一种带荧光标签的SRAP标记方法与流程

本发明涉及一种带荧光标签的SRAP标记(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。
背景技术：
：SRAP(Sequence－relatedamplifiedpolymorphism)是2001年美国加州大学的Li和Quiros[Lietal.TheoApplGenet,2001,103:455-461]开发的一种基于PCR的分子标记，它克服了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等标记的缺点，如:RFLP标记对DNA浓度、纯度的要求高；RAPD存在共迁移，无法鉴别杂合子和纯合子，稳定性和重复性差，且产率低；AFLP的成本昂贵且步骤复杂；SSR的引物开发耗时长等缺点。因此，SRAP分子标记具有经济、操作简便、产率高、稳定及便于克隆目标片断的特点，已广泛应用于遗传多样性分析、种质鉴定、比较基因组学和遗传连锁图的构建等研究。SRAP分子标记是对ORFs(Openreadingframes，开放式阅读框)通过特定的引物设计进行扩增。研究表明基因外显子G、C含量丰富，内含子A、T丰富。SRAP分子标记共有正向和反向两套引物。正向引物中使用“CCGG”序列，是为了使之特异结合开放阅读框区域中的外显子。由于不同个体中外显子序列通常是保守的、低多态性水平的，这使得外显子无法做为标记。富含AT的区域通常出现在启动子和内含子中，反向引物的核心序列为AATT，特异性结合AT富含区，扩增出基于内含子和外显子的SRAP多态性标记。不同的物种，不同的个体，由于内含子、启动子与间隔长度不同，而产生多态性扩增产物。引物是SRAP分子标记的关键。PCR反应体系中使用一对SRAP分子标记引物：正向引物长17bp，5`端的前10bp是一段非特异性的填充序列，紧接着是CCGG,它们一起组成核心序列,然后是靠着3`的是3个选择性碱基，3个可选择性的碱基是可以变化的，它的变化能产生一系列的引物，它们有着共同的核心序列。反向引物长18bp,即由5`的11个无特异性的填充序列和紧接着的AATT组成的核心序列,及3`的3个选择性碱基，对内含子和启动子区域进行特异扩增。SRAP分子标记最早是在芸薹作物中开发利用的，到目前为止，SRAP标记已在小麦、水稻、拟南芥、棉花、马铃薯、番茄、辣椒、芹菜等植物遗传多样性分析中得到广泛应用，具有重复性好、操作简便、共显性高、条带易分离等优点，适合遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质资源的鉴定评价、重要性状基因标记等生物学研究。发明人从2008年开始利用SRAP标记进行的遗传多样性、近等基因系的评价和遗传图谱的构建等研究，先后利用SRAP标记研究了中国半夏属植物的亲缘关系[欧阳钟鸣,赵静,彭正松,杨在君,魏淑红.中国半夏属植物亲缘关系的SRAP分析,植物科学学报,2012,30(2):116-121.]；利用SRAP标记评价了小麦三雌蕊近等基因系[杨在君,彭正松,周永红,彭丽娟,魏淑红.利用SRAP分子标记评价小麦三雌蕊近等基因系的遗传背景,2012,26(1):22-27.]；以及利用SRAP标记定位了小麦三雌蕊基因Pis1[文章已接受]。经过多年的研究，发明人发现，虽然SRAP标记具有众多的优点，但操作起来仍然比较耗时，这主要是受银染和显影耗时较长的影响，同时普通聚丙烯酰胺凝胶电泳一般使用1mm的胶，分辨率和稳定性都不太理想。因此，开发出操作简单、分辨率高和稳定性好SRAP标记(FluorescentSRAP,FSRAP)对遗传多样性研究、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种均具有重大的意义。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种新的带荧光标签的SRAP标记(FluorescentSRAP,FSRAP)方法。本发明带荧光标签的SRAP标记方法，其正向引物为带荧光标签的引物。优选地，所述荧光标签是IRDye700或IRDye800。所述标记方法的步骤如下：(1)提取待检样本中的DNA；(2)用正向引物为带荧光标签的引物对进行PCR扩增；(3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。步骤(2)中，所述扩增的体系为：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反应体系为10μL。步骤(2)中，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s,35℃复性60s,72℃延伸60s,共5个循环；94℃40s,50℃60s，72℃1min，共35个循环；72℃继续延伸10min,4℃保温。步骤(3)中，所述检测的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染电泳或利用遗传分析系统LI-COR4300电泳的方法。本发明还提供了一种鉴定小麦品种MY29和MY29TP的方法，它是采用采用SEQIDNO.3～6所示的引物对1(即以SEQIDNO.3所示引物为正向引物，SEQIDNO.6所示引物为反向引物)或者SEQIDNO.15～6所示的引物对2(即以SEQIDNO.15所示引物为正向引物，SEQIDNO.6所示引物为反向引物)，按照前述方法进行检测。本发明FSRAP检测方式于稳定性好、品种间多态性丰富、分辨率高，同时可以有效区分小麦的不同品种，检测快速，应用前景良好。下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。附图说明图1FSRAP正向引物结构图2FSRAP标记和普通SRAP标记比较。A:普通SRAP标记结果，B:FSRAP标记结果图3引物组合me1-em30扩增结果。M:marker，箭头所在位置表示差异条带图4利用FSRAP标记构建的小麦遗传图谱图5利用FSRAP标记鉴定小麦品种MY29和MY29TP具体实施方式1、下列实施例中所用实验材料、试剂与仪器如下：(1)实验材料小麦栽培品种绵阳29(MY29)由四川省农业科学院生物技术与核技术研究所的杨武云研究员提供。小麦三雌蕊近等基因系MY29TP及MY29×MY29TP杂交的F2群体(共200个单株)，均为发明人所在实验室培育。(2)所用试剂植物DNA提取试剂盒(多糖多酚样本)为Biotechnology品牌；50-700bpDNAmarker购自成都兰博生物科技有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；PCR反应所需试剂购自宝生物(大连)有限公司。(3)所用仪器BIO-RADT100PCR仪为BIO-RAD公司产品；NanoDrop2000超微量分光光度为Thermo公司产品；LI-COR4300遗传分析系统为LI-COR公司产品。2、DNA提取利用植物DNA提取试剂盒(Biotechnology)提取29(MY29)，MY29，MY29×MY29TP杂交的F2群体(200个单株)的DNA，具体操作参照试剂盒说明书。用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度。DNA溶液的ODA260/A280值应为1.8-2.0。3、引物序列本实施例中所用引物序列如表1所示，正向引物的5`端加上了一个荧光标签IRDye700或IRDye800。表1本实施例中所用引物序列实施例1FSRAP标记与普通SRAP标记的比较1、实验方法为验证FSRAP标记优于普通SRAP标记，以MY29和MY29TP为实验材料，选用相同引物序列的FSRAP引物和SRAP引物同时扩增MY29和MY29TP的基因组DNA，然后比较这两种引物的扩增条带。普通SRAP标记的实验流程参照发明人之前发表的文章进行[杨在君,彭正松,周永红,彭丽娟,魏淑红.利用SRAP分子标记评价小麦三雌蕊近等基因系的遗传背景,2012,26(1):22-27.]。FSRAP的PCR体系与普通SRAP的PCR体系完全一致，只是将正向引物换成带荧光标签的引物。具体为：PCR体系包括：1×PCRbuffer,Mg2+1.8mmol/L,dNTP0.15mmol/L，正反向引物各0.4μmol/L，DNA模板20ng,Taq酶1U，反应体系为10μL。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s,35℃复性60s,72℃延伸60s,共5个循环；94℃40s,50℃60s，72℃1min，共35个循环；72℃继续延伸10min,4℃保温。FSRAP标记的检测是利用LI-COR4300遗传分析系统进行。PAGE胶制备；将洗净晾干的BOROFLOAT玻璃装配好并以边条(0.25mm)隔开,小心套入制胶夹(GIBCO/BRL)中。准备就绪后用注射器将25ml变性凝胶混合液(8％聚丙烯酰胺，灌胶前加入200μl10％过硫酸铵和20μlTEMED，并迅速混匀)从制胶夹顶部缓缓注入最后插入梳子并加夹子保护，凝聚2h。电泳分离；从制胶夹取出胶板，取出梳子并反向插入，擦净玻璃外侧并固定于电泳槽上，上下槽各加500ml1×TBE缓冲液,接通电源1500V电压预电泳25min至电流为30mA，在PCR增产物中加入等体积的StopBuffer，94℃变性3min后立即冰浴冷却10min。预电泳完毕后冲洗点样孔，每孔加样0.5-0.7μl，1500V恒压电泳3h左右，电泳过程中通过LI-COR4300遗传分析系统的红外检测器对扩增产物进行实时检测，电泳结束后进行数据统计。2、实验结果以MY29和MY29TP为实验材料，利用引物组合me2-em13，me32-em13，me32-em14进行SRAP和FSRAP扩增，扩增产物分别利用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染和利用遗传分析系统LI-COR4300电泳，每个材料重复3次。结果如图2所示，FSRAP扩增的条带数目比普通SRAP多，且分辨率也较普通SRAP标记高，如：利用FSRAP标记me2-em13这对引物在MY29和MY29TP中有两个差异位点，而普通SRAP标记则看不出差异。实验结果说明，本发明FSRAP检测方式的灵敏度更高，更高更有效地扩增相关的条带，分辨率高。实施例2FSRAP标记的稳定性考察为了验证FSRAP标记的稳定性，用相同的引物(引物组合me2-em13，me32-em13，me32-em14)，扩增MY29和MY29TP的基因组DNA，重复3次，比较扩增条带是否存在差异，PCR反应和电泳具体操作参照实施例1。稳定性考察结果如图2B所示，同一材料利用相同引物进行3次PCR扩增，扩增出的条带完全一致，这说明FSRAP标记的稳定性较好。实施例3利用FSRAP标记构建小麦的遗传图谱筛选在MY29和MY29TP中存在差异的FSRAP引物，利用筛选出的FSRAP标记对MY29×MY29TP杂交的F2群体进行PCR扩增，扩增产物经LI-COR4300遗传分析系统检测后，统计出差异条带，PCR反应和电泳具体操作参照实施例1。采用JoinMap4.0软件构建小麦的FSRAP遗传图谱。电泳结果如图3所示。共有13个FSRAP标记上图，这13个标记分别属于4个连锁群，其中最多的是第2连锁群，含5个标记；最少的是第4连锁群，仅2个标记(图4)。实施例4利用FSRAP标记鉴定小麦品种MY29和MY29TPMY29和MY29TP为近等系，二者具有相似的农艺性状，因此在抽穗前无法通过形态学特征对MY29和MY29TP进行鉴定，为此，我们开发出适用于MY29和MY29TP苗期鉴定的FSRAP标记。用于鉴定FSRAP标记的引物序列如表2所示。表2本实施例中用于MY29和MY29TP鉴定的FSRAP标记引物引物组合正向引物Me反向引物Emme2-em13IRDye700-TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTACGme32-em13IRDye700-TGAGTCCAAACCGGGCTGACTGCGTACGAATTACG电泳结果如图5所示，me2-em13引物组合能在MY29中扩增出100bp左右的特异性条带，在MY29TP中扩增出150bp特异性条带。me32-em13引物组合能在MY29中扩增出350bp左右的特异性条带。经过多次重复试验证明这两对引物在MY29和MY29TP中扩增条带非常稳定，因此可用于MY29和MY29TP的鉴定。本实施例仅提供了一种小麦品种鉴定方法，利用该方法也可进行小麦产量性状、抗病性、抗逆性的鉴定。综上，本发明FSRAP检测方式于稳定性好、品种间多态性丰富、分辨率高，同时可以有效区分小麦的不同品种，检测快速，应用前景良好。SEQUENCELISTING<110>西华师范大学<120>一种带荧光标签的SRAP标记方法<130>GY493-16P1614<160>15<170>PatentInversion3.5<210>1<211>17<212>DNA<213>Me1<400>1tgagtccaaaccggata17<210>2<211>18<212>DNA<213>Em5<400>2gactgcgtacgaattaac18<210>3<211>17<212>DNA<213>Me2<400>3tgagtccaaaccggagc17<210>4<211>18<212>DNA<213>Em8<400>4gactgcgtacgaattctg18<210>5<211>17<212>DNA<213>Me4<400>5tgagtccaaaccggacc17<210>6<211>18<212>DNA<213>Em13<400>6gactgcgtacgaattacg18<210>7<211>17<212>DNA<213>Me6<400>7tgagtccaaaccggtaa17<210>8<211>18<212>DNA<213>Em14<400>8gactgcgtacgaattatg18<210>9<211>17<212>DNA<213>Me8<400>9tgagtccaaaccggtgc17<210>10<211>18<212>DNA<213>Em23<400>10gactgcgtacgaatttaa18<210>11<211>17<212>DNA<213>Me9<400>11tgagtccaaaccggaac17<210>12<211>18<212>DNA<213>Em30<400>12gactgcgtacgaatttca18<210>13<211>17<212>DNA<213>Me10<400>13tgagtccaaaccggatg17<210>14<211>18<212>DNA<213>Em36<400>14gactgcgtacgaattgga18<210>15<211>17<212>DNA<213>Me32<400>15tgagtccaaaccgggct17当前第1页1 2 3