本发明属于蛋白酶学领域，具体涉及一种鸭肝微粒体的制备方法。
背景技术：
鸭肝微粒体是鸭肝脏内质网膜的亚细胞组分，富含大量的药物代谢酶：细胞色素p450酶。细胞色素p450酶广泛的参与了类固醇、胆酸、脂肪酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及类维生素等物质的生物合成和代谢；因此，常用作体外研究药物代谢和药物相互作用的主要工具。有关禽类动物肝微粒体鲜有报道，本发明旨在提供一种简单易操作的鸭肝微粒体制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是建立一种鸭肝微粒体的制备方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法制备鸭肝微粒体：鸭肝微粒体制备方法的步骤包括：（a）断头处死实验鸭，无菌条件下，清洗液灌洗肝脏；（b）取出肝脏，离体灌洗肝脏，进一步清洗肝中残血；（c）按一定的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液，充分剪碎，冰浴中匀浆；（d）将肝脏匀浆液低速离心，分别收集上清和沉淀，沉淀加入一定量预冷的匀浆缓冲液重悬，超声破碎，肝脏匀浆液经冷冻高速离心后收集上清；（e）转移至超速离心管中，超速离心后弃上清，加入储存液重悬，再次超速离心，所得沉淀经储存液重悬分装；（f）hplc检测鸭肝微粒体亚型酶cyp3a4和cyp2e1的活性。
可选的鸭为体重为1-1.5kg，21-30日龄龄的雄性鸭；
可选的灌洗肝脏用的清洗液为10mmpbs（含0.15mkcl和0.2%尼克酰胺，ph7.4）；
可选的肝湿重比的比例为1:2-1:3；
可选的匀浆缓冲液为含0.15mkcl、1mmedta、1mmpmsf的0.05mtris-hcl（ph7.4）；
可选的加入预冷的匀浆缓冲液的量是沉淀重量的1-2倍；
可选的超声破碎的功率为180-250w、超声时间为4-5s，间隔时间为8-10s，超声次数为15-20次；
可选的超速离心的速度为100000×g，首次超速离心的时间为75min，再次超速离心的时间为45min；
可选的储存液为含0.25m蔗糖、20%甘油、1mmedta和0.15mkcl的0.1m磷酸缓冲液（ph7.4）。
附图说明
图1：hplc检测鸭肝微粒体cyp3a4活性的峰图
图2：hplc检测鸭肝微粒体cyp2e1活性的峰图
图3：鸭肝微粒体cyp3a4和cyp2e1反应速率图
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择体重为1.5kg的雄性30日龄的麻鸭制备鸭肝微粒体。具体操作如下：
1、禁食，正常饮水24h后断头处死实验鸭；
2、在无菌条件下剖腹，用预冷的含0.15mkcl和0.2%尼克酰胺，ph为7.4的10mmpbs经肝门静脉灌洗法除去肝中残血；
3、剪下肝脏，继续用预冷清洗液离体灌注肝脏进一步洗去肝中残血；
4、将清洗干净的肝脏放置冰上预冷的离心管中，称重，然后将其按1:2-1:3的肝湿重比加入预冷的匀浆缓冲液中，充分剪碎，然后在冰浴中匀浆；
5、将匀浆好的组织液，倒入预冷50ml的离心管中，4℃，1500rpm离心5min，收集上清；
6、将沉淀用1:1-1:2匀浆缓冲液重悬，超声破碎，功率180-250w，超声时间为4-5s，间隔时间为8-10s，超声次数为15-20次；
7、将收集的上清于冷冻高速离心机9000×g离心15-20min，收集上清液；
8、将转移至超速离心管中，100000×g离心75min，弃上清，加1/4原上清体积的储存液重悬，转移至新的超速离心管中，100000×g再次离心45min，得到沉淀，加约1.5倍肝重体积的储存液重悬，即为肝微粒体；
9、鸭肝微粒体亚型酶cyp3a4和cyp2e1活性检测：
10、鸭肝微粒体亚型酶cyp3a4活性检测：在200μm底物睾酮中加入肝微粒体（0.1mg/ml），ph7.4的pbs缓冲液补足500μl，37℃预孵育5min，加入终浓度为1mm的nadph再生系统启动反应。37℃水浴20min后，加入0.5ml冰冷乙酸乙酯（含内标非那西丁），斡旋终止反应，12000r/min离心10min，取上清上机检测，流动相为水-乙腈=50:50，检测波长为254nm，柱温为25℃，流速为1ml/min，色谱柱为hypersilc18（250mm×4.6mm、5μm）；
11、鸭肝微粒体亚型酶cyp2e1活性检测：在300μm底物氯唑沙宗中加入肝微粒体（0.1mg/ml），ph7.4的pbs缓冲液补足500μl，37℃预孵育5min，加入终浓度为1mm的nadph再生系统启动反应。37℃水浴40min后，加入0.5ml冰冷乙酸乙酯（含内标非那西丁），斡旋终止反应，12000r/min离心10min，取上清上机检测，流动相为甲醇-乙腈-水=40:20:40，检测波长为296nm，柱温为30℃，流速为1ml/min，色谱柱为hypersilc18（250mm×4.6mm、5μm）。
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。