本发明涉及一种染色体培养基，具体涉及一种快速收获中期细胞的染色体培养基及其应用，属于细胞生物学、人类医学遗传学技术领域。
背景技术：
染色体发生任何数目异常，甚至是微小的结构畸变，如重复、缺失、易位等，都将导致基因的增加或缺少，从而产生相应的临床表型。如多种畸形综合征，症状包括多发畸形、智力低下和生长发育异常，此外还可能有一些皮肤纹理的改变。染色体畸变还可以导致胎儿死胎或流产。外表正常的染色体平衡易位携带者，有可能造成子代的流产、死胎、新生儿死亡或先天畸形。目前已发现自然流产中约有50%以上是由于胎儿染色体异常所致。染色体检查主要用于临床诊断。
外周血染色体制备是目前应用最广泛、最经典的细胞遗传学诊断技术。由于外周血取材简便，培养条件容易控制，实验可操作性强，所以临床应用价值较高。外周血染色体制备的原理和过程主要是：在植物血球凝集素(PHA)的刺激下促使小淋巴细胞转化为淋巴母细胞从而进行有丝分裂，利用秋水仙素终止分裂中期的淋巴细胞，得到高度螺旋化，长短适宜的染色体。分裂中期是观察染色体形态特征的最佳时期。再经过低渗、固定、滴片、烤片、消化和染色，就可以获得染色体制片。根据染色体的带纹和数目便可以进行染色体核型分析，诊断染色体数目和结构的异常情况，从而进一步进行临床诊断。由此可见，获得较多的合格中期细胞是染色体制备及核型分析的关键。
目前市面上的染色体培养基没有统一标准，质量参差不齐，有的培养基质量不稳定，影响染色体制备效果和分析诊断。由于染色体检查，适用人群广，检查需求也较多，但是染色体标本制备费时较长，这不但影响了诊断结果的生成时间，影响病人进行其他检查的进度，还不便于各大医院进行大量的染色体检查。在染色体制备过程中，需要加入秋水仙素终止分裂中期的细胞，而秋水仙素的处理时间一般较长，这是染色体制备过程中较费时的一步。虽已有一些改良培养基的报道，但是其应用在染色体制备中，其秋水仙素的处理时间仍较长，一般在2-4小时。为此，寻找一种能够快速收获中期细胞的染色体培养基，对于染色体制备和检查具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速收获中期细胞的染色体培养基，以缩短染色体制备所需时间，为进行染色体核型分析及遗传诊断提供帮助。
本发明的目的还在于提供一种快速收获中期细胞的染色体培养基的应用。
本发明的目的是这样实现的。本发明给出的快速收获中期细胞的染色体培养基，由以下有效成分组成：RPMI 1640粉末培养基、小牛血清、青霉素钠、硫酸链霉素、碳酸氢钠、植物血球凝集素(PHA)，各有效成分的含量分别为： RPMI 1640粉末培养基10.4 g/L、小牛血清100 ml/L、青霉素钠400-600 ul/L、硫酸链霉素400-600 ul/L、碳酸氢钠2 g/L、植物血球凝集素(PHA)100-120 mg/L。
优选的，本发明给出的快速收获中期细胞的染色体培养基，由以下有效成分组成：RPMI 1640粉末培养基、小牛血清、青霉素钠、硫酸链霉素、碳酸氢钠、植物血球凝集素(PHA)，各有效成分的含量分别为： RPMI 1640粉末培养基10.4 g/L、小牛血清100 ml/L、青霉素钠500 ul/L、硫酸链霉素500 ul/L、碳酸氢钠2 g/L、植物血球凝集素(PHA)100 mg/L。
优选的，所述青霉素钠为160万单位/支注射用青霉素钠，所述硫酸链霉素为100万单位/支注射用硫酸链霉素。
优选的，所述青霉素钠的配制方法如下：使用一次性无菌注射器，吸取4.5 ml灭菌0.9%生理盐水，注入1支青霉素钠瓶内，轻轻摇匀，使用后于-20℃保存。
优选的，所述硫酸链霉素的配制方法如下：使用一次性无菌注射器，吸取5 ml灭菌0.9%生理盐水，注入1支硫酸链霉素瓶内，轻轻摇匀，使用后于-20℃保存。
本发明的染色体培养基的pH值为7.2-7.4。
本发明中的各组分均可在市场上买到。
本发明提供了一种制备上述培养基的方法，包括以下步骤：
取上述各培养基各组分，加入灭菌蒸馏水中，充分溶解、混匀，充入CO2调pH值至7.2-7.4，过滤除菌，分装，15 ml的西林瓶6 ml/瓶，-20℃冻存。
本发明提供了上述培养基在人类外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析中的应用。
本发明的染色体培养基各组分比例适当，能满足细胞生长和增殖的双重物质要求，且不同批次间差异波动小。
本发明的染色体培养基中含有PHA，能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，从而进行有丝分裂，获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体。
本发明取得的有益效果如下：本发明充分发挥了不同组分和PHA的作用，可以获得大量处于分裂中期的细胞，便于进行染色体核型分析和临床诊断。同时该染色体培养基能支持快速高效的收获中期细胞，缩短秋水仙素处理时间，从而缩短染色体制备所需时间，为大量进行染色体核型分析及遗传诊断提供坚实基础。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1 一种快速收获中期细胞的染色体培养基的制备，包括以下步骤：
（1）按以下方法配制青霉素钠和硫酸链霉素
青霉素钠注射液配制：
注射用青霉素钠（160万单位/支） 1支
灭菌生理盐水 4.5 ml
硫酸链霉素注射液配制：
注射用硫酸链霉素（100万单位/支） 1支
灭菌生理盐水 5 ml
用一次性无菌注射器，吸取灭菌生理盐水，注入青霉素钠或硫酸链霉素瓶内，轻轻摇匀，使用后放-20℃保存；
（2）配制植物血球凝集素(PHA)溶液，用一次性无菌注射器抽取一定量灭菌蒸馏水将10支（10 mg/支）PHA粉末溶解。
（3）培养基制备
先将RPMI 1640粉末培养基1袋（10.4 g）溶于1000 ml灭菌蒸馏水中，加入100 ml小牛血清，加入2 g碳酸氢钠，加入青霉素钠和硫酸链霉素各500 ul，用注射器吸取10支溶解后的PHA加入，用吸管搅拌，并轻摇三角瓶，使混合均匀，充入CO2调pH值至7.2-7.4，负压过滤灭菌、分装，15 ml的西林瓶6 ml/瓶，加塞加铝盖按压密封，-20℃冻存。以上操作均在无菌间超净工作台中进行。
实施例2 人外周血淋巴细胞的培养及染色体制备（人类外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析中的应用）。
（1）外周血采集：碘伏酒精消毒肘静脉处皮肤，待彻底干燥，用2.5 ml一次性无菌注射器采血2 ml，立即吸取0.2 ml肝素钠注射液，将注射器放平，轻轻混匀。
（2）接种培养：培养基恢复室温后，用镊子取掉培养基上铝片，酒精消毒橡皮塞处，放置待酒精完全挥发。弃掉注射器前几滴血，在酒精灯下操作，针头以45度角穿过胶塞斜向刺入培养基瓶内，逐滴注入0.6 ml全血，轻轻混匀后置37℃恒温箱培养68-72 h。
（3）秋水仙素处理：在终止培养前37 min，用1 ml注射器加入10 ug/ml的秋水仙素溶液0.6ml。
（4）收集细胞：将培养物转入10 ml刻度离心管中，以2000 rpm离心10 min，弃上清液留沉淀，上清液不要吸取干净，避免临界处淋巴细胞的损失。
（5） 低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的0.075M KCl低渗液6 ml，用滴管吹打混匀，置37℃恒温水浴中低渗50 min。
（6）预固定：低渗结束后向上述刻度离心管中加入1 ml新鲜固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1），轻轻吹打混匀，2000 rpm离心10 min。
（7）一次固定：上述刻度离心管弃上清液，上清液不要吸取干净，避免临界处淋巴细胞的损失，加入固定液至6 ml刻度处，轻轻吹打混匀，2000 rpm离心10 min，弃上清液。
（8）二次固定：向上述刻度离心管加入固定液至4 ml刻度处，轻轻吹打混匀，2000 rpm离心10 min，弃上清液。
（9）制细胞悬液：向上述刻度离心管加入固定液至0.6-1 ml刻度处（可根据沉淀量多少调整，确保细胞悬液浓度适宜），轻轻吹匀制成细胞悬液。
（10）滴片：吸取细胞悬液自30 cm高处滴在一张-20℃冰冻的洁净载玻片上，每张载玻片上滴2~3滴，将载玻片依据编号放入对应试管架上，置于75-80℃烤箱中烤片1-2 h。
（11）G-显带：将染色体制片在37℃恒温水浴锅中进行胰酶消化、终止消化和Giemsa染色，最后用自来水冲去多余染液，自然风干。
（12）上述获得的G-显带的染色体制片便可以进行核型分析。如有诊断需求也可以进行其它染色体显带技术。
实施例3 染色体培养基淋巴细胞转化率和淋巴细胞分裂指数比较
选取河北省儿童医院和河北医科大学第一医院常用的两个品牌的染色体培养基，编号ET和YD。按照实施例1配制本发明染色体培养基，选取不同批次的培养基标号A1-A6，分别种入同一个人的血液0.6 ml，按照实施例2进行细胞培养、染色体制片。细胞培养效果比较见表1。由表1可见，本发明的染色体培养基的转化率和分裂指数都好于其他两个品牌，细胞的生长增殖效果更好。而且从A1-A6不同批次间的比较来看数值波动也小，说明培养基质量稳定。
注：淋巴细胞转化率=转化细胞百分数／淋巴细胞总数×100%
分裂指数=分裂细胞数／（淋巴细胞总数－分裂细胞数）×100%
结合以上实施例可以说明，本发明的快速收获中期细胞的染色体培养基，所用各组分成分明确，比例适当，操作简便，成本低，淋巴细胞转化率和分裂指数高，不同批次间差异波动小，质量稳定，可以获得大量处于分裂中期的细胞，便于进行染色体核型分析和临床诊断。同时该染色体培养基能支持快速高效的收获中期细胞，大大缩短秋水仙素处理时间，减少工作人员不必要的等待，快速开始染色体制备的流程操作，缩短了染色体制备所需的时间，提高效率，为大量进行染色体核型分析及遗传诊断提供坚实基础。
最后应当指出的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案及应用而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术方案和创造构思的前提下，做出的若干变形和改进都属于本发明的保护范围。