背景技术：
针对生理活性肽和蛋白的新药制剂的开发集中于保持生物活性上，但即便这些也受肽和蛋白在体内固有地短的半衰期或不稳定性的限制。对于流体动力学直径小于约5nm的小肽和蛋白而言，情况尤其如此。长期以来人们一直希望通过使用不断地递送快速降解肽或蛋白药物的输注设备或通过在皮肤下提供药物的侵蚀性补给站来缓解肽和蛋白在体内的这种短半衰期或不稳定性。可延长肽和蛋白在体内和血液中的半衰期和/或提供肽和蛋白在体内和血液中的稳定性的赋形剂的开发是一个新的研究领域。
夹带不稳定或短半衰期药物的脂质体依赖于药物可被释放之前脂质体结构的降解。聚乳酸-乙醇酸共聚物颗粒为另一夹带技术，其依赖于聚合物的酶降解以释放药物。已进行两种或更多种聚合物的半无规接枝，其产生将结合而不是夹带药物的共聚物(美国申请号11/613183、11/971482和castillo等人的pharm.res.2012年第29卷(1)第306-318页)。这样的共聚物将提供所给药的肽和蛋白的血液稳定性、半衰期延长及长时间升高的血液水平(美国申请号11/613183、11/971482和castillo等人的pharm.res.2012年第29卷(1)第306-318页)。
然而，对接枝共聚物产物的制造方法和潜能(以重量为基础，结合肽的能力)加以改进的能力因不存在可确定其中两种聚合物接枝到另一聚合物和相对于彼此接枝的确切组织和周期性(如果有的话)的技术而受限制。看起来存在共聚物分子的组分的组织的方法诱导决定因素，其然后限定最终的共聚物产物组成和性质。由于最终产物的组成组织不能使用现有技术来评价，故产物仅可由用来制造所述产物的方法以及将所述产物与用相似但不相同的方法制得的其他产物区分开来的产物相关性质一起来限定。因为缺乏阐明产物原子组织的分析技术并且各种方法对实验的依赖和对最终产物的潜能的评价可能需要多年的详细试错实验，故制得优异产物的此类方法的确定并不明显。最终产物的组成差异只能通过它们的潜能来确定，潜能可由它们的制造方法限定。这是因为聚合物大，共聚反应是无规的，并且随着反应的进行，被接枝的聚合物的构象可能改变，导致由反应时间线的任何给定时刻下的构象决定的非无规分布。对于聚赖氨酸，构象的改变尤其如此，取决于环境，聚赖氨酸已知将从α螺旋改变为无规卷曲再改变为β折叠，反之亦然(arunkumar等人，1997年，int.j.biol.macromol.，第21卷(3):第223-230页)。构象也可能受其他试剂的影响(mirtic和grdadolnik，2013年，biophys.chem.175-176，第47-53页)并潜在地可能受催化剂的影响。这些影响可保持动态，直至反应终止。
先前合成的聚合物的一些实例将在下文描述。
美国申请号11/613183的实施例6描述了通过使用mpeg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化n-羟基琥珀酰亚胺基聚乙二醇(nhs-peg)来使聚赖氨酸饱和至22％的由甲氧基聚(乙二醇)(mpeg)达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用nhss(n-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐)和edc(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)新活化的mpeg-羧基来制备溶液b的本公开(参见下文)实质上不同，本公开产生饱和至50-60％的聚赖氨酸。另外，美国申请号11/613183的实施例6通过在纯化后用月桂酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的2.4倍摩尔的月桂酸，所述月桂酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的nhss和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的edc活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例6为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如使用三硝基苯磺酸(tnbs)测定伯氨基基团给出仅22％的peg饱和度，产物也是完全不同的产物。
美国申请号11/613183的实施例7描述了通过使用mpeg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化nhs-peg来使聚赖氨酸饱和至22％的由mpeg达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用nhss和edc新活化的mpeg-羧基(溶液b)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例7通过在纯化后用硬脂酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的1.71倍摩尔的硬脂酸，所述硬脂酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的nhss和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的edc活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例7为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如tnbs给出仅22％的peg饱和度，产物也是完全不同的产物。
美国申请号11/613183的实施例8描述了通过使用mpeg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化nhs-peg来使聚赖氨酸饱和至22％的由mpeg达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用nhss和edc新活化的mpeg-羧基(溶液b)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例8通过在纯化后用辛酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的3.36倍摩尔的辛酸，所述辛酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的nhss和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的edc活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例8为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如tnbs给出仅22％的peg饱和度，产物也是完全不同的产物。
美国申请号11/613183的实施例9描述了通过使用mpeg琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化nhs-peg来使聚赖氨酸饱和至55％的由mpeg达到55％饱和的聚赖氨酸，其与使用用nhss和edc新活化的mpeg-羧基(溶液b)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例9通过在纯化后用月桂酸饱和聚赖氨酸-聚乙二醇(plpeg)产物的剩余伯氨基而在所述plpeg产物55％饱和的基础上改性了0.0318mmol(40mg)plpeg伯氨基等价物或0.450mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的1.8倍摩尔的月桂酸，所述月桂酸经用等价于初始伯氨基的0.34倍摩尔的nhss和等价于初始伯氨基的1.16倍摩尔的edc活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例9为完全不同的方法。基于月桂酸或c12的存在，产物也是完全不同的产物。
美国申请号11/613183的实施例12使用1g聚赖氨酸来制备溶液a。将mpeg-琥珀酸酯(5g，初始伯氨基的0.59倍摩尔当量)用250mgnhss(1.15mmol或初始伯氨基的0.68倍摩尔当量)和edc(2.6mmol或初始伯氨基的1.53倍摩尔当量)活化18-20分钟来制备溶液b。通过混合溶液a与b来制备溶液c。4小时后，制备第二溶液b并加到溶液c中，并让反应物温育过夜。这导致聚赖氨酸的ε-伯氨基基团饱和至55％。溶液c中所含mpeg-琥珀酸酯、nhss和edc的最终量分别为初始伯氨基的1.18倍摩尔、1.36倍摩尔和3.06倍摩尔当量。与本公开(参见下文)相比，方法的这些步骤具有不同的试剂添加比率和时机。将plpeg产物纯化、冻干并将剩余的伯氨基基团用硬脂酸饱和，做法是将经纯化的plpeg溶解在具有2mmol三乙胺(初始伯氨基的0.76倍摩尔当量)的143ml二氯甲烷中并加入2mmol(初始伯氨基的0.76倍摩尔当量)新活化的粗c18-nhs/二甲基甲酰胺。将所得产物纯化并测试glp-1结合，发现在10％的加载量下具有33％的游离(参见美国申请号11/613183的图37)。当本公开的产物以10％的加载量加载glp-1时，没有观察到游离的glp-1(参见下表61)，表明美国申请号11/613183的实施例12中概述的方法产生了与本公开不同的产物。
在美国申请号11/613183的实施例13中，将美国申请号11/613183的实施例12中使用的伯氨基基团55％饱和的经纯化plpeg(3g)用二十四烷酸使用与美国申请号11/613183的实施例12类似的方法饱和。同样，基于二十四烷酸的存在，该方法的过程和产物不同于本公开。
美国申请号11/971482的实施例1-3概述了使用预活化nhs-peg的方法，因此这些是与本公开不同的方法。另外，实施例1和3分别具有27％和22％的饱和度，因此，产物与本公开的方法不同。实施例2具有55％的饱和度，但是是使用nhs而不是如本公开中那样使用nhss产生的，故其为不同的方法并且产物可能沿聚赖氨酸骨架具有不同的peg分布。
美国申请号11/971482的实施例4-5使用具有2.4mmol伯胺的1g聚赖氨酸来制备在200mmhepes中的溶液a。将mpeg-羧基(5g，初始伯氨基的0.42倍摩尔当量)用250mgnhss(1.15mmol或初始伯氨基的0.48倍摩尔当量)和500mgedc(2.6mmol或初始伯氨基的1.1倍摩尔当量)活化20分钟来制备溶液b。向溶液a中加入经活化溶液b来制备溶液c。2小时后，制备第二溶液b并加到溶液c中，并让反应温育过夜。这导致聚赖氨酸的ε-伯氨基基团饱和至56％。溶液c中所含mpeg-羧基、nhss和edc的最终量分别为初始伯氨基的0.84倍摩尔、0.96倍摩尔和2.2倍摩尔当量。与本公开(参见下文)相比，除不同的试剂添加时机外，该方法的这些步骤还具有不同的溶液c最终比率。将具有56％饱和度的plpeg产物纯化并如下所述将部分用山嵛酸和硬脂酸饱和。
美国申请号11/971482的实施例5描述了用于山嵛酸或c22饱和的方法，其中使用不同于本公开(参见下文)的方法制得plpeg；将等价于1.1倍初始伯胺的plpeg溶解在53ml二氯甲烷中，200μl或1.44mmol三乙胺(初始伯氨基的1.3倍摩尔当量)和2.5mmol(初始伯氨基的2.3倍摩尔当量)新活化的粗c22-nhs在30ml二甲基甲酰胺：二氯甲烷中。将c22的这一添加重复第二次，让其反应过夜并纯化产物。基于所用试剂及其比例，此方法不同于本公开(参见下文)，并产生具有山嵛酸的产物，其不同于本公开(参见下文)的产物。
美国申请号11/971482的实施例5描述了用于硬脂酸或c18饱和的方法，使用不同于本公开(参见下文)的方法制得plpeg；将等价于1.1倍初始伯胺的plpeg溶解在53ml二氯甲烷中，200μl或1.44mmol三乙胺(初始伯氨基的1.3倍摩尔当量)和2.5mmol(初始伯氨基的2.3倍摩尔当量)新活化的粗c18-nhs在30ml二甲基甲酰胺：二氯甲烷中。将c18的这一添加重复第二次，让其反应过夜并纯化产物。基于所用试剂及其比例，此方法不同于本公开。在功能上，当以2％加载glp-1时，此方法的产物给出5％的游离肽(参见美国申请号11/971482的表1和castillo等人的pharm.res.2012年第29卷(1)第306-318页)，而本公开在2％的加载量下给出0％的游离肽；事实上，甚至在5％和10％的加载量下，本公开的产物仍显示出0％的游离，表明本公开的产物具有非常高的glp-1结合能力(参见下文)。确定的是性质或结合潜能的差异只能由组成差异来解释。
美国申请号11/971482的实施例6使用具有2.4mmol伯胺的1g聚赖氨酸来制备在200mmhepes中的溶液a。将mpeg-琥珀酸酯(5g，初始伯氨基的0.42倍摩尔当量)用250mgnhss(1.15mmol或初始伯氨基的0.48倍摩尔当量)和500mgedc(2.6mmol或初始伯氨基的1.1倍摩尔当量)活化20分钟来制备溶液b。向溶液a中加入经活化溶液b来制备溶液c。2小时后，制备第二溶液b并加到溶液c中，并让反应温育过夜。这导致聚赖氨酸的ε-伯氨基基团饱和至57％且流体动力学直径为14nm。溶液c中所含mpeg-羧基、nhss和edc的最终量分别为初始伯氨基的0.84倍摩尔、0.96倍摩尔和2.2倍摩尔当量。与本公开(参见下文)相比，此方法在溶液c中具有不同的最终比例以及不同的试剂添加时机，并因此，基于硬脂酸饱和后最终产物的性质，pl骨架上peg的确切组织必定不同。将具有57％饱和度的plpeg产物冻干，用50ml二氯甲烷萃取四次，并在加入400μl或2.88mmol三乙胺(初始伯氨基的2.6倍摩尔当量)后用2x2.5mmol(初始伯氨基的2倍摩尔当量)溶解在30ml1:2体积/体积的二甲基甲酰胺：二氯甲烷中的c18-nhs饱和。该产物使用不同于本公开(参见下文)的方法制备并与本公开的产物(在2％、5％和10％的加载量下结合到glp-1时具有0％的游离)相比产生具有不同潜能的产物(在2％的加载量下结合到glp-1时具有5％的游离，参见美国申请号11/971482的表1)。确定的是性质的差异只能由产物的组成差异来解释。
castillo等人的pharm.res.2012年第29卷(1)第306-318页使用溶解在25ml1mhepes中、ph为7.4的具有2.6mmol伯氨基的1g聚赖氨酸来制备溶液a。将甲氧基聚乙二醇羧甲基(2mmol或初始伯氨基的0.77倍摩尔当量)溶解在具有4mmolnhss(初始伯氨基的1.54倍摩尔当量)的25mlph＝4.7的10mmmes中，并且一经溶解就在搅拌下加入edc(6mmol或初始伯氨基的2.3倍摩尔当量)来制备溶液b。让活化进行20分钟，并将经活化的mpeg-cm直接加到20pl溶液中来制备溶液c。使用naoh将溶液的ph调节至7.7并在室温下搅拌2小时。取等分试样，并通过tnbs测量伯氨基基团，发现在54％的mpeg-cm饱和度下流体动力学直径为14.4nm。将粗plpeg产物冻干并溶解在～100ml二氯甲烷中，移除不溶性沉淀物并用～50ml二氯甲烷进一步萃取。合并上清液，在磁力搅拌下向合并的上清液中加入在20ml二氯甲烷中的c18-nhs(初始伯氨基的1.4倍摩尔当量)，然后加入n,n-二异丙基乙胺(dipea，初始伯氨基的2.3倍摩尔当量)并允许反应4小时。加入额外的c18-nhs(3.6mmol或初始伯氨基的1.4倍摩尔当量；总共加入的c18-nhs为初始伯氨基的2.8倍摩尔当量)并让反应过夜以获得粗的共聚物产物，其在溶剂更换为乙醇-水之后通过超滤纯化。与本公开相比，castillo等人在pharm.res.2012年第29卷(1)第306-318页中描述的此方法是不同的并具有完全不同的试剂比率。另外，与本公开的产物(在2％、5％和10％的加载量下结合到glp-1时具有0％的游离；参见表59)相比，所得经纯化的共聚物产物具有不同的结合性质或潜能(在2％的加载量下结合到glp-1时具有5％的游离)，表明本公开的产物为独特的产物组合物。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供了一种制备半无规接枝共聚物的方法，其包括以下步骤：
(a)将含有w量的游离伯氨基基团的线形多胺骨架溶解于缓冲范围覆盖ph7-8并具有高于6.5的ph的水性缓冲剂中以获得具有体积y的溶液a；
(b)通过将含有0.5-1.2xw端羧基基团的聚乙二醇(peg)保护链与1.7-7.0xw的nhss和1.5-3.6xw的edc在ph4-5.5的水性缓冲剂中混合来活化所述聚乙二醇(peg)保护链以获得最终体积为z的溶液b，使得w/(y+z)＝30-55mm，并让活化进行0-30分钟；
(c)混合溶液b与溶液a，得到溶液c；
(d)如果必要，调节溶液c的ph至高于6.5；
(e)2-3小时后向溶液c中小份小份地或一次性全部地加入0.5-1.5xw的额外edc并等待直至剩余的伯氨基为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)；
(f)当剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％时，通过添加1.0-2.5体积当量(相对于溶液c体积)的乙腈来增加溶液c的总体积以获得溶液d，并加热溶液d到40-70℃；
(g)向溶液d中加入0.5-6xw的dipea或其他叔胺；
(h)加入至少0.75xw当量在40-70℃乙腈中的c18-nhs以获得溶液e，并且在室温下搅拌该溶液至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。
在另一个方面，本发明提供了一种可通过本文所述的方法获得的半无规接枝共聚物。可将所述半无规接枝共聚物与选自胰高血糖素样肽-1和/或心房利钠肽及其衍生物的肽混合以形成包含半无规接枝共聚物和一种或多种肽的非共价络合物的组合物。
在还另一个方面，本发明提供了一种包含可通过本文所述的方法获得的半无规接枝共聚物的药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及一种制备半无规接枝共聚物的方法，其产物难以完全化学表征。本发明的产物具有以下独特且有用的性质：1)与肽结合；和2)在将该产物与肽共同给药到动物中时，与无本发明的产物的单独的肽相比，该产物将延长血液循环时间并提高肽的水平。赋予产物如此性质的方法不能通过与本公开中描述的方法显著不同的任何其他方法复制。也许是因为在本公开的方法中化学反应发生时骨架聚合物混杂的构象变化，故接枝共聚物沿着骨架的位置将在很大程度上由所述方法决定。所得产物不能以化学方式与使用其他方法产生的产物确定地区分开来而没有开发可监测过程和过程中发生的可能构象变化的新技术的挑战。这样的技术今天是不存在的。然而，产物可基于1)其与肽的优异结合和2)其在给药到动物中后赋予所述肽提高的浓度水平和延长的血液循环时间的能力的性质与最接近的相似现有技术产物区分开来。本公开还涉及通过本说明书中描述的这样的方法产生的产物。本公开中要求保护的这种方法限定产品以用来制造其的过程或方法(操作步骤)来限定产品。产品及其已知的性质不能通过迄今已知的任何其他方法产生，尽管下文描述了为此进行的众多实验和尝试。将美国申请号11/613183和美国申请号11/971482的产物的性质与本公开的那些作了比较。尽管美国申请号11/613183和美国申请号11/971482的产物与本公开的产物结合到相同的肽，但在给药到动物中时本公开的产物在结合到相同的肽和赋予所述肽提高的水平及延长的血液循环时间两方面都具有远远更加优异的性质。
具体实施方式
本发明提供了制备如本文所述的半无规接枝共聚物的方法。
例如，制备半无规接枝共聚物的方法常常包括以下步骤：(a)将含有w量的游离伯氨基基团的线形多胺骨架溶解于缓冲范围覆盖ph7-8并具有高于6.5的ph的水性缓冲剂中以获得具有体积y的溶液a；(b)通过将含有0.5-1.2xw端羧基基团的聚乙二醇(peg)保护链与1.7-7.0xw的nhss和1.5-3.6xw的edc在ph4-5.5的水性缓冲剂中混合来活化所述聚乙二醇(peg)保护链以获得最终体积为z的溶液b，使得w/(y+z)＝30-55mm，并让活化进行0-30分钟；(c)混合溶液b与溶液a，得到溶液c；(d)如果必要，调节溶液c的ph至高于6.5；(e)2-3小时后向溶液c中小份小份地或一次性全部地加入0.5-1.5xw的额外edc并等待直至剩余的伯氨基为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)；(f)当剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％时，通过添加1.0-2.5体积当量(相对于溶液c体积)的极性有机溶剂(例如，乙腈)来增加溶液c的总体积以获得溶液d，并加热溶液d到40-70℃；(g)向溶液d中加入0.5-6xw的dipea或其他叔胺；(h)加入至少0.75xw当量在40-70℃的极性有机溶剂(例如，乙腈)中的c18-nhs以获得溶液e，并且在室温下搅拌该溶液至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。
本发明的方法包括如本文所述的线形多胺骨架的反应。所述多胺骨架包含多个如本文所定义的伯胺基团。待使用于多胺骨架的反应中的不同试剂的量通过参考所述多胺骨架上的胺基团的总摩尔量来定量，如本文所述。多胺基团的该总数记为“w”并以摩尔(mol)为单位给出。
如技术人员应理解，本文所述方法中使用的试剂的量可根据多胺骨架中伯胺基团的量按比例缩放。因此，如本文所述方法中使用的各种试剂的量以如本文所定义的“w”的倍数提供，并使用记号“zxw”来表达，其中z为w应乘的因子。
本发明的方法是可规模化的。因此，技术人员应理解，w的值不受特别限制。通常，w将在约0.1μmol至1000mol的范围内，更通常，w为约10μmol至约1mol，还更通常，w为约100μmol至约100mmol。
在本发明的方法中，通常将线形多胺骨架溶解在水性缓冲剂中。线形多胺骨架优选为如本文所述的聚赖氨酸。
水性缓冲剂不受特别限制。所述缓冲剂可为任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如pipes(哌嗪-n,n′-双(2-乙磺酸))、bes((n,n-双[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸)、mops((n-吗啉基)丙磺酸)、hepes(在本文中定义)、dipso(n,n-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)、teoa(在本文中定义)等。特别合适的缓冲剂包括如下文所定义的hepes和teoa。合适的缓冲剂通常在ph7-8的范围内缓冲。缓冲剂中缓冲剂盐的典型浓度为50至250mm，例如100mm。例如，缓冲剂可为250mm的hepes或50mm的hepes或100mm的teoa。
在本发明的方法的步骤(a)中，将线形多胺骨架溶解在水性缓冲剂中以获得溶液a。溶液a的体积记为“y”。溶液a的ph可使用标准技术来调节，如加入缓冲剂盐的酸或共轭碱，至具有所需的最终ph。溶液a的最终ph通常高于ph6.5，如ph6.5至ph9，例如，约ph7至约ph8。
所述方法还包括步骤(b1)或步骤(b2)。步骤b1和步骤b2各包含步骤(b)至(d)。在步骤b1中，本发明的方法包括形成如本文所述的溶液b，将该溶液加到溶液a中以形成溶液c。在步骤b2中，将在步骤b1中用来形成溶液b的试剂直接加到溶液a中以形成溶液c，而不制备溶液b。除非另有说明，否则以下讨论既适用于步骤b1又适用于步骤b2。
在本发明的方法的步骤(b)中，保护链用edc和nhss(磺基-nhs)活化。所述保护链可为如本文所述的任何合适的聚合物。适于用作保护链的典型聚合物包括聚乙二醇、聚丙二醇和聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。保护链在链的一端处携带羧基部分。保护链可或可不在链的另一端处被烷氧基化，例如被甲氧基化或乙氧基化。优选的保护链包括甲氧基化的聚乙二醇(mpeg)。保护链的平均分子质量不受特别限制。通常，保护链的分子质量为2至20kda，或4至12kda，或更通常4至6kda。通常，如本文所述，平均分子质量使用凝胶渗透技术测定。
通常，步骤(b)中使用的保护链的量相当于0.5xw至1.2xw端羧基基团；更通常，保护链的量相当于0.5xw至1.1xw端羧基基团，还更通常0.5xw至1.0xw端羧基基团。例如，保护链的量可为0.85xw至0.95xw(例如，0.9xw)或0.75xw至0.85xw(例如，0.8xw)或0.65xw至0.75xw(例如，0.7xw)或0.55xw至0.65xw(例如，0.6xw)。最通常，保护链的量为0.8xw至1xw，如0.82xw至0.95xw，如0.83xw至0.93xw。
保护链通过与edc和nhss反应来活化。
通常，使用的edc的量为1.5xw至3.6xw，如1.5xw至3.3xw，例如，1.5xw至3.0xw。例如，步骤(b)中使用的edc的量可为2.5xw至2.9xw(例如，2.7xw)或2.3xw至2.6xw(例如，2.4xw)或2.0xw至2.3xw(例如，2.1xw)或1.7xw至2.0xw(例如，1.8xw)。最通常，使用的edc的量为2.5xw至2.9xw，如2.5xw至2.8xw。
通常，使用的nhss的量为1.7xw至7.0xw，如1.7xw至4.0xw，例如，1.7xw至3.7xw，通常1.7xw至3.4xw。例如，步骤(b)中使用的nhss的量可为2.6xw至3.2xw(例如，2.7xw)或2.3xw至2.8xw(例如，2.4xw)或2.0xw至2.5xw(例如，2.1xw)或1.7xw至2.2xw(例如，1.8xw)。最通常，使用的nhss的量为2.3xw至2.8xw，如2.5xw至2.8xw。
因此，例如，使用的保护链的量可为0.5-1.2xw，edc的量可为1.5-3.6xw，nhss的量可为1.7-7.0xw或1.7-4.0xw。更通常，使用的保护链的量可为0.5-1.1xw，edc的量可为1.5-3.3xw，nhss的量可为1.7-3.7xw。还更通常，使用的保护链的量可为0.5-1.0xw，edc的量可为1.5-3.0xw，nhss的量可为1.7-3.4xw。最通常，保护链的量可为0.8xw至1xw，edc的量可为2.5xw至2.9xw，nhss的量可为2.3xw至2.8xw。
在步骤b1中，本发明的方法的步骤(b)中保护链的活化在水性缓冲剂中进行以产生溶液b。可使用的缓冲剂不受特别限制，并可使用任何合适的缓冲剂。合适的缓冲剂通常在ph4-5.5的范围内缓冲。合适的缓冲剂体系可包括例如mes(2-(n-吗啉基)乙磺酸)。溶液的ph通常为4.0至5.5，例如，ph4.2至ph5.2，如ph4.4至ph5.0，例如，4.5至4.9。缓冲剂中缓冲剂盐的典型浓度为1至100mm，例如，10mm。例如，缓冲剂可为10mm的mes缓冲剂，ph为4.7。
水性缓冲剂溶液中经活化保护链的体积记为体积z。体积z通常使得w/(y+z)为约30mm至约55mm，例如，约40mm至约50mm，如约45mm。体积y和z通常以相同的单位给出。例如，y和z二者通常以升(l)为单位给出。技术人员应理解，术语“升”包括标准变型如μl(10–6l)、ml(10–3l)、cl(10–2l)等。
活化过程的反应时间通常少于30分钟，如0至30分钟，例如，2至25分钟，通常10至24分钟，如18至22分钟，例如，约20分钟。
在本发明的方法的步骤(c)中，将如本文所述溶液a与溶液b或与如本文所述包含在其中的试剂混合来获得溶液c。试剂常常在剧烈搅拌下以避免沉淀的方式加入。通常，采用连续搅拌来搅动溶液。连续搅拌可通过任何合适的技术实现，如通过磁力搅拌器或混合器或通过手动搅拌，例如用搅拌棒。典型的搅拌(旋转)速度为50至2000rpm(例如，200至1500rpm)。常常需要剧烈搅拌以避免沉淀(如本文中所描述)，并常常使用提高的旋转速度，如500至2000rpm(例如，1000至2000rpm)。试剂和溶液通常缓慢加入，如0至50ml/min，更通常0至20ml/min(例如，0至10ml/min)。溶液的缓慢加入可使用标准技术实现，如滴液移液管或蠕动泵。其他合适的方法是本领域技术人员已知的。固体试剂的缓慢加入通过以任何步骤加入待加入的总试剂的一部分并允许经过一定的时间(如10秒至10分钟)后再加入下一部分来实现。或者，可使用例如漏斗或本领域技术人员熟悉的其他标准技术实现固体试剂的逐步进给。
本发明的方法的步骤(d)是任选的，可存在或不存在。当步骤(d)存在时，步骤(d)对应于使用标准技术调节溶液c的ph(如加入缓冲剂盐的酸或共轭碱)至具有所需的最终ph。溶液c的最终ph通常高于ph6.5，如ph6.5至ph9，例如，约ph7至约ph8。
在本发明的步骤(e)中，向溶液c中加入额外的edc。加入额外的edc的方式不受特别限制。例如，额外的edc可一次性给药而添加，或者可分别加入edc的多个小份直至已向溶液c中加入最终所需的量的edc。因此，额外的edc可分成一份或多份加入。额外的edc通常不在形成溶液c之后即刻加到溶液c中；而是在如本文所述其形成之后通常让溶液c反应2至3小时，如约2.5小时(例如，约2小时)，然后再加入额外的edc。
通常，向溶液c中加入0.5xw至1.5xw的额外的edc，更通常加入0.5xw至1.2xw的额外的edc，还更通常0.5xw至1.1xw如0.5xw至1.0xw的额外的edc。例如，加入的额外的edc的量可为0.85xw至0.95xw(例如，0.9xw)或0.75xw至0.85xw(例如，0.8xw)或0.65xw至0.75xw(例如，0.7xw)或0.55xw至0.65xw(例如，0.6xw)。因此，溶液c中edc以摩尔为单位的总量通常为2xw至5.1xw，更通常为2xw至4.8xw，更通常为2xw至4.4xw，还更通常为2xw至4xw，如3xw至3.9xw，例如，约3.4xw至约3.8xw。
在已加入额外的edc后，在行进到任何进一步的反应步骤之前通常允许使得线形多胺骨架上剩余伯氨基基团的量变为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)可能需要的足够时间。在加入额外的edc之前或是在加入额外的edc之后不久就冷冻或冻干溶液c通常是不可取的。然而，可在已加入额外的edc并且线形多胺骨架上剩余的伯氨基基团变为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)之后将溶液c冷冻或冻干。因此，优选不在加入额外的edc之前冻干或冷冻溶液c，或者在加入额外的edc直至线形多胺骨架上剩余的伯氨基基团变为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)之后冻干或冷冻溶液c。
本发明还提供了一种方法，其包括如本文所述的步骤(a)至(e)，并还包括如本文所述的步骤(f)至(h)。
当步骤(f)存在时，步骤(f)包括从如本文所述的溶液c获得溶液d。步骤(f)可包括：
(i)冷冻和冻干其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)并在一种或多种有机溶剂中复原冻干材料以获得溶液d；或
(ii)向其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)中加入至少w的强亲核试剂(如羟胺)并通过超滤然后冻干来纯化产物，并且将产物溶解于一种或多种有机溶剂中以获得溶液d；或
(iii)通过添加1.0-2.5体积当量的一种或多种有机溶剂来增加其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)的总体积以获得溶液d，并加热溶液d到40-70℃(包括40和70℃)达至少10分钟，加入强亲核试剂，然后通过超滤和冻干来纯化产物；然后用纯plpeg产物在一种或多种有机溶剂中复原溶液d；或
(iv)通过添加1.0-2.5体积当量的一种或多种有机溶剂来增加其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)的总体积以获得溶液d，并加热溶液d到40-70℃(包括40和70℃)；
合适的有机溶剂包括乙腈、丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和1-甲基-2-吡咯烷酮，特别合适的是乙腈。作为溶剂的乙腈可被稀释在水或其他合适的溶剂中至低于100％乙腈的最终浓度，例如，常使用10％至90％的乙腈，如30％至70％的乙腈，通常50％至70％的乙腈，如60％至70％的乙腈，例如，约66％的乙腈(即，66％的乙腈/水)。在一些实施方案中，乙腈可被稀释在水中至64％的最终浓度。
当步骤(f)为根据选项(i)时，合适的有机溶剂包括乙腈、丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和1-甲基-2-吡咯烷酮，特别合适的是乙腈。复原冻干材料以获得溶液d中待使用的溶剂的量可由技术人员容易地确定。通常，冻干材料复原到其中的溶剂的量为其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)的体积的1.0至2.5体积当量。
当步骤(f)为根据选项(ii)时，所用的强亲核试剂不受特别限制，并可包括例如如本文所述的任何强亲核试剂。特别合适的强亲核试剂包括nh2oh、naor、lir、naoh或koh、nacn或kcn、naccr(乙炔化物阴离子)、nanh2、nanhr、nanr2、nai、libr、ki和nan3。在一些实施方案中，r为如本文所定义的c1-c6烷基基团或c2-c6烯基基团。当步骤(f)为根据选项(ii)时，可如本文所述进行超滤。通常，冻干材料复原到其中的乙腈的量为其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)的体积的1.0至2.5体积当量。
当步骤(f)为根据选项(iii)时，其中获得的溶液d通常被加热到40至70℃，如50至65℃，例如，55至60℃。加热通常进行10-60分钟，如10至30分钟，例如，10-20分钟。强亲核试剂不受特别限制，并可例如包括如本文所述的任何强亲核试剂，如上面针对步骤(f)的选项(ii)描述的强亲核试剂。在复原溶液d中待使用的乙腈的量可由技术人员容易地确定。通常，冻干材料复原到其中的乙腈的量为其中剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％的溶液c(即，从如本文所述的步骤(e)获得的溶液)的体积的1.0至2.5体积当量。为避免疑义，当(f)为根据选项(iii)时，术语plpeg产物指冻干步骤的产物。
当步骤(f)为根据选项(iv)时，其中获得的溶液d通常被加热到40至70℃，如50至65℃，例如，55至60℃。加热通常进行10至60分钟，如10至30分钟，例如，10至20分钟。
当步骤(g)存在时，步骤(g)包括向溶液d中加入0.5-6xw的叔胺。任何合适的叔胺均可使用，如三甲胺(tea)、n,n-二异丙基乙胺(dipea)和三苯胺。特别合适的是dipea。
当步骤(h)存在时，步骤(h)包括向步骤(g)的产物中加入0.75xw当量在40-70℃的乙腈、丙酮、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和/或1-甲基-2-吡咯烷酮中的长链脂肪酸-nhs以获得溶液e，并在室温下搅拌该溶液至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。
通常，加入0.75xw至2xw当量的长链脂肪酸-nhs，更通常加入0.8xw至1.5xw，还更通常加入0.85xw至1.2xw，如可加入约0.9xw至约1.1xw，例如，约1xw当量的长链脂肪酸-nhs。
所述长链脂肪酸-nhs可为其中羧基基团被nhs酯化了的任何合适的长链脂肪酸。合适的长链脂肪酸在本文中描述，并包括具有包含13至21个碳原子的脂族尾(tail)的那些。可被nhs酯化以产生适用于本方法中的长链脂肪酸-nhs基团的长链脂肪酸的实例包括本文中描述的那些。
将长链脂肪酸-nhs添加到在有机溶剂(如极性有机溶剂例如乙腈)中的步骤(g)产物中。有机溶剂通常在40-70℃下，如50至65℃，例如，55至60℃。让脂肪酰化(fatylation)反应进行至少2小时，例如，2至24小时，如2小时至12小时，例如，6至12小时。该反应进行直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％，从而产生粗的最终产物。
如本文所述的最终粗产物可使用标准技术纯化和分离。例如，最终产物中剩余的有机溶剂和/或过量的脂肪酸可使用溶剂如乙酸乙酯来萃取。通常，所述萃取进行不止一次，如两次或更多次。萃取出的产物可然后通过超滤来纯化。在一些实施方案中，最终粗产物可通过将有机溶剂更换成水并且使用通常至少10体积的乙醇和水更换通过超滤洗涤最终产物来纯化。最终产物可被冷冻和/或可被冻干。
在本发明的一个方面，步骤“b”中的溶液b具有0.5-1.2xw的羧基基团；1.7-6.0xw的nhss；和1.5-3.6xw的edc。
在本发明的另一个方面，步骤“b”中的溶液b具有0.5-1.2xw的羧基基团；1.7-5.0xw的nhss；和1.5-3.6xw的edc。
在本发明的另一个方面，步骤“b”中的溶液b具有0.5-1.2xw的羧基基团；1.7-4.0xw的nhss；和1.5-3.6xw的edc。
下表1示出了试剂彼此之间的典型关系，不考虑方法的规模。表1在步骤(f)、(g)和(h)中作为本发明的示例性方面分别提及乙腈、dipea和c18-nhs；然而，技术人员应理解，这些组分作为实例给出并且本发明不限于这些组分，其他适宜的组分在本文中有述。类似的备注适用于下表2至12。
表1
通常，线形多胺骨架为基于光散射或核磁共振(nmr)分析具有35-150的聚合度的聚赖氨酸。通常，线形多胺骨架为基于光散射或核磁共振(nmr)分析具有35-85的聚合度的聚赖氨酸。
通常，peg保护链为具有单个羧基端并且基于凝胶渗透色谱法(gpc)具有4-12kda的数均分子量或mn的甲氧基peg(mpeg)。通常，peg保护链为具有单个羧基端并且基于凝胶渗透色谱法(gpc)具有4-6kda的数均分子量或mn的甲氧基peg链。
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.5-1.2xw的edc；其中在步骤“f”中，当剩余的伯氨基基团达到初始伯氨基的55-40％时加入1.5-2.0体积当量的极性有机溶剂(例如，乙腈)。下表2示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表2
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.5-1.1xw的羧基基团；1.7-3.7xw的nhss；和1.5-3.3xw的edc；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.5-1.1xw的edc。下表3示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表3
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.5-1.0xw的羧基基团；1.7-3.4xw的nhss；1.5-3.0xw的edc；其中让活化进行5-25分钟；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.5-1.0xw的额外的edc。下表4示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表4
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.85-0.95xw的羧基基团；2.6-3.2xw的nhss；2.5-2.9xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.85-0.95xw的edc；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“g”中，向溶液d中加入1-3xw的dipea或其他叔胺。下表5示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表5
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.9xw的羧基基团；2.7xw的nhss；2.7xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.9xw的额外的edc。下表6示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表6
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.75-0.85xw的羧基基团、2.3-2.8xw的nhss和2.3-2.6xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.75-0.85xw的edc；其中在步骤“g”中，向溶液d中加入1-3xw的dipea或其他叔胺。下表7示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表7
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.8xw的羧基基团；2.4xw的nhss；2.4xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.8xw的额外的edc；其中在步骤“e”中，加入至少0.75xw的c18-nhs。下表8示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表8
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.65-0.75xw的羧基基团、2.0-2.5xw的nhss、2.0-2.3xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.65-0.75xw的edc；其中在步骤“g”中，向溶液d中加入1-3xw的dipea或其他叔胺。下表9示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表9
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.7xw的羧基基团；2.1xw的nhss；2.1xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.7xw的额外的edc；其中在步骤“g”中，向溶液d中加入1-3xw的dipea或其他叔胺。下表10示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表10
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.55-0.65xw的羧基基团、1.7-2.2xw的nhss、1.7-2.0xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤e中，向溶液c中加入0.55-0.65xw的edc；其中在步骤“g”中，向溶液d中加入1-3xw的dipea或其他叔胺。下表11示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表11
在本发明的另一个方面，前述方法是这样的，其中步骤“b”中的溶液b具有0.6xw的羧基基团；1.8xw的nhss；1.8xw的edc；其中溶液b的ph为4.4-5.0；其中让活化进行18-22分钟；其中调节溶液c的ph至7-8；其中在步骤“e”中，向溶液c中加入0.6xw的额外的edc；其中在步骤“e”中，加入至少0.75xw的c18-nhs。下表12示出了刚刚描述的方法中试剂彼此之间的关系，不考虑方法的规模。
表12
如本文中所述，本发明在上述方法的步骤(f)、(g)和(h)内包括替代方案，其中：(f)包括在剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％时冷冻和冻干溶液c并用不可与水混溶的有机溶剂如二氯甲烷或可与水混溶和不可与水混溶的有机溶剂的混合物复原所述冻干材料来获得溶液d；(g)包括向溶液d中加入0.5-6xw的dipea或其他叔胺；(h)包括直接加入至少0.75xw当量的c18-nhs或加入至少0.75xw当量在适宜的溶剂如二氯甲烷中的c18-nhs以获得溶液e，并且在室温下搅拌溶液至少2小时直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。
其中溶液e中的最终产物在有机溶剂中的上述方法可还包括步骤(i)：将粗产物中的有机溶剂更换成水并使用乙醇和水的至少10次更换通过超滤洗涤产物。
如本文中所述，本发明在上述方法的步骤(f)、(g)和(h)内包括进一步的替代方案，其中：(f)包括向溶液c中加入强亲核试剂(初始伯氨基的至少1xw当量)如羟胺并通过如下所述的超滤、然后冻干来纯化产物并且溶解于极性有机溶剂(例如，乙腈)中来获得溶液d；(g)包括向溶液d中加入0.5-6xw的dipea或其他叔胺；(h)包括加入至少0.75xw当量的c18-nhs以获得溶液e，并且在室温下搅拌溶液至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。
其中溶液e中的最终产物在水和可与水混溶的有机溶剂的混合物中的上述方法可还包括步骤(i)：使用极性有机溶剂(例如，乙酸乙酯)从溶液e中粗的最终产物中萃取可与水混溶的有机溶剂和过量的脂肪酸并弃去极性有机溶剂(例如，乙酸乙酯)层，重复水层的萃取至少一次，然后使用乙醇和水的至少10次更换通过超滤洗涤产物。
定义
为方便起见，在进一步描述本公开之前，将说明书、实施例和附随的权利要求书中采用的某些术语汇集于此。这些定义应根据本公开的剩余部分来解读并且应为本领域普通技术人员所理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。除非另有指出，否则舍入数字的一般数学规则适用于本说明书中的所有数字，例外的是非多分散分子如h2o、nhss、edc等的分子量。聚合物为多分散分子。任何时候在给出数字时，该数字的最后一位应理解为是置信界限并且是将数字范围舍入到给定数字的最接近的最后一位的结果。例如，“5kda聚合物”指4.5kda至5.5kda之间的范围，因为4.51-5.49kda舍入到最接近的千位为5kda。另一个实例为2.1mmol，其为2.05至2.15mmol之间的范围。另一个实例为5.0kda聚合物，其为4.95至5.05kda之间的范围。
冠词“一”用来指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一保护链”指一个保护链或多于一个保护链。
术语“anp”为心房利钠肽(基于本领域中的已知惯例的序列：seqidno：1-slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry，具有肽内二硫键)。就本说明书的目的而言，该肽用来区分通过各种方法产生的接枝共聚物之间的差异。
术语“bnp”为b型利钠肽(基于本领域中的已知惯例的序列：seqidno：2-spkmvqgsgcfgrkmdrissssglgckvlrrh，具有肽内二硫键)。就本说明书的目的而言，该肽用来区分通过各种方法产生的接枝共聚物之间的差异。
术语“c12-nhs”、“c13-nhs”、“c14-nhs”、“c15-nhs”、“c16-nhs”、“c17-nhs”、“c18-nhs”、“c19-nhs”、“c20-nhs”、“c21-nhs”等指具有12至21个碳的脂族尾的脂肪酸，其中羧基基团被nhs酯化，参见下面的“脂肪酸”。除非另有指出，否则c12指月桂酸，c14指肉豆蔻酸，c16指棕榈酸，c18指硬脂酸，c20指花生酸。
术语“衍生物”或“类似物”在本文中用来指其核心结构与母体化合物相同或紧密类似、但具有化学或物理改性(如不同或另外的基团)的化合物。该术语还包括与母体肽具有至少80％的序列同一性(即，氨基酸取代少于20％)的肽。该术语还包括与母体肽相比有另外的基团如脂肪酸和/或另外的氨基酸连接到其的肽。该术语还包括与母体聚合物相比有另外的一个或多个基团连接到其的聚合物，如在保护性基团、烷氧基基团的情况下。该术语还包括与母体保护链相比有另外的一个或多个甲氧基或乙氧基基团连接到其的甲氧基化或乙氧基化的保护链。
术语“dipea”指n,n-二异丙基乙胺、或hünig碱、或diea，为有机化合物和胺。其在有机化学中用作碱。因为氮原子被两个异丙基基团和乙基基团所屏蔽，故仅质子足够小以容易地配合。类似于2,2,6,6-四甲基哌啶，此化合物是一种良好的碱但差的亲核试剂，这使得其是有用的有机试剂。
术语“edc”指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺hcl，其也可称为edac或edci并具有分子量：191.70da。此碳二亚胺试剂含有由式n＝c＝n组成的官能团，此官能团对于羧基基团的活化是必要的；此官能团对于活化保护链上的羧基基团和脂肪酸很重要。在偶联反应的过程中，可通过用n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基磺基琥珀酰亚胺形成n-羟基琥珀酰亚胺酯来使经活化的羧基基团o-酰基异脲-中间体稳定化。
术语“脂肪酸”为具有长的脂族尾或链的羧酸，其是饱和或不饱和的。大多数天然存在的脂肪酸具有从4到28的偶数个数碳原子的尾。当它们不连接到其他分子时，它们被称为“游离”脂肪酸。具有碳-碳双键的脂肪酸被称为不饱和的，无双键的那些被称为饱和的。脂肪酸链有不同的长度，常常被分为短至非常长。短链脂肪酸为脂族尾少于六个碳的脂肪酸(如丁酸)。中等链脂肪酸为脂族尾具有6至12个碳的脂肪酸(也称c6-c12脂肪酸，其中的数字指碳数)。长链脂肪酸为脂族尾具有13至21个碳的脂肪酸(也称c13-c21脂肪酸)。非常长链脂肪酸为脂族尾长于22个碳的脂肪酸(也称≥c22脂肪酸)。就本说明书的目的而言，术语“脂肪酸”涵盖所有上述脂肪酸，并且每一种脂肪酸可具有多于一个通用名称。饱和脂肪酸的实例包括辛酸(ch3(ch2)6cooh)、癸酸(ch3(ch2)8cooh)、月桂酸(ch3(ch2)10cooh)、肉豆蔻酸(ch3(ch2)12cooh)、棕榈酸(ch3(ch2)14cooh)、硬脂酸(ch3(ch2)16cooh)、花生酸(ch3(ch2)18cooh)、山嵛酸(ch3(ch2)20cooh)、二十四烷酸(ch3(ch2)22cooh)、蜡酸(ch3(ch2)24cooh)。不饱和脂肪酸的实例包括肉豆蔻脑酸(ch3(ch2)3ch＝ch(ch2)7cooh)、棕榈油酸(ch3(ch2)5ch＝ch(ch2)7cooh)、十六碳烯酸(ch3(ch2)8ch＝ch(ch2)4cooh)、油酸(ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)7cooh)、反油酸(ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)7cooh)、异油酸(ch3(ch2)5ch＝ch(ch2)9cooh)、亚油酸(ch3(ch2)4ch＝chch2ch＝ch(ch2)7cooh)、反亚油酸(ch3(ch2)4ch＝chch2ch＝ch(ch2)7cooh)、α-亚麻酸(ch3ch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝ch(ch2)7cooh)、花生四烯酸
(ch3(ch2)4ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝ch(ch2)3cooh)、二十碳五烯酸(ch3ch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝ch(ch2)3cooh)、芥酸(ch3(ch2)7ch＝ch(ch2)11cooh)、二十二碳六烯酸(ch3ch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝chch2ch＝ch(ch2)2cooh)。
术语“脂肪酸-nhs”指其中羧基基团被nhs酯化的脂肪酸。术语“长链脂肪酸-nhs”指其中羧基基团被nhs酯化的长链脂肪酸或具有13至21个碳的脂族尾的脂肪酸(也称c13-c21脂肪酸，其中的数字指碳数)。类似的命名适用于“短长链脂肪酸-nhs”，其中所述脂肪酸具有6至12个碳的脂族尾。再一次地，类似的命名适用于“非常长链脂肪酸-nhs”，其中所述脂肪酸具有22个碳或更多碳的脂族尾。
术语“脂肪酰化”指向多胺骨架加合脂肪酸的步骤或化学过程。
术语“glp-1”指胰高血糖素样肽-1(序列seqidno：3-haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrg)。就本说明书的目的而言，该肽用来区分通过各种方法产生的接枝共聚物之间的差异。
术语“hepes”指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸并为两性离子有机化合物缓冲剂，在ph6.5和8.5之间具有高缓冲能力。
术语“线形多胺骨架”指具有重复的伯氨基基团的直链非蛋白质均聚物或杂聚物并可以是天然或合成来源的。非蛋白质意味着其不是由活生物体产生的具有与细胞活性相关的三维构象的蛋白质。在本说明书中，“线形多胺骨架”与“线形聚合物骨架”可互换地使用并且为溶液a的组分。优选的直“线形多胺骨架”为聚赖氨酸并且在本说明书中还被称为pl。“线形多胺骨架”可以是可具有d-或l-手性或二者的其他聚氨基酸，其中氨基酸的侧基(称为r-基团)含有伯胺。通常，基于光散射或核磁共振分析，聚合物骨架可具有5-95kda的数均分子量(mn)或22-450的聚合度(dpn)。基于光散射或核磁共振分析，优选的聚合物骨架具有7-32kda的mn或35-150的dpn。基于光散射或核磁共振分析，最优选的聚合物骨架具有7-18kda的mn或35-85的dpn。根据粘度测量，取决于使用的标准，对于相同的材料，上面给出的dpn可以是两倍高。也可使用具有重复的伯氨基基团的其他聚合物骨架，如碳水化合物聚合物或其他合成聚合物。聚合物骨架提供可以连接保护链和脂肪酸的多个伯氨基基团。
术语“％加载量”定义为结合特性，其中肽与半无规接枝共聚物产物在生理或接近生理的缓冲液中以限定的肽：共聚物重量比混合，例如，10％的加载量由1重量份肽和10重量份共聚物组成。特定的加载量下游离肽的百分数用来区分通过各种方法产生的接枝共聚物之间的差异。
如本文所用，术语“保护性侧链”指具有沿着链广泛结合或吸取(imbibe)水的能力并且是溶液b的组分的亲水性聚合物分子。结合或吸取不同于吸收，后者指摄入到大分子结构如海绵、树脂或凝胶的空间或通道中。由于这种与水分子的广泛结合，故保护链具有高水溶性并且其还将增加与其相连的其他聚合物的水溶性。保护性侧链不具有显著的电荷量并且通常是非免疫原性的。这也意味着保护链将为否则水溶性较低的组合物提供亲水性。术语“保护链”和“保护性侧链”在本说明书中可互换地使用。本组合物的保护链通常包括也称为聚乙二醇的聚氧乙烯二醇，其可或可不在一端处被烷氧基化(如甲氧基或乙氧基)但在另一端处以羧基部分终止。保护链也可以是或作为替代方案是聚丙二醇或聚乙二醇-聚丙二醇共聚物，其可或可不在一端处被烷氧基化(如甲氧基或乙氧基)但均以羧基部分终止。优选的保护链为具有羧基端、并且基于用相同或相似材料标准化的凝胶渗透色谱法的尺寸在2至20kda的范围内的线形甲氧基化聚乙二醇(mpeg或甲氧基peg)。更优选的尺寸为4-12kda，最优选的尺寸为4-6kda。本组合物的保护链也包括不带电荷的多糖及其衍生物如乙氧基化或甲氧基化的多糖。在此上下文中，不带电荷是指链的主体不具有正或负电荷。
术语“mpeg-cm”指甲氧基聚乙二醇-羧基，并且是在一端处具有甲氧基基团而在另一端处具有羧基基团的线形peg。此为peg的非预活化形式。
术语“mpeg-scm”指甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，并且是在一端处具有甲氧基基团而在另一端处具有nhs连接羰基基团的线形peg的nhs预活化形式。
术语“nhs”指n-羟基琥珀酰亚胺并具有分子量：115.10da。
术语“nhss”指n-羟基磺基琥珀酰亚胺并具有分子量：217.14da。
术语“不可与水混溶的有机溶剂”指有机溶剂以低于50重量/重量％地与水混合或溶解于水中。例如：二氯乙烷、苯、乙酸丁酯、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、二乙基醚、二异丙基醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙基苯、甲基乙基酮、甲基丁基醚、正-丁醇、戊烷、正-己烷、庚烷、甲苯、四氯乙烯和二甲苯。
术语“peg化”指向多胺骨架加合peg或其衍生物的步骤或化学过程。
术语“伯胺”指键合到一个烷基或芳环和2个氢原子的氮。换句话讲，其为其中三个氢位点中之一被有机取代基所代替的氮。就本说明书的目的而言，重要的伯胺为沿着线形多胺骨架的重复伯胺部分。就聚赖氨酸而言，其为沿着聚赖氨酸聚合物的赖氨酸ε-伯氨基基团。
术语“sol”指溶液并且就本说明书的目的而言指命名为sola至sole的各种液体溶液a至e。
术语“强亲核试剂”指这样的试剂，其易于去质子化而给出具有完全负电荷的阴离子，易于被钠、锂或钾抗衡离子的存在所识别，并参与sn2型取代。强亲核试剂的实例包括nh2oh、naoch3(任何naor)、lich3(任何lir)、naoh或koh、nacn或kcn、naccr(乙炔化物阴离子)、nanh2、nanhr、nanr2、nai、libr、ki和nan3。可使用强亲核试剂来停止本公开的solc中的反应以在特定阶段下中断方法，以便纯化和/或评价中间体。
术语“tea”指三乙胺，为具有式n(ch2ch3)3的化学化合物，通常简写为et3n。其还简写为tea，然而该简写必须小心使用以避免与三乙醇胺或四乙基铵混淆，对于后两者，tea也是常见的简写。像二异丙基乙胺(hünig碱)一样，有机合成中常常会遇到三乙胺。
术语“teoa”指三乙醇胺或2,2',2"-三羟基-三乙胺或三(2-羟乙基)胺，也简写为tea，为既是叔胺又是三醇的粘稠有机化合物。
术语“叔胺”指其中三个氢位点被三个有机取代基所代替的氮。实例包括三甲胺(tea)、n,n-二异丙基乙胺(dipea)和三苯胺。
术语“tnbs”指三硝基苯磺酸(c6h3n3o9s)，其为硝基-芳基氧化酸。就本说明书的目的而言，根据spadaro,a.c.等人(aconvenientmanualtrinitrobenzenesulfonicacidmethodformonitoringaminoacidsandpeptidesinchromatographiccolumneffluents(一种方便的监测色谱柱流出物中的氨基酸和肽的手动三硝基苯磺酸方法))(anal.biochem.,1979年,第96卷(2):第317-21页)使用采用tnbs的分析来测量溶液a、c和e中的伯胺。针对伯胺的tnbs分析的使用是为了确定溶液c的伯氨基基团饱和度，以便反应可转到下一步。
术语“可与水混溶的有机溶剂”指有机溶剂以50重量/重量％或更高地与水混合或溶解于水中，例如，乙酸、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氧六环、乙醇、异丙醇、正-丙醇、甲醇和四氢呋喃。
术语“w”指溶液a中的起始多胺骨架中存在的伯氨基基团或方法的溶液a中的初始氨基基团的总摩尔数。该术语的使用允许所述方法扩展至工业规模。为清楚起见，在本说明书中，关键试剂以“w”的分数或倍数表达。
术语“xw”指w的倍数并且通常在前面加上将乘以w的数字，以给出所需的关键试剂的具体值或量。例如，如果w等于2.6mmol并且保护链具有0.9xw的羧基当量，则该量将为0.9x2.6mmol或2.34mmol。
如本文所用，c1至c6烷基基团为含1至6个碳原子的直链或支链烷基基团。通常，c1至c6烷基基团为c1至c4烷基基团，其为含1至4个碳原子的直链或支链烷基基团。c1至c4烷基基团常常为c1至c3烷基基团。c1至c6烷基基团的实例包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、仲-丁基、叔-丁基、戊基和己基。c1至c3烷基基团通常为c1至c2烷基基团。c1至c2烷基基团为甲基或乙基，通常是甲基。为避免疑义，当存在两个烷基基团时，这两个烷基基团可相同或不同。
如本文所用，c2至c6烯基基团为含有2至6个碳原子并具有一个或多个(例如一个或两个)双键的直链或支链烯基基团。通常，c2至c6烯基基团为c2至c4烯基基团，例如，c2至c3烯基基团。c2至c6烯基基团的实例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基。为避免疑义，当存在两个烯基基团时，这两个烯基基团可相同或不同。
举例来说，在本发明的方法中，线形多胺骨架常常为基于光散射或核磁共振分析具有22-450、更通常35-150、还更通常35-85的聚合度的聚赖氨酸；保护链常常为具有单个羧基端、基于凝胶渗透色谱法具有2-20kda、更通常4-12kda、还更通常4-6kda的数均分子量或mn的甲氧基peg链；长链脂肪酸-nhs常常为c18-nhs。
以下实施例将示意本发明。然而，它们不以任何方式限制本发明。在这一点上，重要的是理解实施例部分中用到的特定分析仅设计以提供肽的结合能力的指示。有许多分析可用来测定这样的能力，因此任何一个特定分析中的消极结果不是决定性的。
实施例
本文中的实施例描述了产生半无规接枝共聚物产物的合成方法，所述产物是称为心房利钠肽(anp；基于本领域中的已知惯例的序列：seqidno：1-slrrsscfggrmdrigaqsglgcnsfry，具有肽内二硫键)的模型肽的高效结合剂。术语“高效结合剂”定义为当将肽与半无规接枝共聚物产物在生理或接近生理的缓冲液中以1：10(肽：共聚物，重量：重量)的重量比混合时，使得游离肽的量(如下文所述评价)将低于12％的结合特性。在本公开的披露之前，这样的结合剂是不存在的。
应指出，对于任何给定的共聚物结合剂，随着肽对共聚物的重量比增大，游离肽的量将增加，并且反过来，随着肽对共聚物的重量比减小，游离肽的量将减少。这是由于作为本公开的主题的共聚物是一种可逆结合剂，其具有包括容量(capacity)在内的性质。如果容量因较高的加载量而为肽所饱和，则任何额外的肽将不会结合。由于作为本公开的主题的共聚物的基团的结构复杂性，故区分组成差异的唯一途径是比较它们的可测量性质。
概述
试剂
除非另有指出，否则试剂在使用时不经进一步纯化。另外，使用的试剂是商购可得的并且它们的合成是本领域熟知的。
dpn55(根据nmr)、mm11,500(根据nmr)、pdi1.04(根据gpc)的聚-l-赖氨酸氢溴酸盐(pl)来自alamandapolymers(huntsville,al)；mw5kda的甲氧基聚乙二醇-羧基(mpeg-cm)来自laysanbioinc(arab,al)；mw217da的n-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(nhss)来自chempep(wellington,fl)；mw5kda的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mpeg-scm)来自jenkemtechnologyusa(plano,tx)；mw192da的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)来自pierce(rockford,il)。mw284da的硬脂酸(c18)来自alfaaesar(wardhillma)；mw115da的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)来自acrosorganics(pittsburgh,pa)；mw206da的n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)来自acrosorganics(pittsburgh,pa)。
通用技术
使用改自lapidot等人[lapidot,y.,rappoport,s.和wolman,y.(1967)j.lipidres.,8,142]的方法来制备mw382da的硬脂酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(c18-nhs)。在230ml乙酸乙酯中用nhs(mw115da,6.9g,60mmol)和dcc(mw206da,9.6ml,12.4g,60mmol)来活化硬脂酸(mw284da,17gm,60mmol)并温育过夜。通过过滤移除脲沉淀物。然后干燥滤液并使用乙醇重结晶。通过过滤收集产物c18-nhs，在真空下干燥，并冷冻脱水储存。
在去离子蒸馏水中制备缓冲液。反应ph的调节使用ph计进行。
通过使用tnbs分析(sparado等人(1979)anal.biochem.96,317))分析游离伯氨基基团的消耗来测量pl被peg和c18改性的程度。使用微板读数器测量样品的可见光吸光度。
产物经100kda或50kda的截留膜通过超滤洗涤。超滤使用安装在quixstand系统(ge-amershambiosciencescorp,westborough,ma)上的膜盒(ufp-100-e或ufp-50-e，ge-amershambiosciencescorp,westborough,ma)来进行。典型的洗涤条件使用10体积当量(相对于被洗涤的溶液体积)的90％乙醇、10-15体积的80％乙醇和10体积的水。然后将产物过滤灭菌并冻干。
使用经用球状蛋白标准品校准的tosohg4000wxlhplc柱，通过凝胶渗透色谱法评估接枝共聚物的流体动力学直径。通过将共聚物与相应的肽在磷酸盐缓冲盐水中于ph7.35下或在100mmhepes缓冲液中于ph7.35下温育2小时、然后通过100kda分子量截留膜过滤器(再生纤维素过滤器，ym-100，来自millipore,bedford,ma)离心过滤来评价各种方法的接枝共聚物产物与肽的结合。在这两种缓冲液之间未观察到肽与接枝共聚物产物结合的差异。
含有游离(未结合)肽的滤液通过在220nm下监测的反相hplc(synergi2.5ummax,0.4×2cm)进行定量，在1.5ml/min的流速下运行，使用如下梯度：0％的b1分钟和25-50％的b1-5分钟，其中a为含0.1％tfa的5％乙腈，b为含0.1％tfa的100％乙腈。取来自含有肽而无共聚物的对照管的滤液作为可用于结合的肽的总量。结合的肽的量可通过从接收相同浓度的肽但无接枝共聚物的相应对照减去通过了过滤器的游离肽的浓度来计算。在各种比率下测试结合情况，使2、5和10％加载量代表1：50、1：20和1：10的肽重量对共聚物重量比率。
方法
除非另有指出，否则接枝共聚物的合成通过制备一系列溶液(sola、solb、solc、sold和sole)并合并它们或通过在化学方法的peg化和脂肪酰化步骤过程中向它们中加入试剂来进行。sola含有溶解在缓冲液(250或50mmhepes；或100mmteoa)中的pl，solb含有经用nhss和edc在mes缓冲液(10mm,ph4.7)中在室温下活化的mpeg-cm。solc为其中发生pl的peg化的反应的溶液，并且通过合并sola和solb或通过直接向sola中加入试剂(nhss、edc或peg-scm)(从而预活化时间为零分钟且无solb)来在室温下制备。无溶液b因0分钟的预活化而不同于有溶液b。当如通过tnbs所测量发现伯氨基基团为41-62％时，通过向溶液c中加入有机溶剂(乙腈、丙酮或二氯甲烷)并加热到55-60℃来制备sold。sole为其中发生脂肪酰化的反应溶液，并且通过向sold中加入c18-nhs和dipea来制备。让sole冷却至室温并允许搅拌两小时至过夜。向sole中加入大约等于sole的体积的体积的水并用2倍体积的极性有机溶剂(例如，乙酸乙酯)萃取溶液2-3次。然后用去离子蒸馏水稀释含有产物的水相并通过上述超滤来洗涤。在一些情况下，如在peg-scm、edc或nhss被添加到sola来产生solc的情况下，化学方法不需要solb。在所有情况下，试剂的当量数相对于pl的起始伯氨基含量报告。
实施例1(样品1-a、1-b和1-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物1-a、1-b和1-c(5kdampeg-cm；20kdapl；氨基基团用peg达到59、53和54％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2和3小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。下面的表提供了产物的性质和合成过程中使用的每一试剂的比率。
表13：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。因此，该方法所用试剂的比率提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表14：用于实施例1中样品1-a的比率
表15：用于实施例1中样品1-b的比率
表16：用于实施例1中样品1-c的比率
实施例2(样品2-a、2-b和2-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物2-a、2-b和2-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到45、44和44％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2和3小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。
表17：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。因此，该方法所用试剂的比率提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表18：用于实施例2中样品2-a的比率
表19：用于实施例2中样品2-b的比率
表20：用于实施例2中样品2-c的比率
实施例3(样品3-a、3-b和3-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物3-a、3-b和3-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到54、60和56％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2和3小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。
表21：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。因此，该方法所用试剂的比率提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表22：用于实施例3中样品3-a的比率
表23：用于实施例3中样品3-b的比率
表24：用于实施例3中样品3-c的比率
实施例4(样品4-a、4-b和4-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应而不预活化来合成接枝共聚物4-a、4-b和4-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到53、51和47％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。不制备solb；向sola中直接加入试剂。
表25：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。因此，该方法所用的试剂比率和添加方法提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表26：用于实施例4中样品4-a的比率
表27：用于实施例4中样品4-b的比率
表28：用于实施例4中样品4-c的比率
实施例5(样品5-a、5-b和5-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应而不预活化来合成接枝共聚物5-a、5-b和5-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到57、61和55％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。不制备solb；向sola中直接加入试剂。
表29：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。因此，该方法所用的试剂比率和添加方法提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表30：用于实施例5中样品5-a的比率
表31：用于实施例5中样品5-b的比率
表32：用于实施例5中样品5-c的比率
实施例6(样品6-a、6-b和6-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应而不预活化来合成接枝共聚物6-a、6-b和6-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到99、98和97％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。不制备solb；向sola中直接加入试剂。
表33：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。实验6的样品所用的试剂比率与产生可接受的结合特性的接枝共聚物批次(参见实验7、8和9的样品)所用的试剂比率相似，然而，仅6c接近于满足anp结合标准。另外，％peg饱和度因沉淀而难以控制并达到远高于通用程序中描述的62％范围；如果pl沉淀，则表观饱和度可能是沉淀的假象(artifact)，因为pl的氨基基团不会通过tnbs检测出来。推测solb的制备(peg-scm用nhss和edc在mes缓冲液中于ph4.0至5.5下的预活化)对于可重复地制备具有合适的结合特性的接枝共聚物是必要的。因此，该方法提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物，但据信如果通过在剧烈搅拌条件下向溶液a中加入粉末试剂而避免了导致沉淀的条件(不同于失败的实施例6(样品6-a、6-b和6-c)的方法)，则可产生可接受的产物。
表34：用于实施例6中样品6-a的比率
表35：用于实施例6中样品6-b的比率
表36：用于实施例6中的样品6-c的比率
实施例7(样品7-a、7-b和7-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物7-a、7-b和7-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到58、55和55％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。
表37：所合成材料的性质
*相应的方法产生为具有所需性质的高效结合剂的产物。
所合成的接枝共聚物产生了在10％的肽加载量下游离anp为13％或更少的可接受量的结合结果。因此，本公开的方法所用的试剂比率提供了可接受的产物。
表38：用于实施例7中样品7-a的比率
表39：用于实施例7中样品7-b的比率
表40：用于实施例7中样品7-c的比率
实施例8(样品8-a、8-b和8-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物8-a、8-b和8-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到59、51和41％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。
表41：所合成材料的性质
*相应的方法产生为具有所需性质的高效结合剂的产物。
所合成的接枝共聚物产生了在10％的肽加载量下游离anp为13％或更少的可接受量的结合结果。因此，本公开的方法所用的试剂比率提供了可接受的产物。
表42：用于实施例8中样品8-a的比率
表43：用于实施例8中样品8-b的比率
表44：用于实施例8中样品8-c的比率
实施例9(样品9-a、9-b、9-c、9-d、9-e和9-f)
使用mpeg-cm进行peg化反应来合成接枝共聚物9-a、9-b、9-c、9-d、9-e和9-f(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到62、58、55、53、56和56％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。
表45：所合成材料的性质
*相应的方法产生为具有所需性质的高效结合剂的产物。
所合成的接枝共聚物产生了在10％的肽加载量下游离anp为13％或更少的可接受量的结合结果。因此，本公开的方法所用的试剂比率提供了可接受的产物。
表46：用于实施例9中样品9-a的比率
表47：用于实施例9中样品9-b的比率
表48：用于实施例9中样品9-c的比率
表49：用于实施例9中样品9-d的比率(针对8g产量的规模)
表50：用于实施例9中样品9-e的比率(针对8克产量的规模)
表51：用于实施例9中样品9-f的比率(针对42克产量的规模)
实施例10(样品10-a、10-b和10-c)
使用mpeg-cm进行peg化反应并在peg化之后进行萃取来合成接枝共聚物10-a、10-b和10-c(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到49、56和56％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。2、3和4小时后，向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。在peg化反应后，用极性有机溶剂(例如，乙酸乙酯)萃取solc并且从萃取的水相制备sold。
表52：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的不良结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。所合成的接枝共聚物的不良结合特性可归因于用极性有机溶剂(例如，乙酸乙酯)萃取solc而中断该方法。通过与采用相同试剂比率产生具有中度结合特性的接枝共聚物的相似方法(参见实验1、2和3的样品)进行比较，该假设得到了支持。因此，该方法所用试剂比率和solc的萃取对该方法的中断提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表53：用于实施例10中样品10-a的比率
表54：用于实施例10中样品10-b的比率
表55：用于实施例10中样品10-c的比率
实施例11(样品11-a)
使用mpeg-cm进行peg化反应并在脂肪酰化之前停止该方法来合成接枝共聚物11-a(5kdampeg-cm；20kdapl；伯氨基基团用peg达到57％饱和，剩余的伯氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。让solb的活化进行20分钟。在1.75小时的反应时间处将solc置于冰上。在2小时处，让solc返回到室温并向solc中加入额外的edc(比率表中报告了各批次的总edc)。solc继续反应直至在3.75小时的总时间处伯氨基基团达到57％的饱和度。将solc冷冻并冻干。通过将来自solc的冻干材料溶解于二氯甲烷中来制备sold，并且不加热sold。
表56：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的中度结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。所合成的接枝共聚物的中度结合特性可归因于因solc的冻干而中断该方法。通过与采用相同试剂比率产生具有可接受的结合特性的接枝共聚物的相似方法(参见实验7、8和9的样品)进行比较，该假设得到了支持；注意，c18-nhs和dipea的比率不与本公开的方法相似，但该方法的一部分具有全部所列批次满足的最低要求。因此，通过solc的冻干停止该方法并且不加热sold提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。
表57：用于实施例11中样品11-a的比率
实施例12(样品12-a，peg-scm)
使用mpeg-scm进行peg化反应来合成接枝共聚物12-a(5kdampeg-scm；20kdapl；氨基基团用peg达到53％饱和，剩余的氨基基团用硬脂酸改性)。合成如概述部分中所述进行，另有指出除外。将pl溶解在50mmph7.7的三乙醇胺中。不使用solb，因为peg-scm被直接加到sola中。peg化后冷冻solc。将c18-nhs溶解于丙酮中。
表58：所合成材料的性质
*相应的方法未能提供具有所需性质的产物。
在10％的肽加载量下，所合成的接枝共聚物的不良结合不在游离anp为13％或更少的可接受量范围内。所合成的接枝共聚物异常地差的结合特性可归因于peg-scm(5kdapeg的nhs酯)试剂的使用而不是用nhss和edc预活化peg-cm。通过与采用相似的peg饱和水平产生接枝共聚物并导致具有中度到可接受的结合特性的接枝共聚物的不同方法(参见样品1-b、4-a和9-c)进行比较，该假设得到了支持。潜在地，peg-scm将在与peg-cm活化为nhss酯的不同速率下酰化pl并影响pl上的peg组织，这最终将影响anp的结合。因此，使用peg-scm作为用于peg化的试剂的方法提供了比通过本公开的方法产生的产物差的产物。对于使用mpeg-cm的nhs活化合成的接枝共聚物，未观察到anp结合。
pgc在glp-1和bnp肽结合中的评价
还评价了使用本公开的方法合成的pgc与glp-1和bnp的结合，参见下表。除与anp的可接受结合外，所述pgc还提供了与glp-1和bnp二者的可接受结合，分别地，在10％加载量下游离肽为0-6％，在5％和2％加载量下，游离肽为0％。该数据支持本公开的方法不同于并优于先前出版物中描述的方法(castillo等人：在2％加载量下对glp-1显示出5％的游离)。另外，我们的数据支持本公开的方法不同于并优于美国申请号11/613183和美国申请号11/971482专利申请中描述的方法(在10％加载量下对glp-1显示出33％的游离)。
表59：所合成材料的结合性质
两步法(edc淬灭、pl-peg分离)
接枝共聚物的合成可通过改变方法完成，其中停止peg化反应并可在脂肪酰化反应之前纯化所得pl-peg产物。此方法可由制备一系列溶液(sola、solb、solc、sold和sole)并且合并它们或通过在化学方法的peg化和脂肪酰化步骤过程中向它们中加入试剂组成。sola含有溶解在缓冲液(hepes或teoa)中的pl，solb含有经用nhss和edc在mes缓冲液中活化的mpeg-cm。solc是其中发生pl的peg化的反应溶液，并且通过合并sola和solb或通过直接向sola中加入试剂(nhss、edc或peg-scm)(从而预活化时间为零分钟或无solb)来制备。在一些情况下，化学方法不需要solb，因为在这样的情况下，peg-scm被加到sola来产生solc。通过向溶液c中加入有机溶剂(乙腈、丙酮或二氯甲烷)并加热到55-60℃来制备sold。然后可向sold中加入强亲核试剂来淬灭剩余的edc。sold中的乙腈可通过水/有机萃取来移除(如在脂肪酰化后移除乙腈的通用程序中那样)。含有pl-peg产物的水相可然后用水稀释并通过超滤纯化。可然后使用经纯化的pl-peg产物、通过将该产物溶解在66％乙腈中并加热至55-60℃来制备溶液e，其后加入c18-nhs和dipea。
在淬灭或停止peg化反应之前加热sold对于保持与本公开的方法相似的反应速率和产生具有可接受的结合特性的产物是必不可少的。用来合成实施例10和11中的pgc(参见样品10-a、10-b、10-c和11-a)的方法示意了当在加入有机溶剂和加热之前停止peg化反应时的不良结果；这些方法产生不具有可接受的结合的pgc。因此，为了使pgc合成的两步程序成功，在淬灭peg化反应之前加热sold必须是所述方法的一部分。
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本领域技术人员应认识或能够使用不超过常规实验的实验来确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等同物。此类等同物意在为附随的权利要求书所涵盖。除非另有指出，否则舍入数字的一般数学规则适用于本说明书中的所有数字，例外的是非多分散分子如h2o、nhss、edc等的分子量。聚合物为多分散分子。任何时候在给出数字时，该数字的最后一位应理解为是置信界限并且是将数字范围舍入到给定数字的最接近的最后一位的结果。例如，“5kda聚合物”指4.5kda至5.5kda之间的范围，因为4.51-5.49kda舍入到最接近的千位为5kda。另一个实例为2.1mmol，其为2.05至2.15mmol之间的范围。另一个实例为5.0kda聚合物，其为4.95至5.05kda之间的范围。