆出该基因的，又因该基因的内含子较短，本发明直接从DNA中克隆出该基因的部分片段，应用梯度PCR仪进行梯度PCR扩增，选择最佳PCR条件，进行大量扩增。
(2)电泳PCR产物，回收目的片段(3)将步骤(2)所述的目的片段连接至PMD18-T载体(4)将步骤(3)所述的载体转入宿主细胞Jm109，测序。
实施例11比较不同物种中该基因的同源性2设计的混合引物P1P1GCNGGNGARACNAARGCP2NCCNGTYTTRTCYTTNCCN代表A、T、C、GR代表A、GY代表T、C3羊草DNA的提取用改良的CTAB法提取总DNA。
3.1取嫩羊草叶5克，用研钵研碎，加入2倍的70度温浴的CTAB，均匀混匀。
3.2加入5毫升氯仿/异戊醇3.3室温，振荡混合30分钟3.4移至离心管中，2800转，15分钟，室温离心3.5取水层移到新的离心管中，在加5毫升氯仿/异戊醇
3.6室温，10分钟振荡，混匀3.7 2800转，15分钟，室温3.8取水层，移入新的离心管，加入10％的CTAB，混匀，加入等体积的沉淀用Buffer3.9室温，混合30分钟3.10室温2800转15分钟离心，弃上清，加入1M的NaCl-TE3.10 55度溶解，加5毫升异丙醇3.11混匀后，2800转10分钟，室温3.12弃上清，加入5毫升70％乙醇3.13离心，同上，弃上清，加入3毫升TE3.14 55度溶解沉淀，加入300毫升10倍的RNase3.15 55度30分钟3.16分装，-20℃，保存4酚、氯仿抽提去除蛋白质4.1取50微升羊草DNA，补充到100微升，加入等体积的酚/氯仿，混匀，取上清4.2在上清中加入，1/10体积的3MNaAc，混匀4.3加入2～2.5体积的100％的冷乙醇，混匀4.4-20度，静止30分钟4.5 16000转，离心10分钟，弃上清4.6加入70％的乙醇，混匀，离心同上4.7干燥15分钟4.8加入超纯水，溶解沉淀.
5 PCR5.1PCR反应条件应用梯度PCR仪，步骤Step 195度2分钟Step 295度30秒Step 346度-64度1分钟Step 472度2分钟Step 5循环到步骤2，直到循环30次Step 672度10分钟Step 74度5.2 PCR混合液配制EXPremix(宝生物公司)5微升稀释后的羊草DNA1微升(约100纳克)P1 1微升P2 1微升无菌超纯水 1微升共配制10管PCR混合液，进行梯度扩增5.3扩增产物电泳6割胶回收(用华美公司的胶回收试剂盒)7克隆至TA载体
TA载体图(应用宝生物公司的试剂盒)新基因的克隆片段与TA载体的连接反应液PMD18-T Vector0.5微升目的片段 4.5微升Solution I5微升用CaCl2刺激的大肠杆菌进行转化后，涂板过夜.
8取菌株，用煮沸法提取质粒8.1将菌液倒入1.5毫升离心管中8.2离心3分钟，5000转，15度8.3弃上清，扣在纸上干燥8.4向每个离心管中加入25微升溶菌酶，350微升STET，用旋涡混合器混匀8.5放入热水浴(100度)，40秒8.6离心15分钟，12000转，15度8.7取出，挑出蛋白质8.8向每个离心管中加入400微升异丙醇，混匀，放入-20度冰箱中，20分钟8.9取出，离心10分钟，12000转，4度8.10倒掉上清液，底部为DNA，倒扣在纸上干燥，15分钟8.11向每个离心管中加入20微升无菌水，用手弹匀。
9酶切检测，并测序。
实施例2羊草HVA1基因的序列信息与同原性分析以下部分微克隆的羊草HVA1序列GCCGGGGAGACCAAGGCCCGCACCGAGGTAACCGTCGTCTCCCGCAGTGCCTACCACTTCATCGTGCATCCGTGCTCAGTGATCTGAAATGTTCTCTTGGTTTGGCTGTGCAGGAGAAGACCGGGCAGATGATGGGCGTCACCAAGGACAAGGCGGGGCAGGCCACGGAGGCCACCAAGCAGAAGGCCGGCGAGACGACCGAGGTCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGACGGCCGAGGCCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGGCCAAGGACAAGACGGCACAGACGGCGCAGGCGGCCAAAGAAAAGACGTACGAGACGGCGCAGGCGGCCAAGGAGCGCGCCGCCCAGGGCAAGGACCAGACCGGCAGCACCCTCGCCGAGACCACGGAGGCGGCCAAGCAGAAGGCTGCCGAGGCAACCGAGACGGCCAAGCAGAAGGCGTCGGAGACGGCGCAGTACACCAAGGAGTCCGCCGTGGCCGGCAAAGACAAGACCGGAGCCGGGGAGACCAAGGC为简并引物1对应的核酸序列GGCAAAGACAAGACCGGA为简并引物2对应的核酸序列GTAACCGTCGTCTCCCGCAGTGCCTACCACTTCATCGTGCATCCGTGCTCAGTGATCTGAAATGTTCTCTTGGTTTGGCTGTGCAG为内含子对应的翻译区为内含子之前的序列AGETKARTE内含子之后的序列EKTGQMMGVTKDKAGQATEATKQKAGETTEVTKQKAAETAEATKQKAAEAKDKTAQTAQAAKEKTYETAQAAKERAAQGKDQTGSTLAETTEAAKQKAAEATETAKQKASETAQYTKESAVAGKDKTG带有下划线的部位为混和引物对应的部位.简并引物之间共计137个氨基酸，有12个氨基酸有差异，与大麦的同源性为91.24％.他们在结构上的差异仅在于该基因比大麦的HVA1缺少1个含有11个氨基酸残基的基元序列(彩色部分为基元序列)，其他部分则相同。大麦(H.vulgare L.)与羊草是同为禾本科植物，因而具有几乎相同的第3组LEA基因。由11个氨基酸残基构成的基元序列是第3组LEA蛋白的结构特征，该基元序列是亲水亲脂兼的，呈α-螺旋结构，是形成第3组LEA蛋白高级结构的基础，是其具有抗旱功能的基础。本发明从羊草中分离该基因，即从新的物种中分离该基因，因而具有创新性；羊草属耐干旱、耐盐碱植物，因而预知该基因有更强的抗旱、耐盐碱功能，有更新的实用价值。
权利要求
1 一种分离出的羊草DNA分子，其特征在于，它包括编码据有LEA(晚期胚胎发生丰富蛋白)第三组的HVA1蛋白的功能区序列，所述的核苷酸序列与基因库中大麦的该基因有90％的同源性；它包含8个由11个氨基酸残基构成的基元序列。
2 权利要求1所述的分离出的羊草DNA分子，其特征在于，所述的核酸序列有497bp，其中包括86bp的内含子序列。要求保护序列如下GCCGGGGAGACCAAGGCCCGCACCGAG GAGAAGACCGGGCAGATGATGGGCGTCACCAAGGACAAGGCGGGGCAGGCCACGGAGGCCACCAAGCAGAAGGCCGGCGAGACGACCGAGGTCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGACGGCCGAGGCCACCAAGCAAAAGGCCGCCGAGGCCAAGGACAAGACGGCACAGACGGCGCAGGCGGCCAAAGAAAAGACGTACGAGACGGCGCAGGCGGCCAAGGAGCGCGCCGCCCAGGGCAAGGACCAGACCGGCAGCACCCTCGCCGAGACCACGGAGGCGGCCAAGCAGAAGGCTGCCGAGGCAACCGAGACGGCCAAGCAGAAGGCGTCGGAGACGGCGCAGTACACCAAGGAGTCCGCCGTGGCCGGCAAAGACAAGACCGGA 为内含子
3 按照权利要求1或2所述的分离出的羊草DNA分子，其特征在于，其核酸可编码137个氨基酸。
4 按照权利要求1所述的分离出的羊草DNA分子，其编码的氨基酸与大麦HVA1基因相比少一个基元序列。
5 一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
6 按照权利要求5所述的载体，其特征在于转化的宿主细胞为JM109菌株。
7 一种产生新基因-羊草HVA1的DNA的方法其特征在于(1)比较基因HVA1在已知物种中的同源性，其同源性较高。根据保守部位设计混合引物，运用兼并-PCR的方法从羊草中克隆出该基因的，又因该基因的内含子较短，本发明直接从DNA中克隆出该基因的部分片段，应用梯度PCR仪进行梯度PCR扩增，选择最佳PCR条件，进行大量扩增。(2)电泳PCR产物，回收目的片段(3)将步骤(2)所述的目的片段连接至PMD18-T载体(4)将步骤(3)所述的载体转入宿主细胞Jm109，测序。
全文摘要
本发明提供了一种在新的抗旱基因羊草HVA1基因，此DNA分子它包括编码据有LEA(晚期胚胎发生丰富蛋白)第三组的HVA1蛋白的功能区序列，所述的核苷酸序列与基因库中大麦的该基因有90％的同源性，本发明还提供了该核酸序列制备方法及分析方法。
文档编号C07H21/00GK1550552SQ03110970
公开日2004年12月1日 申请日期2003年1月26日 优先权日2003年1月26日
发明者祖元刚, 马媛媛, 王慧梅, 于景华 申请人:东北林业大学, 祖元刚