乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒及方法与流程

文档序号:12056583阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂;

所述第一轮PCR试剂包括:缓冲溶液,镁盐,脱氧核糖核苷三磷酸,酶混合液,第一轮PCR引物;所述第一轮PCR引物包括上游引物和下游引物;

所述第二轮PCR试剂包括:缓冲溶液,镁盐,脱氧核糖核苷三磷酸,酶混合液,第二轮PCR引物;

所述第一轮PCR引物包括46对BRCA1引物SEQ1-SEQ92和67对BRCA2引物SEQ93-SEQ226;每个所述上游引物的5’端添加序列SEQ227,每个所述下游引物的5’端添加序列SEQ228;

所述SEQ227的核酸序列为:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG;

所述SEQ228的核酸序列为:GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述第二轮PCR引物包括上游通用引物P1和下游Index引物12条Index1-Index12。

3.一种乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2检测方法,其特征在于,包括:

配置第一轮PCR试剂和第二轮PCR试剂;

取样本加入到所述第一轮PCR试剂中,进行第一轮PCR扩增,设置第一轮PCR扩增程序参数,进行第一轮PCR扩增,得到第一轮PCR扩增产物;

将所述第一轮PCR扩增产物进行纯化,得到纯化后的第一轮PCR扩增产物;

将所述纯化后的第一轮PCR扩增产物加入到所述第二轮PCR试剂中,进行第二轮多重PCR扩增,设置第二轮多重PCR扩增程序参数,进行第二轮多重PCR扩增,得到第二轮多重PCR扩增产物;

将所述第二轮多重PCR扩增产物进行纯化,得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述第一轮PCR扩增程序参数为:

预变性,预变性的温度为95℃,时间为10min;

变性,变性的温度为95℃,时间为30s;

退火,退火的温度为60℃,时间为30s;

第一次延伸,延伸温度为72℃,时间为60s;

第二次延伸,延伸温度为72℃,时间为5min。

5.根据权利要求3所述的法,其特征在于,所述第二轮多重PCR扩增程序参数为:

预变性,预变性的温度为95℃,时间为10min;

变性,变性的温度为95℃,时间为20s;

退火,退火的温度为60℃,时间为30s;

第一次延伸,延伸温度为72℃,时间为40s;

第二次延伸,延伸温度为72℃,时间为5min。

6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述将第一轮PCR扩增产物进行纯化,得到纯化后的第一轮PCR扩增产物的步骤包括:

纯化磁珠,得到纯化后的磁珠,将所述纯化后的磁珠与所述第一轮PCR扩增产物1:1混合,得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液,静置10min;

所述磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上,约3min后,吸走液体,加乙醇清洗,用20μl水洗脱,得到纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。

7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述将第二轮多重PCR扩增产物进行纯化,得到纯化后的第二轮多重PCR扩增产物;

纯化磁珠,得到纯化后的磁珠,将所述纯化后的磁珠与纯化后的第一轮PCR扩增产物1:1混合;得到磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液,静置10min;

将磁珠与所述第一轮PCR扩增产物混合液置于磁架上,约3min后,吸走液体,加乙醇清洗,用20μl水洗脱,得到磁珠/纯化后的第一轮PCR扩增产物20μl。

8.根据权利要求6或7任一项所述的方法,其特征在于,所述加乙醇清洗,所述乙醇的体积180μl,所述清洗的次数为两次。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述乙醇的浓度为70%。

10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述乙醇的浓度为75%。

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