一种分离纯化莱鲍迪甙a的方法
【专利摘要】本发明公开了一种莱鲍迪甙A的分离纯化方法，其固定相采用磺酸基色谱填料，流动相为有机溶剂水溶液，通过色谱柱平衡、上样、洗脱而得到高纯度莱鲍迪甙A。本发明采用吸附量大的季胺基色谱填料，得到的产品纯度高，适宜于工业化生产。
【专利说明】一种分离纯化莱鲍迪甙A的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离纯化莱鲍迪甙A的方法，属于食品化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]甜菊糖是从菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)中提取的一种天然甜味剂。甜菊糖为糖甙混合物，其中莱鲍迪甙A (Rebaudioside A, RA)的甜度为蔗糖的35(T450倍且口味纯正，其高甜度、低热量的特点特别适宜肥胖症、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿患者食用，是蔗糖和其他合成甜味剂的最佳替代品。2008年美国FDA正式给予高纯度莱鲍迪甙A (含量> 97%) GRAS ( 一般公认安全物质)地位，因此全球市场对高纯度RA的需求将迅速放大。
[0003]中国是全球甜菊种植面积、甜菊糖产量最大的国家，但因技术受限、产品以纯度较低的RA粗品为主。RA中的主要杂质甜菊糖甙(Stevioside，ST)和莱鲍迪甙C(Rebaudioside C，RC)均为RA的结构类似物,后者苦味较重,严重影响甜菊糖的品质与售价。
[0004]目前，已公开高纯度RA的制备方法有重结晶法和色谱法。重结晶法是利用甜菊糖各糖苷在有机溶剂如甲醇中溶解度的差异而多次结晶制备出高纯度的RA，该法工序繁琐、收率较低、溶剂消耗大且成本较高。
[0005]因此，很多研究者尝试采用色谱法制备高纯RA。胡静(大孔树脂D107和D108对甜菊糖中SS和RA的分离研究，食品研究与开发，2008，29(6): 1-4)采用大孔吸附树脂D107、D108，以反向色谱模式来精制RA，但效果不甚理想。陈天红(高分子吸附剂对甜叶菊中各糖甙吸附选择性的研究，中国科学(B辑)，1998，28 (5) =460-465)在疏水骨架上引入不同的基团如伯氨基、酮基、吡啶基、酰胺基、葡糖基、酯基等，意图利用甜菊糖各组分的不同糖基与上述功能基团形成氢键`能力的差异而增加吸附介质对RA与ST的选择性。研究表明甜菊糖在上述介质上的吸附仍主要为疏水性甙元与骨架间的物理吸附，并未达到最初的设计意图。
[0006]Dominik Bergs 等人(Preparative purification of rebaudioside A fromaqueous extracts using chromatography: a process idea, J.Verbr.Lebensm.,2012 (7): 295 - 303)采用3步色谱串联制备RA，其最后一步精制过程采用伯胺基(-NH(CH2)2NH2)硅胶基质色谱填料，洗脱剂为80%乙腈水溶液，最终得到纯度为96.8%的RA,该步收率为97.5%。
[0007]美国专利US20120083593公开了一种RA的精制方法。其核心是采用伯胺基(-NH(CH2)2NH2)树脂，该树脂归属于弱碱性阴离子交换树脂，树脂的骨架是聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等高聚物，以水溶性有机溶剂如甲醇、异丙醇、丙酮、乙腈的组合或5%-40%的丙酮水溶液洗脱，经结晶得到纯度> 98%的RA组分。由于树脂的骨架为高聚物，在不同浓度有机溶剂条件下存在体积变化，操作时柱压波动较大，甚至导致流动相难以流动、填料破碎等不利情况，而不得不通过二级、甚至三级色谱柱串联逐级减压的方式以克服其不足，因而必然引起设备投资大、工艺繁琐、操作不便等弊端。[0008]上述两种采用伯胺基硅胶填料或伯胺基树脂的RA制备方法与甜菊糖甙的国标(GB 8270-1999，食品添加剂甜菊糖甙)检测方法基本一致，填料的官能团均为伯胺基，洗脱剂均为高浓度水溶性有机溶剂的水溶液。所不同在于国标的甜菊糖检测方法采用线性色谱技术，主要目的在于分析，而文献中的两种方法采用非线性色谱技术，主要目的在于制备。因此属于不同的技术范畴。[0009]目前，季胺基强碱性阴离子交换树脂在甜菊糖行业得到广泛应用，主要用于甜菊糖的脱色(施荣富，史作清，范云鸽，王春红，路延龄，何炳林，季铵基吸附树脂的合成及其在甜菊甙提取分离中的应用，离子交换与吸附，2001，17(2): 117-122)。发明人前期研究(亲水作用色谱法测定甜菊糖主要极性组分，食品科学，2013，34(14):280-284，陈斌，李曙光，马晓迅，陈国亮，李蓉)发现在线性色谱条件下，季胺基硅胶色谱填料对甜菊糖的检测效果明显优于伯胺基硅胶填料。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种适宜于工业化生产的分离纯化莱鲍迪甙A的新方法，以克服现有技术吸附量越小，分离介质骨架不稳定的不足。[0011]本发明实现过程如下: 一种分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其包括以下步骤: (1)色谱柱平衡:向色谱柱内通入流动相平衡色谱柱； (2)上样:将含有莱鲍迪甙A的粗品溶解于流动相，泵入色谱柱内或通过将莱鲍迪甙A粗品流动相与色谱填料拌合，将干燥后的色谱填料放入色谱柱的柱头；色谱填料为季胺基色谱填料； (3)洗脱:以紫外或ELSD检测器监测，以流动相洗脱至莱鲍迪甙A从色谱柱出峰结束。[0012]所述季胺基色谱填料的骨架为硅胶、氧化铝或二氧化锆，最好为硅胶；功能基团为季胺基-CH2N+(CH3)3X-或-CH2N+(CH3)2CH2CH2OHx-;其中 F 为 OH' Cl' SO42' COO' NOf 或CH3COCT,如商品化的 S印ra? SAX、ZORBAX SAX 或 Alltech Anion/S。[0013]上述流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、异丙醇水溶液、丙酮水溶液或乙腈水溶液。[0014]步骤(1)中平衡色谱柱的流动相最好为体积比85-95%的丙酮水溶液。[0015]步骤(2)中，上样时的流动相最好为体积比85-95%的丙酮水溶液。[0016]步骤(3)中，洗脱时的流动相为等度洗脱或多阶段等度洗脱或线性梯度洗脱，若采用等度洗脱的流动相最好为体积比85-95%的丙酮水溶液；若采用多阶段等度洗脱时，先采用体积比85-95%的丙酮水溶液洗脱至莱鲍迪甙C出峰结束，再切换至低于体积比85%的丙酮水溶液或纯水洗脱；若采用线性梯度洗脱为上样时的流动相浓度至纯水溶液。[0017]上述色谱柱平衡、上样、洗脱各步骤的流速为50-600cm/hr，最好为200_250cm/hr。[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果: 1、季胺基色谱填料的吸附量与选择性均明显优于伯胺基色谱填料。同样生产任务下，吸附量越大，则所需的色谱填料越少，因此色谱填料与色谱设备的投资均显著下降；2、硅胶为刚性骨架，在有机溶剂中体积稳定，克服了高聚物填料在有机溶剂中体积变化所导致的柱压波动、填料的破碎及难以流动等弊端；
3、本发明方法得到的产品纯度高，适宜于工业化生产。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例用于进一步说明本发明，但不表示实施例中所述方式是实施本发明的唯一途径，也不意味着对本发明的任何限制。
[0020]实施例1季胺基填料与伯胺基填料的比较
60%纯度RA由曲阜圣仁制药有限公司惠赠，以90% (v/v)丙酮-水溶液配制成10 g/L样品溶液备用。
[0021]各取1.0 g季胺基填料Sepra? SAX (Phenomenex)与伯胺基填料Sepra? NH2于100 mL三角瓶中，再各移取7.5 mL上述60%纯度RA样品溶液、7.5 mL去离子水于三角瓶中。将三角瓶放置入摇床，30°C，150 rpm保持12 h.测试结果如下。
【权利要求】
1.一种分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)色谱柱平衡:向色谱柱内通入流动相平衡色谱柱； (2)上样:将含有莱鲍迪甙A的粗品溶解于流动相，泵入色谱柱内或通过将莱鲍迪甙A粗品流动相与色谱填料拌合，将干燥后的色谱填料放入色谱柱的柱头；色谱填料为季胺基色谱填料； (3)洗脱:以紫外或ELSD检测器监测，以流动相洗脱至莱鲍迪甙A从色谱柱出峰结束。
2.根据权利要求1所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:所述季胺基色谱填料的骨架为硅胶、氧化铝或二氧化锆，功能基团为季胺基-CH2N+ (CH3) 3X_或-CH2N+ (CH2CH2CH2OHX-;其中 r 为 OH' Cl' SO42' COO' NOf 或 CH3COO'
3.根据权利要求2所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于季胺基色谱填料的骨架为硅胶。
4.根据权利要求2所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于季胺基色谱填料为商品化的 S印ra? SAX、ZORBAX SAX 或 Alltech Anion/S。
5.根据权利要求2所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:流动相为甲醇水溶液、乙醇水溶液、异丙醇水溶液、丙酮水溶液或乙腈水溶液。
6.根据权利要求2所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:步骤(1)和(2)中，平衡色谱柱的流动相和上样时的流动相均为体积比85-95%的丙酮水溶液。
7.根据权利要求2所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:步骤(3)中，洗脱时的流动相为等度洗脱或多阶段等度洗脱或线性梯度洗脱。
8.根据权利要求7所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:等度洗脱的流动相为体积比85-95%的丙酮水溶液。
9.根据权利要求7所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:多阶段等度洗脱时，先采用体积比85-95%的丙酮水溶液洗脱至莱鲍迪甙C出峰结束，再切换至低于体积比85%的丙酮水溶液或纯水洗脱。
10.根据权利要求7所述的分离纯化莱鲍迪甙A的方法，其特征在于:线性梯度洗脱为上样时的流动相浓度至纯水溶液。
【文档编号】C07H15/256GK103613622SQ201310532268
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】李蓉, 陈斌, 陈晓慧, 李曙光, 杨凯迪, 马晓迅, 陈国亮 申请人:西北大学