特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用的制作方法

本发明涉及一种外来入侵植物病害的检测技术，特别涉及一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用。

背景技术：

螺原体是一种直径约为100～250nm，基本形态为螺旋形的无细胞壁的原核微生物。1973年建立了螺原体属(Spiroplasma)，目前发现的螺原体，根据血清学特性将其分为34个血清组，并已确立了37个螺原体种。螺原体和宿主的关系可分为共生(Mutualism)、互生(Commensalism)和致病(Pathogenic)3种，其中致病螺原体可导致蜜蜂的“五月病”和“爬蜂病”，虾蟹颤抖病，柑橘僵化病(Citrus stubborn)、玉米矮缩病等，对蜜蜂业、水产养殖业和农业生产造成严重影响。

植物螺原体主要存在于植物筛管部和吸食植物汁液的昆虫体内，这些昆虫只是螺原体传播的媒介，绝大多数植物病原性的螺原体对介体昆虫并不致病。柑橘僵化病是由韧皮部限制的螺原体(Spiroplasma citri)引起的，田间通过柑橘叶蝉传播的。病原感染大多数柑橘品种和栽培品种，主要分布在热带和干旱的柑橘种植区，包括美国加利福尼亚、亚利桑那州，北非，东地中海盆地和中东。受侵染的柑橘导致严重发育不良，叶片致密且异常直立，叶片褪绿，类似营养缺乏症状，后期造成严重的产量损失。

螺原体由于没有细胞壁、个体微小，相比于其它微生物，螺原体的分离、显微镜检查等方法都比较困难，国内除王文等对虾蟹中的螺原体研究较深入外，其它种类螺原体仅限于分离鉴定和生物学特性的研究。2004年王文等基于细菌16S rDNA，利用PCR技术检测河蟹颤抖病的病原，研究发现病原是一个螺原体新种，命名为中华绒螯蟹螺原体；2012年李霞等利用细菌的16S rDNA通用引物扩增并测序比对，检测到蜜蜂中的一株新的致病螺原体。目前螺原体的检测主要是基于细菌的16S rDNA序列，首先需要进行螺原体的培养，再提取螺原体的DNA，然后利用细菌通用引物进行PCR扩增，最后需要进一步的测序比对验证试验结果。为进一步提高特定螺原体的检测效率和灵敏度，还需要探索寻找其它基因或核酸片段应用于特定螺原体的特异检测，无需进行繁琐的螺原体培养过程，直接从宿主总DNA中特异检测螺原体病原。

柑橘螺原体已经列入中国外来入侵物种数据库，柑橘僵化病在国内尚未见田间报道，随着全球经济一体化进程加快，需要加强对外来柑橘病害的检疫检测，一套良好的柑橘螺原体检测方案对病原体的检测以及病害的预防和控制都非常重要。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对。

本发明的另一目的在于提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对或试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对，该引物对是基于柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列设计的特异性PCR引物对，其序列如下：

上游引物Scf：5'-CACCTGCAACTGTAGCAACA-3'；(SEQ ID No：1)

下游引物Scr：5'-TGCAGCATTCATCCCTTGTG-3'。(SEQ ID No：2)

本发明还提供一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒，包括上述引物对。

所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对在柑橘僵化病病原检测中的应用。

所述的特异性快速检测柑橘僵化病病原的试剂盒在柑橘僵化病病原检测中的应用。

一种特异性快速检测柑橘僵化病病原的方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘基因组DNA；

(2)以步骤(1)得到的柑橘基因组DNA为模板，利用SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所述的引物对进行PCR反应；

(3)将步骤(2)得到的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；若扩增到目标条带，则为阳性，即感病；若未扩增到任何条带，则为阴性，即健康。

所述的柑橘基因组DNA采用改良的CTAB法提取柑橘基因组DNA，包括如下步骤：

(1)取柑橘病叶200mg，置于研钵中加液氮研磨成粉状；

(2)迅速加入65℃预热的抽提缓冲液2×CTAB(2％CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCL，pH8.0，用前加0.2％巯基乙醇)600μL，稍作研磨混匀；

(3)研磨液转入1.5mL离心管中，65℃水浴30min，期间不时摇匀。

(4)加入600μL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈振荡2分钟，12000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。

(5)加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，温和混匀，12,000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。

(6)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，混匀，置-20℃20min。

(7)4℃下12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇各洗一次，室温下风干，沉淀溶于200μL TE(100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0)中保存。

所述的PCR反应体系，如下：

所述的PCR反应条件，如下：

所述的目的条带为扩增的柑橘僵化病病原(Spiroplasma citri)的膜蛋白基因序列，如SEQ ID No：3所示：(818bp)

CACCTGCAACTGTAGCAACAGCAAACCCAAAACAAGTTACAAACGCTGAAATTAAAACAGCGTTAGAAGCTAATGTTTTAAAAGCAGTGCAAGGAGTTGTAAAAACAGCAACAGCAGCTGATTTTCAATTTGATGTTTATCAAGACAACGAAGGTACATCATTAACAACAATTAATTTACAAGGAGGTAACGTTGAAGTTTATGTTCAAATTACTCCAGCAAAAGATAAAACTGTTGTTATTGGTAAAACAGGATACATTAAAGTAACTTTACCAAAAATAAAAGTAGATATTTCAAGTGTAGTAATAAATCAACAAATTGTAGAAATTAAAGCAGCAGACCCAAAACAAGTTACAAAAGATGAGTTAAATGCAGTTAATACTTATGCAACTCTTGCAAGTGCTGTTTTAGAGGCTATAAAAAATAAAGCACCAAATGCAGGAGCAAGTGATTTTGAAATTACAAATAATTGTGATGCGGGAAACTATTCAGAACAAAAAGATGTTAAAGTAACAGTTAAAGCAAAAGATGAATCACCAAACATTTCTGGTGAATTTAAAGTTAATGCAAAAGTAAAAGCTATATTAGCACCAGCAAATGCAGGATAAGAATTAACTTTTTCTTATTTAGAACAAAATAAAAAACACTTATTAAAGTGTTTTTTATGTTTTTTAGTTAAAAAAATCTTTACAATCTTAGAATATCAACTAAAATTAATATAAACAAGATAAAACAAGCAAAAGAGAAGGAGAAAAAGCATGCTTAAAAAAATTGGAATTTTAACATCTGGTGGTGATTCACAAGGGATGAATGCTGCA。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明能够特异性检测柑橘螺原体(Spiroplasma citri)，无需进行螺原体的分离培养，可以直接从柑橘总DNA中检测病原。

(2)本发明检测灵敏度高，可检测低至10^-5ng/μL的柑橘总DNA中的螺原体。

(3)本发明检测耗时较短，经济适用，总体流程在3～4小时，单个样品的检测费用成本仅5～6元。

附图说明

图1是PCR特异性检测柑橘螺原体的结果；其中，M泳道，2000bp的DNA Marker；泳道1，阳性对照；泳道2，阴性对照；泳道3，模板为柑橘感病叶片DNA；泳道4，模板为柑橘健康叶片DNA。

图2是PCR检测柑橘螺原体灵敏度试验结果；其中，M泳道，2000bp的DNA Marker；泳道1，10^-1ng/μL感病柑橘DNA；泳道2，10^-2ng/μL感病柑橘DNA；泳道3，10^-3ng/μL感病柑橘DNA；泳道4，10^-4ng/μL感病柑橘DNA；泳道5，10^-5ng/μL感病柑橘DNA；泳道6，10^-6ng/μL感病柑橘DNA；泳道7，10^-7ng/μL感病柑橘DNA。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：柑橘螺原体的检测

1、提取柑橘基因组DNA

采用改良的CTAB法提取柑橘基因组DNA。

(1)取柑橘病叶/健康叶200mg，置于研钵中加液氮研磨成粉状。

(2)迅速加入65℃预热的抽提缓冲液2×CTAB(2％CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCL，pH8.0，用前加0.2％巯基乙醇)600μL，稍作研磨混匀。

(3)研磨液转入1.5mL离心管中，65℃水浴30min，期间不时摇匀。

(4)加入600μL氯仿/异戊醇(24:1)，剧烈振荡2分钟，12000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。

(5)加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，温和混匀，12,000rpm，离心5min，取上清液置于新的离心管中。

(6)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积冷无水乙醇，混匀，置-20℃20min。

(7)4℃下12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀分别用70％乙醇和无水乙醇各洗一次，室温下风干，沉淀溶于200μL TE(100mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0)中保存。

2、配置PCR反应体系

PCR反应体系：

3、设置PCR反应条件

在PCR仪上设置如下的反应条件：

4、凝胶电泳及观察

取5μL PCR产物与1μL 6×载样液混匀，采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图1：泳道1，阳性对照；泳道2，阴性对照；泳道3，模板为柑橘感病叶片DNA；泳道4，模板为柑橘健康叶片DNA。以阳性对照、感病叶片DNA为模板，均扩增到818bp的目标条带；以阴性对照、健康叶片DNA为模板，均未扩增到任何条带。

实施例2：PCR检测灵敏度试验

1、DNA梯度稀释

利用紫外分光光度计测量柑橘样品的DNA浓度，然后用灭菌的ddH₂O将柑橘DNA浓度稀释至10ng/μL，10ng/μL的柑橘DNA经10倍梯度稀释后，分别作为PCR的扩增模板。

2、PCR扩增

PCR反应体系及条件同实施例1。

3、凝胶电泳及观察

取5μL PCR产物与1μL 6×载样液混匀，采用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图2：泳道1～7，模板分别为10^-1ng/μL～10^-7ng/μL的感病柑橘DNA。检测结果显示：经过10^-5稀释的感病柑橘DNA(10^-5ng/μL)，仍可检测到较为明亮的目的条带(818bp)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院植物保护研究所

<120> 特异性快速检测柑橘僵化病病原的引物对及试剂盒与应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物Scf

<400> 1

cacctgcaac tgtagcaaca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物Scr

<400> 2

tgcagcattc atcccttgtg 20

<210> 3

<211> 818

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增的柑橘僵化病病原（Spiroplasma citri）的膜蛋白基因序列

<400> 3

cacctgcaac tgtagcaaca gcaaacccaa aacaagttac aaacgctgaa attaaaacag 60

cgttagaagc taatgtttta aaagcagtgc aaggagttgt aaaaacagca acagcagctg 120

attttcaatt tgatgtttat caagacaacg aaggtacatc attaacaaca attaatttac 180

aaggaggtaa cgttgaagtt tatgttcaaa ttactccagc aaaagataaa actgttgtta 240

ttggtaaaac aggatacatt aaagtaactt taccaaaaat aaaagtagat atttcaagtg 300

tagtaataaa tcaacaaatt gtagaaatta aagcagcaga cccaaaacaa gttacaaaag 360

atgagttaaa tgcagttaat acttatgcaa ctcttgcaag tgctgtttta gaggctataa 420

aaaataaagc accaaatgca ggagcaagtg attttgaaat tacaaataat tgtgatgcgg 480

gaaactattc agaacaaaaa gatgttaaag taacagttaa agcaaaagat gaatcaccaa 540

acatttctgg tgaatttaaa gttaatgcaa aagtaaaagc tatattagca ccagcaaatg 600

caggataaga attaactttt tcttatttag aacaaaataa aaaacactta ttaaagtgtt 660

ttttatgttt tttagttaaa aaaatcttta caatcttaga atatcaacta aaattaatat 720

aaacaagata aaacaagcaa aagagaagga gaaaaagcat gcttaaaaaa attggaattt 780

taacatctgg tggtgattca caagggatga atgctgca 818