用于检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物的制作方法

本发明提供了一种用于快速检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物组，属于耐药结核分支杆菌突变技术领域。

背景技术：
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结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的疾病，是全球范围经济和社会负担最严重的疾病之一，结核病的防控工作已成为重大的公共卫生问题与社会问题。尽管随着抗结核药物的出现和应用，结核病的防治工作取得一定的进展，但仍面临诸多问题和挑战。据报道，世界约有1/3的人口感染结核分枝杆菌，仅有不足1/10的结核病分枝杆菌感染者继续发展成为临床结核病患者，其他大多数感染者均能控制或清除体内的结核分枝杆菌。

由于结核分枝杆菌的高传染率和高死亡率，对其进行有效的预防和药物治疗非常重要。异烟肼（Isonicotinic acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）等药物作为抗结核病治疗的一线药物在临床已应用50余年，但近年发现该病的耐药率逐年增多，已成为不容忽视的问题。结核分枝杆菌耐药性的产生，使结核病患者的数量在全世界范围内呈现增长趋势。目前的研究表明，结核分枝杆菌基因突变是其产生耐药性的主要原因。

自1952年发现异烟肼以来，其一直用于抗结核病一线治疗药物。经过半个多世纪的广泛使用，INH耐受型菌株的出现日趋增多，结核分枝杆菌发生INH耐受相关的基因有：KatG、InhA、ahpC、KasA、ndh、nat和mshA等。其中KatG编码结核分枝杆菌的过氧化氢-过氧化物酶，该酶可激活INH为INH自由基，INH自由基与辅酶I形成共价化合物，抑制烯酰基乙酰载体蛋白还原酶的功能，进而阻止细胞壁分枝菌酸的合成，导致病原菌死亡。若KatG发生突变就有可能使致病菌对药物产生耐受性。研究表明KatG密码子315位（G944C）的突变会导致耐异烟肼结核分枝杆菌的产生，而密码子300位（T906G）突变也会导致菌株产生异烟肼耐受，这两个突变是KatG基因的常见突变。而KatG在302位密码子（C906A）的突变是我们新发现的耐异烟肼突变。

目前已有的相关发明专利检测方法与本发明不同，它们均是以荧光定量PCR技术为基础，不管是仪器还是试剂，均比普通PCR使用成本高，不适合在常规的实验室及医院中推广使用。等位基因特异PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法操作简便、快速，所需实验器材简单，实验试剂经济，因此该方法被广泛的应用于DNA突变或单核苷酸多态性（SNP）的检测。并且这些试剂盒主要针对异烟肼耐受结核菌株的KatG基因突变位点944，而本发明检测的是我们自己发现的新突变位点。本发明不仅提供了简便、快速、经济的突变检查方法，还增加了突变的检查范围。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、简易、经济的检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的AS-PCR特异性引物，其中KatG 906A-F和KatG 906-R是检测KatG基因C906A突变的特异性引物，KatG 906C-F和KatG 906-R是检测野生型菌株KatG基因的特异性引物，16S 915-F和16S 1018-R为内参引物，引物序列如下：

；

该方法基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的正向引物3′端第一位设计成A碱基，并且在引物3′端第三位引入一个错配碱基（将碱基A突变成碱基T，形成T/T错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定突变是纯合突变或杂合突变，同时用一对检测野生型样本的引物进行检测，将检测野生型引物中的正向引物3′端第二位碱基引入一个错配碱基（将碱基G突变成碱基T，形成T/C错配）；同时，在结核分枝杆菌16S rRNA的相对保守的区域中的915-1018区段还设计了一对内参引物（见上表，16S 915-F/1018-R），用于监测PCR扩增反应体系是否正常进行扩增。采用上述两对AS-PCR引物（KatG906A-F/KatG906-R和KatG906C-F/KatG906-R）及一对内参引物对待测标本DNA进行PCR扩增；设计为检测突变的引物只能扩增出含有突变的样本，不能扩增出野生型的样本；而设计为检测野生型的引物同理，并且无论样品中是否包含突变，均加入内参引物16S 915-F/1018-R，这样就避免了由于PCR失败而造成的假阴性的检测结果。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据能否扩增出目的片段来实现基因突变简便、快速的检测。

为确定AS-PCR方法检测耐异烟肼突变的特异性和灵敏度，选取14个野生型样本及所有突变型样本进行引物特异性检测，同时对所有突变位点构建了阳性质粒，对不同拷贝数的阳性质粒进行扩增，以确定其灵敏度，并提供本技术检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。

本发明利用等位基因特异PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法检测结核分枝杆菌KatG906突变位点，具体步骤如下：

（1）DNA提取：使用试剂盒法从结核分枝杆菌临床分离株中提取基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，进行PCR反应；

PCR反应引物：扩增引物序列及产物大小见上表；

PCR反应体系：总体系为20 µL，包含30 ng基因组DNA，10 µL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和内参引物中的正反向引物各0.5 µM，余下用dd H₂O补齐；

PCR反应程序：95℃，预变性3 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重复35个循环；72 ℃延伸5 min；

（3） PCR产物检测：取PCR产物2.5 µL在2 %的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统下观察拍照；

（4）灵敏度检测

使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置三个梯度（即10⁴、5×10⁴和10⁵个拷贝）用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数，并且使用10⁶个拷贝作为阳性对照；按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测；

（5）特异性实验

本发明为了验证AS-PCR引物的特异性，随机的选择了14个野生型样本对突变型AS-PCR引物进行测试，并用野生型AS-PCR引物对所有突变型样本进行检测；并且在进行每一个特异性试验中我们都加入了内参；将模板按照与步骤（2）和（3）相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。

本发明与其它现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，适合于在大规模的临床样本检测中推广应用；本发明对于结核分枝杆菌耐药性研究中具有重要意义。

附图说明

图1为本发明方法的灵敏度检测电泳图谱；

图2为本发明方法的特异性实验电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

1、引物设计

基于AS-PCR的原理，将检测突变型引物中的正向引物3′端第一位设计成A碱基，并且在引物3′端第三位引入一个错配碱基（A突变成碱基T，形成T/T错配），以增强引物对突变DNA模板扩增的特异性，为确定突变是纯合突变或杂合突变，同时用一对检测野生型样本的引物进行检测，将检测野生型引物中的正向引物3′端第二位碱基引入一个错配碱基（G突变成碱基T，形成T/C错配），扩增出大小为273bp的片段；同时，在结核分枝杆菌16S rRNA的相对保守的区域中的915-1018区段还设计了一对内参引物（16S 915-F/1018-R），并且无论样品中是否包含突变，内参引物16S 915-F/1018-R都会扩增出一条104 bp的片段。

2、样本采集

采集经测序证实携带有KatGC906A突变的DNA样本和野生型样本。

3、样品基因组DNA提取

使用试剂盒法提取结核杆菌临床分离株基因组DNA。

4、PCR扩增

PCR反应体系：总体系为20 µL，包含30 ng基因组DNA，10 µL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和内参引物中的正反向引物各0.5 µM，余下用dd H₂O补齐；

PCR反应程序：95℃，预变性3 min；95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸10 s，重复35个循环；72℃延伸5 min。

5、PCR产物检测

PCR产物检测：取PCR产物2.5 µL在2 %的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，120 V恒压电泳30 min，凝胶成像系统下观察拍照。

6、灵敏度检测

使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置三个梯度（即10⁴、5×10⁴和10⁵个拷贝）用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数，并且使用10⁶个拷贝作为阳性对照。按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。

用本发明方法进行等位基因特异PCR检测结核分枝杆菌KatG906位突变位点灵敏度实验的电泳结果（见图1）。

图1中，泳道M为2000 bp的核酸分子量标准，泳道1、3、5、7、9、11、13和15使用含有突变的质粒作为模板，泳道2、4、6、8、10、12、14和16使用不含突变的质粒作为模板；泳道1、2、5、6、9、10、13和14使用检测野生型引物（即KatG906C-F/906R），泳道3、4、7、8、11、12、15和16使用检测突变型引物（即KatG906A-F/906R）；泳道1-4的阳性质粒拷贝数为10⁴，泳道5-8的阳性质粒拷贝数为5×10⁴，泳道9-12的阳性质粒拷贝数为10⁵，泳道13-16的阳性质粒拷贝数为10⁶（即阳性对照）。泳道17为阴性对照（用不含结核分枝杆菌DNA的dd H₂O作为模板）。

图1中检测野生型的引物只能同野生型样本共同扩增出大小为273bp的条带，同样检测突变型引物只能同含有相应突变型的样本共同扩增出大小为273bp的条带，与预期效果相同。模板拷贝数由低到高时，可以明显的看出条带由微弱到明亮的变化。在10⁴拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道2和泳道3看不见条带，说明在10⁴拷贝数的质粒作为模板时，检测突变的引物进行PCR后用琼脂糖凝胶电泳不能有效检测突变，表明检测突变型引物在模板量较少的情况下不能有效工作；在5×10⁴拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道6和泳道7可以看到较为微弱的条带，同样不可以进行有效的检测；在10⁵拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，泳道10和泳道11均可看到稍弱的条带，说明在10⁵拷贝数的质粒作为模板时，此引物进行PCR后用琼脂糖凝胶电泳可以检测突变。综上，用于检测KatGC906A对的两对AS-PCR引物检测下线在10⁵个拷贝数。

7、特异性实验

本发明为了验证AS-PCR引物的特异性，随机的选择了14个野生型样本对AS-PCR引物进行测试，并用野生型AS-PCR引物对所有突变型样本进行检测，并且在进行每一个特异性试验中我们都加入了内参；将模板按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。

用本发明方法进行等位基因特异PCR检测结核分枝杆菌KatG 906位突变位点特异性实验的电泳结果（见图2）。图2表示用野生型样本对检测906位突变位点的AS-PCR引物进行测试。

图2中，泳道1-14使用的均为野生型样本A图使用的是检测野生型的AS-PCR引物（即KatG906C-F/906R），而B图使用的是检测突变型的引物（即KatG906A-F/906R）；泳道M为2000 bp的核酸分子量标准，泳道15为阴性对照（用不含结核分枝杆菌DNA的dd H₂O作为模板）。

图2-A中，用检测野生型AS-PCR引物KatG906C-F/906R对随机挑选的14个野生型样本进行扩增，均能扩增出明亮且大小为273bp的条带，且内参引物均能扩增出明亮且大小为104bp的条带；图2-B中，用检测突变型AS-PCR引物KatG906A-F/906R对随机挑选的14个野生型样本进行扩增，仅有内参引物所扩增出的条带；由此，可以得出用于检测KatGC906A的两对AS-PCR引物具有良好的特异性。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>用于检测耐药结核分枝杆菌KatG基因C906A突变的特异性引物

<160>5

<170> PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ggcttgggct ggaagtga 18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

atccacccgc agcgagag 18

<210>3

<211>18

<212> DNA

<213>人工合成

<400>3

ggcttgggct ggaagatc 18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cgcacaagcg gcggagca 18

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gccacaaggg aacgcctatc t 21