一种检测多指畸形GLI3基因突变的PCR引物、探针及荧光定量PCR检测方法与流程

本发明涉及人基因组DNA突变检测技术领域，具体涉及一种检测多指畸形GLI3基因突变的PCR引物、探针及荧光定量PCR检测方法。

背景技术：

多指(趾)畸形（polydactyly，PD）是以手/足有一个或者多个额外的指(趾)样赘生物为特征，可以单发或多发畸形的形式出现，是我国常见的先天畸形之一。根据中国出生缺陷监测网的资料，其发生率一直居于前三位。国内外报道的发生率在 5/万-19/万之间，存在明显的种族和地理差异。

从目前报道的病例中我们发现，PD往往是孤立的症状，合并其它肢体器官畸形较少见。赘指虽多数没有功能或功能受限，但却严重影响相邻健指的功能及形态。另一方面，PD 患儿常因此被同龄人孤立，长期以往容易形成内向自卑性格，影响与人交往，甚至影响恋爱、工作及婚姻。目前我国产前诊断技术尚不成熟，尽管超声检查具有无创、快速等特点，但 PD 的产前诊断受仪器的分辨率以及切面定位、胎儿宫内姿势以及超声检查人员水平的限制，诊断率仅能达到 60%-70%。

目前多指的治疗主要以手术切除为主，部分复杂类型尚需截骨及肌腱移位等功能重建，平均住院手术及后继治疗费用约 4500 元/例。而庞大的患者人群，将会对家庭及社会造成沉重的经济负担。若能在多指的基因诊断上取得突破，可以做出早期产前诊断，将能节省很大的医疗资源及经济负担。

根据国内外的文献报道，GLI3基因（NM_000168）多个位点的突变与多指畸形密切相关。本研究团队在多指畸形患者的DNA中发现了一个GLI3基因的新突变，编码区4507位碱基由C突变成T，在正常人群中未检测到该突变。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测多指畸形GLI3基因突变的PCR引物、探针及荧光定量PCR检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测多指畸形GLI3基因突变的PCR引物，包括用于扩增GLI3基因基因多态位点的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：

Ltbp1F：5'- GTGACAAGCACAGTGGACAGC -3'

Ltbp1R：5'-GCCCTGAGCCCAAGTATCTTC-3'。

一种检测多指畸形GLI3基因突变的探针，包括用于检测GLI3基因基因多态位点的2条探针，每一条探针包含13-25个碱基的序列，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有MGB基团标记。

优选的，所述2条探针的序列分别为：

Ltbp1G：5'-VIC-AGGGGTATAGATTGACTTCG-MGB-3'

Ltbp1C：5'-FAM-AGGGGTACAGATTGACTTC-MGB-3'。

一种检测多指畸形GLI3基因突变的试剂盒，包括上述所述的PCR引物和上述所述的探针。

一种用于非治疗目的检测多指畸形GLI3基因突变的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）提取模板DNA：从病人的血液中提取模板DNA；

（2）配制PCR反应液：设计引物和探针，配制25μL/人份的PCR反应液；

（3）PCR扩增：将上述PCR反应液进行PCR扩增。

优选的，所述步骤（2）中，每人份的PCR反应液中各成份及浓度分别为：2条引物浓度分别为0.1μmol/L、2条探针浓度分别为0.2μmol/L、Taq酶浓度为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2浓度为1.5mmol/L、dNTP浓度分别为0.2mmol/L each、模板DNA浓度为1-10ng/μL。

优选的，所述步骤（3）中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次；72℃再延伸5分钟。

本发明的有益效果在于：本发明的PCR引物特异性好；本发明的探针特异性好，检测灵敏精确；本发明的试剂盒可以检测多指畸形GLI3基因多态性，准确性好，灵敏度高。本发明的荧光定量PCR检测方法可以检测多指畸形GLI3基因多态性，准确性好，灵敏度高，步骤简单，操作控制方便，检测效率高。

附图说明

图1是本发明检测多指畸形GLI3基因多态性样本结果示例，其基因型为：Ltbp1GG纯合子；

图2是本发明检测多指畸形GLI3基因多态性样本结果示例，其基因型为：Ltbp1CC纯合子；

图3是本发明检测多指畸形GLI3基因多态性样本结果示例，其基因型为：Ltbp1GC杂合子。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-3对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

一种检测多指畸形GLI3基因突变的PCR引物，包括用于扩增GLI3基因基因多态位点的1对共2条引物，2条引物的序列分别为：

Ltbp1F：5'- GTGACAAGCACAGTGGACAGC -3'

Ltbp1R：5'-GCCCTGAGCCCAAGTATCTTC-3'。

一种检测多指畸形GLI3基因突变的探针，包括用于检测GLI3基因基因多态位点的2条探针，每一条探针包含13-25个碱基的序列，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有MGB基团标记。

所述2条探针的序列分别为：

Ltbp1G：5'-VIC-AGGGGTATAGATTGACTTCG-MGB-3'

Ltbp1C：5'-FAM-AGGGGTACAGATTGACTTC-MGB-3'。

一种检测多指畸形GLI3基因突变的试剂盒，包括上述所述的PCR引物和上述所述的探针。

一种用于非治疗目的检测多指畸形GLI3基因突变的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

（1）提取模板DNA：从病人的血液中提取模板DNA；

（2）配制PCR反应液：设计引物和探针，配制25μL/人份的PCR反应液，每人份的PCR反应液中各成份及浓度分别为：2条引物浓度分别为0.1μmol/L、2条探针浓度分别为0.2μmol/L、Taq酶浓度为0.1U/μL、1×PCR Buffer、MgCl2浓度为1.5mmol/L、dNTP浓度分别为0.2mmol/L each、模板DNA浓度为1-10ng/μL；

（3）PCR扩增：将上述PCR反应液进行PCR扩增，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，循环35次；72℃再延伸5分钟。

如图1-3所示，若结果中只能看到某一条扩增曲线，则表明该样本为该条探针所代表的纯合子；若结果中有两条扩增曲线，则表明该样本为这两条探针所代表的杂合子。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。