本发明涉及游离脂肪酸测定
技术领域：
，特别涉及一种游离脂肪酸测定试剂盒，还涉及所述游离脂肪酸测定试剂盒的制备方法。
背景技术：
：游离脂肪酸(NFFA)是指非酯化的脂肪酸或未脂化的脂肪酸。血清中的NEFA代谢活性极高，极易受脂肪代谢、糖代谢及内分泌代谢的影响。随着研究的深入和技术的不断进步，血清NEFA与疾病的关系逐渐明晰，NEFA已被证实与心脑血管、呼吸、消化、内分泌、免疫等系统疾病的发生发展，以及肿瘤和创伤性应激等的能量代谢关系密切。是重要的致胰岛素抵抗的物质，是反映脂质代谢、糖代谢、内分泌机能等非常灵敏的指标。通过检测血清中脂肪酸水平，可研究糖尿病与脂质及脂肪酸的关系。在现有技术中，酶法测定游离脂肪酸的试剂盒中，反应原理是人血清中游离脂肪酸和辅酶A在乙酰辅酶A合成酶(ACS)的作用下反应生成脂酰辅酶A，脂酰辅酶A在乙酰辅酶A氧化酶(ACOD)的作用下生成H2O2，随后通过Trinder’s反应在过氧化物酶(POD)的作用下生成有色物质。但现有的酶法测定游离脂肪酸的试剂盒存在以下缺陷：1)含有过氧化物酶和酰基辅酶A氧化酶的试剂R2，成分比较复杂含有多种酶，其稳定性与酶活性相关，而酶的活性易受各种因素的干扰，比如pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂等，导致试剂盒缺乏稳定性，保存时间短，影响临床使用；2)试剂R2中酶的使用量大，试剂容易出现沉淀。因此，研制一种酶活性稳定、不易沉淀、制备简单、成本低廉游离脂肪酸测定试剂盒是游离脂肪酸测定领域亟需解决的一个问题，而要解决这个问题，归根结底是要从酶保护剂上来进行研究。技术实现要素：为了解决以上酶法测定游离脂肪酸的试剂盒试剂的稳定性问题、延长试剂的保存期限、防止沉淀，本申请公开了一种稳定性好、不易沉淀的游离脂肪酸测定试剂盒。本发明是通过以下措施实现的：一种游离脂肪酸测定试剂盒，含有试剂R1和试剂R2，试剂R1中含有以下成分：pH为7.0的磷酸二氢钠50mmol/L、辅酶A0.05mmol/l、三磷酸腺苷3mmol/L、酰基辅酶A合成酶0.4KU/L、MgCl22mmol/L、Trinder底物0.5g/L、吐温20<1mL/L，pH为7.2；试剂R2中含有以下成分：pH为7.0的磷酸二氢钠60mmol/L、黄素腺嘌呤二核苷酸2mmol/L、4氨基安替比林10mmol/L、过氧化物酶40KU/L、酰基辅酶A氧化酶30KU/L、吐温20<1mL/L、甘油20mL/L-300mL/L、brij35(十二烷基聚乙二醇醚)1-1.5g/L、乙二胺四乙酸二钠1g/L，pH为7.2。所述的游离脂肪酸测定试剂盒的制备方法，试剂R1配制方法为：取800mL的水，加入pH为7.0的磷酸二氢钠至50mmol/L，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A至0.05mmol/l、三磷酸腺苷至3mmol/L、酰基辅酶A合成酶至0.4KU/L、MgCl2至2mmol/L、Trinder底物至0.5g/L、吐温20至<1mL/L。所述的游离脂肪酸测定试剂盒的制备方法，试剂R2配制方法为：取800mL的水，加入pH为7.0的磷酸二氢钠至60mmol/L，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入黄素腺嘌呤二核苷酸至2mmol/L、4氨基安替比林至10mmol/L、过氧化物酶至40KU/L、酰基辅酶A氧化酶至40KU/L、吐温20<1mL/L、甘油至200mL/L-300mL/L、brij35(十二烷基聚乙二醇醚)至1-1.5g/L、乙二胺四乙酸二钠至1g/L。本发明的有益效果：1.本发明技术方案改进试剂的粘度，使试剂的粘度降低，这样溶液更容易快速的过滤；2.同时通过添加不同组合的蛋白保护剂，brij35(十二烷基聚乙二醇醚)、甘油、吐温20和EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)，延长酶活稳定性，酶的37℃稳定性延长，由7天延长到14天；3.通过添加不同组合的蛋白保护剂，减慢酶的变性，试剂R2不易出现沉淀。具体实施方式为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。实施例1：试剂R1配制方法；取800mL的水，加入磷酸二氢钠至50mmol/L，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入辅酶A至0.05mmol/L、ATP至3mmol/L、ACS至0.4KU/L、MgCl2至2mmol/L、Trinder底物至0.5g/L试剂R2配制方法：取800mL的水，加入磷酸二氢钠至60mmol/L，充分溶解，用NaOH调节pH到7.2，依次加入FAD至2mmol/L、4-AA至10mmol/L、ACOD至40KU/L、吐温20至<1％、甘油至20％-30％、Brj35至1-1.5g/L、EDTA-2Na至1g/L。实施例2：制备方法同实施例1。对比实施例1：同实施例1相比，将试剂R2中的吐温20去掉，量用Brj35补齐，其余操作同实施例相同。对比实施例2：同实施例1相比，将试剂R2中的Brj35去掉，量用吐温20补齐，其余操作同实施例相同。对比实施例3：同实施例1相比，将试剂R2中的EDTA-2Na去掉，用EGTA代替，用量同EDTA-2Na相同，其余操作同实施例相同。性能检测1、稳定性检测：操作步骤：试剂放入37℃恒温干燥箱前的检测数据做为第一天数据。放入恒温干燥箱，第3、5、7、9、11、13、14天各检测一次，记录数据，对比分析结果。要求：37℃偏差小于12％日期实施例1实施例2对比实施例1对比实施例2对比实施例3第1天1.031.041.041.051.03第3天1.041.051.051.041..02第5天1.041.031.021.011.03第7天1.031.030.990.970.98第9天1.031.020.940.950.95第11天1.021.020.920.930.91第13天1.011.020.850.850.86第14天1.011.000.820.800.79结论：37℃稳定性，实施例1、2的试剂盒稳定性优于对比实施例1、2、3试剂盒的稳定性，说明brij35、甘油、吐温20和EDTA-2Na复合使用，对试剂稳定性起到的很好的协同作用。2、精密度检测：要求；批内精密度CV<10％结论：精密度符合要求。3、准确度：要求；质控测值偏差小于15％结论：符合要求，偏差小于15％4、抗干扰性分别在样品中加入不同量的抗坏血酸、血红蛋白、胆红素，检测实施例1、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3试剂对以上干扰物的抗干扰能力。取3个样品，第一个样品加入坏血酸，加入的浓度分别是，0g/L、0.0625g/L、0.1245g/L、0.25g/L、0.5g/L。第二支样品加入血红蛋白，加入的浓度分别0g/L、0/45g/L、1g/L、2g/L、4g/l。第三支样品加入胆红素，加入的浓度分别0μmol/L、62.6μmol/L、250μmol/L、375μmol/L。抗干扰：在一定浓度下偏差小于10％。从上表中可以看出，实施例1试剂盒抗干扰性优于对比实施例1、2、3试剂盒，说明brij35、甘油、吐温20和EDTA-2Na复合使用，对试剂盒抗干扰性起到的很好的作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3