一种人SARDH多肽及其抗体制备方法与流程

本发明涉及一种多肽及其抗体制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

2.

背景技术：

1)SARDH功能：肌氨酸脱氢酶SARDH位于线粒体基质中，由918个氨基酸组成。其表达基因位于人体9号染色体上。主要参与细胞内胺和多胺的降解过程。SARDH以黄素蛋白和FAD做为辅助因子，催化肌氨酸的氧化去甲基化作用，并形成甲醛和甘氨酸等产物。SARDH合成基因缺陷的人群罹患肌氨酸血症。此类疾病属于良性的代谢功能紊乱症，同时伴有血浆和尿液中肌氨酸水平的升高，在有些患者中还会出现智力迟钝和其他神经类疾病。

2)SARDH抗体产品信息：经检索，除我公司产品外，市场上没有其他Anti-SARDH多克隆抗体。

3)SARDH抗体的应用：

一组近期发表在Neoplasia杂志上的研究表明前列腺癌进展期病人细胞内肌氨酸(N-甲基化甘氨酸)的水平明显升高，并且伴有尿液中此类代谢产物浓度的显著升高(Khan et al.，2013，Neoplasia 15，491-501)。在此类恶性程度高的癌症病人中，肌氨酸合成酶，即甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)的水平在前列腺癌组织中的浓度明显升高，而两类肌氨酸代谢酶，即肌氨酸脱氢酶SARDH和哌啶酸氧化酶PIPOX的细胞浓度却显著下降。进一步研究表明GNMT通过促进肌氨酸的合成使得前列腺癌癌细胞的恶性程度提高，而SARDH则通过降低细胞内肌氨酸的水平使得癌细胞恶性程度下降。实验表明GNMT敲出或SARDH过表达的前列腺癌细胞的生长和转移都受到抑制。此项研究得出的结论与另外一组研究(Chen et al.，2011，J Biol Chem 286，16091-16100)得出的结果相类似，即SARDH很可能是前列腺癌分化，生长和转移的细胞抑制因子。因此，将来SARDH在前列腺癌的诊断，治疗和预后评估等方面很可能成为重要的生物标志物。

3.

技术实现要素：

本发明提供了一种SARDH多肽，其序列为：RERSHESYAKNYSV。用此多肽制备的抗SARDH抗体可以在免疫印迹(Western blot)及免疫组化(IHC) 分析中特异识别组织或细胞中的天然SARDH蛋白。

抗SARDH抗体是通过以下步骤获得的：

步骤一：多肽序列的分析和设计：利用DNAstar软件对SARDH蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，最终确定SARDH蛋白457-470位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸序列，序列为RERSHESYAKNYSV。

步骤二：多肽合成和交联：采用ACT396全自动多通道多肽合成仪合成目的多肽，并采用质谱进行鉴定；为增强多肽的抗原性，将SARDH多肽与载体蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤三：多肽免疫和抗血清制备：将交联后的SARDH-KLH与弗氏佐剂混合乳化，在新西兰兔背部进行皮内注射免疫，并反复加强免疫，至取血检测抗体效价达到标准时停止免疫。

步骤四：抗体纯化：实验兔抗体效价达到标准后，采用心脏取血，分离抗血清，采用Protein A纯化全抗体后，进一步采用肽亲和纯化，得到目标抗体。

抗SARDH抗体是通过以下步骤鉴定的：

步骤一：免疫印迹：将所获得的SARDH抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的天然SARDH蛋白相互作用，可用于免疫印迹试验。

步骤二：免疫组化：将所获得的SARDH抗体作为一抗，采用标准的免疫组化方法，用于检测组织芯片(9种人体组织)，确认该抗体能够与具有天然结构的SARDH蛋白相互作用，可用于免疫组化试验。

4.附图说明

图1为免疫印迹图(Western blot)

图2为免疫组化(IHC)图

5.具体实施方式

1.多肽序列的分析和设计

利用DNAstar软件对SARDH蛋白的氨基酸序列进行抗原表位分析，主要评估亲水性，抗原性，表面可能性，柔性区等指数，再结合过去制备抗体的实际经验，考虑氨基酸结构复杂程度，易氧化程度，合成难度，氨基酸类别和分布等，最终确定SARDH蛋白457-470位14个氨基酸作为合成多肽氨基酸 序列，序列为RERSHESYAKNYSV。同时，为保证后期多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N末端增加一个半胱氨酸C，最终待合成多肽序列为C-RERSHESYAKNYSV。

2.多肽合成和交联

采用ACT396全自动多通道多肽合成仪，按照编制好的程序自动合成目的多肽，将合成后的多肽溶于50％乙腈，采用质谱仪进行鉴定，确认所获得的多肽为目的多肽。采用Sulfo-SMCC作为交联剂将载体蛋白KLH与合成多肽进行交联：取10mg KLH溶于0.5ml超纯水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超纯水中，用3M NaOH调pH值7左右。在混匀情况下，把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入KLH溶液中，室温下旋转混匀反应物30min。将反应好的sulfo-SMCC/KLH混合液上样到预先用平衡缓冲液(0.05M PB，pH6.0)平衡过30min的Sephadex G25柱中，收集浅灰色洗脱液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交联多肽，把0.2体积的sulfo-SMCC/KLH复合物溶液加入到多肽溶液中，调pH值到7.3，室温振摇4小时，-70冷冻后，用冻干机冻干24小时后备用。通过Ellman法检测交联前后多肽巯基确定多肽交联效率。

3.多肽免疫和抗血清制备

将交联好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化(至在水中不扩散为准)。采用兔龄3个月，体重1.75-2.25Kg的健康新西兰兔进行免疫，进行背部皮内注射免疫，至少要注射20点以上。首次免疫3周后，将300μg多肽溶于300μl磷酸缓冲液(0.01M PBS)中，与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮内免疫，作为第一次加强免疫，要求背部皮内注射免疫，至少要注射15点以上。第二次免疫3周后，进行第二次加强免疫，方法和要求同第一次加强免疫。1周后，采用耳缘静脉微量取血，用未交联的合成多肽包被酶标板，间接ELISA法检测免疫血清效价。重复加强免疫和效价测定，直至血清效价达到1∶60000以上，采用心脏取血，标准方法获得抗血清。

4.抗体亲和纯化

(1)、TIgG纯化：用移液器将50％的Protein-A Sepharose混悬液10ml加到30ml层析柱中，去掉顶盖和底帽，液体流出后的柱床体积即为5ml，然后用25ml去离子水冲洗3遍。取出对应的血清10ml，与2ml PBS混合后加入30ml层析柱中，旋转混合器上室温(20-25℃)混旋1小时，让血清样品流出。再用15ml纯化洗液洗层析柱3次，加入10ml洗脱液进行洗脱。

(2)、肽亲和纯化：在层析柱中加入1ml Sulfo-link凝胶悬液(0.5ml凝胶)，待柱内液体流干，用4ml偶联缓冲液冲洗层析柱。用1ml偶联缓冲液溶解合成的SARDH多肽，并加入层析柱，再加入1ml偶联缓冲液至层析柱中，室温颠倒混匀1小时。用6ml偶联缓冲液冲洗层析柱，然后加入3ml封闭液，室温混匀1小时。冲洗层析柱3次，然后向层析柱内加入6ml IgG及3ml PBS，室温颠倒混匀1小时。用PBS冲洗层析柱3次，然后用2ml洗脱液洗脱。将所获得的纯化抗体装入透析袋内4℃透析。透析过夜，然后4000rpm×35min离心除沉淀，收集上清。用间接ELISA法测定抗体效价并用Bradford法测定蛋白浓度。

抗SARDH抗体是通过以下步骤鉴定的：

1.免疫印迹分析

按照标准方法配制SDS-PAGE凝胶，将5μl蛋白浓度为5mg/ml的细胞或者组织裂解液依次加样，恒压80V约30分钟，待样品跑过浓缩胶基本呈一条直线时，改换160V电压，电泳至溴酚蓝指示剂完全跑出分离胶(约60分钟)时终止电泳，采用电转膜方法恒压100V电转80分钟转膜至PVDF膜。将所获得的SARDH抗体作为一抗，采用浓度为1μl/ml与上述转膜得到的抗原芯片在室温下杂交1小时，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下杂交1小时，采用ECL显色法进行显色，在暗室中用X片进行显色和曝光，得到免疫印迹结果。

2.免疫组织化学分析

将4％甲醛溶液固定的组织切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的组织块，乙醇梯度脱水后二甲苯透明30分钟，62℃石蜡浸蜡2小时后，在组织包埋机上将9种组织按照3×3的排列方式用石蜡进行包埋。采用标准石蜡切片方法将切好的4-5μm厚的组织芯片蜡片贴附于APES处理过的载玻片上，在烤片机60℃烤片1小时，然后在烤箱中60℃烤片6小时。采用标准免疫组化方法，室温下用100μl 10％羊血清于湿盒中封闭切片30分钟，加入100μl浓度为2-4μg/ml的SARDH抗体，湿盒中4℃过夜，PBS清洗后加入生物素标记羊抗兔IgG于湿盒中37℃孵育30分钟，然后PBS清洗后加入HRP标记的链霉卵白素浓缩液，湿盒中37℃孵育30分钟，洗片后1％DAB显色，苏木素复染，复蓝，脱水，透明，封片，镜检，检查结果并拍照。