一种生物碱类化合物及其制备和应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种生物碱类化合物及其制备和应用。

背景技术：

夏天无为罂粟科紫堇属延胡索亚属植物伏生紫堇[corydalisdecumbens(thunb)pers.]的块茎。主产于江西、湖南、福建、浙江、安徽等省，以江西产质量为佳。收载于中国药典2010年版一部，具有活血通络，行气止痛的功效。临床上常用于治疗腰椎间盘突出症、坐骨神经痛、风湿性关节炎等。目前已开发出的夏天无制剂很多，其中，夏天无片，复方夏天无片，夏天无滴眼液，夏天无注射液已被列入中药成方制剂保护品种。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种化合物及其制备和应用，制备的化合物对于脂肪酶有一定抑制作用。

本发明提供了一种生物碱类化合物，具有式(i)所示结构：

本发明还提供了一种式(i)所示化合物的制备方法，包括：

a)将夏天无用乙醇浸提得到浸膏；

b)将步骤a)得到的浸膏与水混合，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物；

c)将步骤b)得到的乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离，以氯仿、甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，所述氯仿、甲醇的体积比为(100:0)～(0:100)，收集分子量为263的组分；

d)将步骤c)收集的分子量为263的组分经中压制备色谱、半制备液相色谱或者制备色谱分离，得到式(i)所示化合物；

优选的，所述步骤c)中收集分子量为263的组分具体为：

c1)将梯度洗脱得到的洗脱液经tlc检测后合并相似流分并分组；

c2)使用lc-ms对步骤c1)分组后的组分进行检测，将含有分子量为263的化合物的组分合并；

c3)使用hplc对步骤c2)得到的组分进行极性分段；

c4)使用lc-ms对步骤c3)分段后的组分进行检测，收集分子量为263的组分。

优选的，所述步骤c1)中，分组为分10组。

优选的，所述步骤c3)中，极性分段为按照极性不同分为10段。

优选的，所述步骤a)中乙醇为60％～95％乙醇。

优选的，所述步骤a)具体为：

将夏天无用乙醇浸提，过滤后滤液浓缩得到浸膏。

本发明还提供了一种式(i)所示化合物在制备治疗高血脂药物中的应用，

本发明还提供了一种药物组合物，包括式(i)所示化合物，

优选的，所述药物组合物用于治疗高血脂，或减肥药物。

与现有技术相比，本发明提供了一种具有式(ⅰ)所示结构的化合物，其对于脂肪酶有一定抑制作用，可以用于制备高血脂药物、减肥药物。

附图说明

图1为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hr-esi-q-tof-ms图；

图2为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的核磁氢谱图；

图3为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的核磁碳谱图；

图4为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hsqc图；

图5为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hmbc图；

图6为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的¹h-¹hcosy图。

具体实施方式

本发明提供了一种生物碱类化合物，具有式(i)所示结构：

本发明还提供了一种式(i)所示化合物的制备方法，包括：

a)将夏天无用乙醇浸提得到浸膏；

b)将步骤a)得到的浸膏与水混合，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物；

c)将步骤b)得到的乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离，以氯仿、甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，所述氯仿、甲醇的体积比为(100:0)～(0:100)，收集分子量为263的组分；

d)将步骤c)收集的分子量为263的组分经中压制备色谱、半制备液相色谱或者制备色谱分离，得到式(i)所示化合物；

本发明以夏天无药材为原料，所述夏天无药材可以为本领域技术人员公知的夏天无药材，本发明对其来源并无特殊限制。

本发明首先用乙醇对夏天无药材进行浸提，过滤后滤液浓缩得到浸膏。本发明中，所述乙醇优选为60％～95％乙醇(体积分数)，更优选为80％～95％乙醇；所述夏天无药材重量与乙醇体积的比例优选为1:(6～10)，更优选为1:(7～9)，在本发明的某些具体实施例中，所述比例为1:8。所述浸提优选进行3～4次。上述比例中，夏天无药材重量单位为g，乙醇体积单位为ml。

本发明对上述浓缩的方法并无特殊限定，可以为本领域公知的浓缩方法，本发明优选采用减压的方法进行浓缩，除去溶剂得到浓缩物。

得到浸膏后，将其与水混合，使浸膏分散在水中，然后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，浓缩、干燥后分别得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物；本发明对于水的用量并无特殊限定，能够使浸膏分散即可；本发明中，所述石油醚体积与浸膏的重量比优选为(1～5)：1，在本发明的某些具体实施例中，所述比例为1:1，2:1，3:1，5:1；所述乙酸乙酯体积与浸膏的重量比优选为(1～5)：1，在本发明的某些具体实施例中，所述比例为1:1，2:1，3:1，5:1；上述比例的单位是ml/g；本发明中，所述萃取的次数优选为3～6次。

然后，将得到的乙酸乙酯萃取物进行柱色谱分离，本发明优选采用硅胶柱，以氯仿、甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，所述氯仿、甲醇的体积比为(100:0)～(0:100)，按极性递增进行梯度洗脱，收集分子量为263的组分；本发明对所述氯仿、甲醇混合溶剂的浓度梯度并无特殊限定，可以根据实际需要选取。

本发明中，上述收集分子量为263的组分具体为：

c1)将梯度洗脱得到的洗脱液经tlc检测后合并相似流分并分组；

c2)使用lc-ms对步骤c1)分组后的组分进行检测，将含有分子量为263的化合物的组分合并；

c3)使用hplc对步骤c2)得到的组分进行极性分段；

c4)使用lc-ms对步骤c3)分段后的组分进行检测，收集分子量为263的组分。

所述步骤c1)中，相似流分指极性相似的组分。在本发明的某些具体实施例中，将梯度洗脱得到的洗脱液经tlc检测后，将极性相似的组分进行合并，分为10组。

步骤c2)中，使用lc-ms进行检测，化合物的lc-ms检测中阳离子模式下的主要离子片段为：m/z264.0869[m+h]⁺，m/z549.1484[2m+na]⁺。

步骤c3)使用hplc对步骤c2)得到的组分进行极性分段时，在本发明的某些具体实施例中，分为10段。

步骤c4)中，使用lc-ms进行检测，化合物的lc-ms检测中阳离子模式下的主要离子片段为：m/z264.0869[m+h]⁺，m/z549.1484[2m+na]⁺。

收集组分后，中压制备色谱、半制备液相色谱或者制备色谱分离，即可得到式(i)所示化合物；

本发明对得到的化合物进行了结构鉴定，结果参见图1～图6，其中，图1为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hr-esi-q-tof-ms图，图2为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的核磁氢谱图，图3为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的核磁碳谱图，图4为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hsqc图，图5为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的hmbc图，图6为本发明提供的式(ⅰ)所示化合物的¹h-¹hcosy图。

具体的，通过图1的质谱分析可以得知m/z为264.0869[m+h]⁺(理论计算值为264.0866)，549.1484[2m+na]⁺，进而确定化合物分子式为c13h13no5，计算不饱和度为8。

本化合物的¹³cnmr(见表1)显示具有13个碳信号，结合hsqc谱图数据推测有5个亚甲基(其中1个为连氧碳)、2个次甲基(均为烯碳)和6个季碳【1个酯羰基、1个酰胺羰基、4个烯碳(其中两个连氧)】。此外，根据核磁谱图¹hnmr数据(见表1)可知，存在两个连氧的亚甲基[δh6.09(s,2h)and4.44(s,2h)]、3个相互偶合的亚甲基[δh3.60(t,j＝6.9hz,2h),2.35(t,j＝6.8hz,2h),2.02–1.90(m,2h)]和2个相互偶合的芳氢质子[δh7.01(d,j＝7.8hz,1h)and6.95(d,j＝7.9hz,1h)]。此外，结合¹h,¹h-cosy谱图(图6)可知，存在一个亚甲二氧基和一个–ch2ch2ch2–结构片段。6个烯碳信号和2 个羰基碳信号一共占了8个不饱和里面的5个，推测此化合物具有三个环。化合物1的结构进一步通过2d的nmr核磁谱图得到解析，特别是hmbc谱图。在化合物1的hmbc谱图中，h2-15(δh6.09,s,2h)与c-10(δc149.7)和c-11(δc144.6)相关说明亚甲二氧基连接在c-10和c-11上；h2-8(δh4.44,s,2h)与c-6(δc177.0)相关说明酯羰基与c-8相连；h2-5(δh2.35,t,j＝6.8hz,2h),h2-4(δh2.02–1.90,m,2h)与c-6(δc177.0)相关推测–ch2ch2ch2–与c-6相连；h2-3(δh3.60,t,j＝6.9hz,2h)与c-2相关推测酰胺羰基连接在c-3上。化合物1的3环结构需要酰胺基上的氮原子与c-14连接，此推测通过c-14(δc136.3)的化学位移较低场证实。综上所述，化合物1的结构被鉴定为如式(i)所示，且命名为decumbensalkal。所有的碳氢信号归属参见表1。经scifinderscholar网络检索，发现本化合物未见文献报道，表明其为一个新的生物碱类化合物。

表1化合物的核磁数据

(氘代cd3od,¹h-nmr400mhz,¹³c-nmr100mhz)

关键hmbc相关信号(h→c)和1h-1hcosy(h-c)信号

本发明还提供了一种式(ⅰ)所示化合物在制备治疗高血脂药物中的应用。

通过本发明实施例可知，本发明所述的化合物对脂肪酶具有很好的抑制作用。

本发明还提供了一种药物组合物，包括式(ⅰ)所示化合物。

本发明中，所述药物组合物中优选还包括药物中可接受的辅料。

本发明中，所述药物组合物用于治疗高血脂，或减肥药物。

发明通过对夏天无药材进行提取研究，得到了式(ⅰ)所示化合物，且通过对上述化合物进行细胞实验，发现其对脂肪酶具有明显抑制作用，进而在制备治疗高血脂药物或减肥药物领域具有潜在应用。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的化合物及其制备和应用进行详细描述。

实施例1

取夏天无药材1000g，用95％乙醇8000ml浸提3次，过滤后滤液浓缩回收乙醇得到浸膏。

此浸膏再溶于水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，每次萃取的液体体积比例为1:1，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。

将乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法分离，以不同比例的氯仿-甲醇混和溶剂(100:0～0:100)按极性递增进行梯度洗脱,并按体积收集流分，每1000ml一个馏分。然后，经tlc检测后合并相似流分，分成10个组分，记为fr.l-fr.10。

使用lc-ms测试分析上述所得10个组分，追踪到含分子量为263的化合物的组分，进行合并，合并后所得组分经制备hplc进行极性分段，共分为10段(记为a-1至a-10)，然后使用lc-ms测试分析追踪到分子量为263化合物存在于a-9组分段中，将a-9组分段经半制备液相色谱分离，得到本发明式(i)所示化合物10.8mg。

经检测，其纯度为98％。

其hr-esi-q-tof-ms图见图1，由图1可知，其分子量为264.0869[m+h]⁺。

对制备的化合物进行核磁共振检测确定其结构，检测结果见图2～图6，其核磁数据详见表1。

由上述检测可知，本发明制备的化合物具有式(ⅰ)所示结构。

实施例2

取夏天无药材1000g，用95％乙醇6000ml浸提3次，过滤后滤液浓缩回收乙醇得到浸膏。

此浸膏再溶于水制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，每次萃取的液体体积比例为2:1，萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。

将乙酸乙酯萃取物采用硅胶柱色谱法分离，以不同比例的石油醚-丙酮混和溶剂(100:0～0:100)按极性递增进行梯度洗脱,并按体积收集流分，每1000ml一个馏分。然后，经tlc检测后合并相似流分，分成10个组分，记为fr.l-fr.10。

使用lc-ms测试分析上述所得10个组分，追踪到含分子量为263的化合物的组分，进行合并，合并后所得组分经制备hplc进行极性分段，共分为10段(记为a-1至a-10)，然后使用lc-ms测试分析追踪到分子量为263化合物存在于a-8组分段中，将a-8组分段经半制备液相色谱分离，得到本发明式(i)所示化合物7.5mg。

经检测，其纯度为98％。

制备的化合物经hr-esi-q-tof-ms检测，其分子量为264.0869[m+h]⁺。

对制备的化合物进行核磁共振检测确定其结构，证明本发明制备的化合物具有式(ⅰ)所示结构。

实施例3抑制脂肪酶活性实验

1.药物、材料与方法

1.1药物

实施例1制备的夏天无新化合物

1.2材料

猪胰脂肪酶、4-硝基苯棕榈酸酯、阿拉伯树胶粉、奥利司他，sigma公司；

tris，amersco；

异丙醇，国药集团化学试剂有限公司；

脱氧胆酸钠，国药集团化学试剂有限公司；

dmso，国药集团化学试剂有限公司；

盐酸，南京化学试剂有限公司。

酶标仪，moleculardevicesspectramaxm2e；

天平，mettlertoledoal104；

离心机，eppendorf5424。

1.3方法：

(1)试剂配制

药品配制：称取样品(式(i)所示化合物或奥利司他)溶于dmso中配制成200mg/ml母液，-20℃保存。

缓冲液配制：50mmtris-hcl溶液，含0.1％阿拉伯树胶粉和0.2％脱氧胆酸钠，ph值为10.0。

酶溶液配制：用缓冲液配制1.2mg/ml酶，混匀，5000rpm离心5分钟，取上清，分装，-70℃保存。

底物溶液配制：称取0.302gpnpp(对硝基苯磷酸二钠)，加入32ml异丙醇，超生乳化，即为25mmpnpp，分装，4℃保存。

(2)脂肪酶抑制剂活性测定

在96孔细胞培养板中，加入198μl缓冲液，再加入9.6μl50mg/ml样品母液，混匀，使其初浓度为2.4mg/ml。再用缓冲液进行倍比稀释使其浓度依次为1.2mg/ml、0.6mg/ml、0.3mg/ml、0.15mg/ml。脂肪酶溶液用缓冲液稀释120倍，底物用缓冲液稀释50倍。以上稀释后的试剂待用。

取96孔细胞培养板，按照表2中不同的分组分别加入缓冲液、抑制剂和脂肪酶，37℃孵育10分钟。脂肪酶和抑制剂预孵育10分钟后，每孔加入100μl底物，37℃反应60分钟。在酶标仪od405nm处测量各孔的吸光值。

表2脂肪酶抑制剂筛选反应体系(200μl)

表2中，

a：为未加抑制剂的酶活；a：为未加抑制剂的空白对照(未加酶)；

b：为加抑制剂的酶活；b：为加抑制剂的空白对照(未加酶)。

2.结果处理及分析

脂肪酶抑制率的计算公式：inhibitionrate％＝[1-(b-b)/(a-a)]×100。

计算结果见表3，表3是式(i)所示化合物各剂量组对脂肪酶的抑制作用汇总，由表3可见，本发明制备的式(i)所示化合物各剂量组均可不同程度的抑制脂肪酶活性。

表3式(i)所示化合物各剂量组对脂肪酶的抑制作用

^**p<0.01，与对照组比较。

上述实验结果表明，本发明制备的式(i)所示化合物对脂肪酶具有体外抑制作用，且呈现量效关系。

实施例4降血脂测定

1.药物、材料与方法

1.1药物

实施例1制备的夏天无新化合物

1.2材料

辛伐他汀，sigma；

天平，mettlertoledo；

离心机，eppendorf5424；

酶标仪，moleculardevicesspectramaxm2e；

总胆固醇(tc)测定试剂盒、甘油三酯(tg)测定试剂盒、低密度脂蛋白(ldl-c)测定试剂盒及高密度脂蛋白(hdl-c)测定试剂盒，中生北控 生物科技股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶(alt)测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

动物：雄性sd大鼠，体重(50±10)g，购自浙江省实验动物中心提供，许可证号：scxk(浙)2008-0033。

饲料：基础营养饲料和高脂营养饲料(含3％胆固醇、0.2％胆酸、0.5％丙硫氧嘧啶、10％猪油)由江宁青龙山动物繁殖场提供。

1.3方法：

(1)造模

sd大鼠120只，随机选取15只作为空白对照组。空白对照组给予基础营养饲料，其余105只给予高脂营养饲料，第1周每日给予15g/d高脂营养饲料，自由饮水。造模期间，每周末次给予高脂营养饲料16h后取血检测tc或tg的水平。6周后大鼠的tc或tg水平超过正常组大鼠(p<0.05)为造模成功。

(2)分组与给药

造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照(辛伐他汀)组、夏天无新化合物高剂量组、夏天无新化合物中剂量组、夏天无新化合物低剂量组，每组15只。给药组与模型组继续给食高脂饲料，空白对照组投喂基础饲料。给药剂量分别为：辛伐他汀10mg/kg、夏天无新化合物高剂量组50mg/kg、夏天无新化合物中剂量组25mg/kg、夏天无新化合物低剂量组12.5mg/kg。用纯净水配成混悬液，灌胃给药体积为10ml/kg，连续6周。给药时间为每日16:00。模型组灌胃给予等体积的纯净水，空白对照组不作任何处理。

(3)检测方法

每周用电子天平测体重(精确到0.1g)一次，每周检测tc或tg的水平以大致观察大鼠的造模及治疗情况。对给药6周的动物处死前(处死前12h空腹)，称体重，用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取肝脏组织并称取湿重。

打开胸腔，自心脏直接采血4～6ml，肝素抗凝，分离血清，按照试剂盒要求的测定条件和程序测定血清总胆固醇(tc)、甘油三脂(tg)、低密度脂蛋白(ldl-c)、高密度脂蛋白(hdl-c)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)含量。

2.结果处理及分析

2.1对大鼠血脂的影响

实验结果见表4，表4是大鼠血脂测定结果汇总，由表4可见，与空白对照组相比，模型组大鼠的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的含量明显升高(p<0.01)，高密度脂蛋白的含量显著降低(p<0.05)；夏天无新化合物各剂量组可不同程度的降低肥胖大鼠的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量；夏天无新化合物高剂量组还可升高高密度脂蛋白的含量(p<0.05)。

表4大鼠血脂测定汇总(n＝15)

^*p<0.05，^**p<0.01，与对照组比较；^#p<0.05，^##p<0.01，与模型组比较；

2.2对大鼠体重以及肝功能的影响

表5是大鼠体重、肝功能检测结果，由表5可见，与空白对照组相比，模型组大鼠的体重、肝重、ast、alt的值显著增加(p<0.01)；夏天无新化合物高、中、低剂量组可不同程度减轻大鼠的体重和肝重；夏天无新化合物高、中剂量组可明显降低大鼠的ast和alt(p<0.01)。

表5大鼠体重、肝功能检测结果(n＝15)

^**p<0.01，与对照组比较；^#p<0.05，^##p<0.01，与模型组比较；

上述实验结果显示，本申请制备的式(i)所示化合物，各剂量组可以不同程度的减轻高脂血症大鼠的体重及肝重，高剂量和中剂量的化合物可以不 同程度的降低tc、tg、ldl-c、ast以及alt的含量；高剂量化合物组还可升高高密度脂蛋白的含量。表明本申请制备的式(i)所示化合物具有一定的降血脂、减肥作用，可用于高脂血症，且以夏天无新化合物高剂量组效果较优。

本发明所述的夏天无新化合物即为本申请制备的式(i)所示化合物。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。