本发明涉及一种来源于嗜热子囊菌(thermoascusaurantiacus)的糖苷水解酶家族第10家族的木聚糖酶基因及其编码酶在毕赤酵母中的异源表达，属于生物工程技术领域。
背景技术：
内切β-1,4-d-木聚糖酶(endo-β-1,4-d-xylanase,ec3.2.1.8)简称木聚糖酶。它是一类以内切方式水解木聚糖中的β-1,4糖苷键，其水解产物主要是寡糖和少量木糖。在半纤维素类生物资源转化和利用中，木聚糖酶是必不可少的有效生物催化剂。木聚糖酶在食品、饲料、造纸有广泛的应用。然而，自然存在的大多数木聚糖酶的性质往往不能满足工业生产要求，特别是生产中的高温、耐碱等极端环境。因此，耐热木聚糖酶的研究和开发具有较高的应用价值。
从嗜热子囊菌(thermoascusaurantiacus)中分离的木聚糖酶具有较高的比活性和热稳定性，在70℃条件下保温8h不影响其酶活性；在生物技术应用中展现出较大吸引力。为了进一步改善热稳定性，研究者通过将其编码基因在大肠杆菌中进行异源表达或者使用定向突变的技术改善酶的产量和热稳定性。然而，重组酶在大肠杆菌中的表达产物热稳定性并未提高。
巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其他表达系统相比，其在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化等方面有明显的优势。翻译后修饰和糖基化往往会影响异源表达酶的结构，进而影响其生物学功能，是酶工程领域获得改良酶产品的重要技术手段之一。密码子使用偏好与基因表达紧密关联，按照密码子的偏好性，对外源蛋白编码基因进行密码子优化可以有效提高外源蛋白的表达量甚至影响蛋白功能。因此，巴斯德毕赤酵母成为耐热木聚糖酶异源表达的优良宿主。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种来源于嗜热子囊菌的耐热β-1,4-内切木聚糖酶基因xyna及其重组酶xyna在毕赤酵母中的异源表达，为该酶的产业化生产奠定理论基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
将源自嗜热子囊菌的耐热β-1,4-内切木聚糖酶的基因根据毕赤酵母密码子偏好性进行序列优化，优化后基因命名为xyna，其核苷酸序列为seqidno:1；编码的蛋白质为xyna，其氨基酸序列为seqidno:2；将该优化基因在毕赤酵母gs115中进行分泌表达，并对表达产物进行活性测定及酶学性质分析。
所述的xyna是一种来源于嗜热子囊菌thermoascusaurantiacusnbrc9748的耐热木聚糖酶基因，密码子优化后的基因序列已提交genbank(登录号为mf072723)，优化后的基因在毕赤酵母中异源表达，其重组蛋白xyna的热稳定性较好，具有适合于工业应用的理想特性。
本发明保护该种耐热木聚糖酶，其氨基酸序列为seqidno.2所示。
本发明还保护该耐热木聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列为seqidno.1所示。
本发明亦保护该耐热木聚糖酶编码基因的重组载体和重组菌株。
本发明还提供制备该种耐热木聚糖酶的方法，包括以下步骤：
(1)以权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞；
(2)培养所述宿主细胞；
(3)分离纯化耐热木聚糖酶。
其中，步骤(1)和(2)所述的宿主细胞为毕赤酵母gs115细胞。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种源自嗜热子囊菌的第10家族耐热木聚糖酶基因及其重组酶在毕赤酵母的异源表达。其相应的基因为xyna；重组酶xyna的表观分子量为75kda；重组酶发酵粗酶活为40u/ml；分子筛层析后的纯酶比活为1053u/ml；xyna的最适反应温度为75℃；在100℃下保温3h，残余酶活为86.5％，表明该酶的热稳定性较好。xyna的最适ph为8.0，在ph4.0～10.0范围内较为稳定；金属离子对该酶活性影响较小。本发明为该酶的产业化生产奠定了理论基础，有较大的工业化应用潜力及经济价值，也为其它耐热木聚糖酶的研究奠定了理论基础。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
实施例1重组质粒pgem-t-xyna的构建
为实现来源于嗜热子囊菌的耐热木聚糖酶基因xyna在毕赤酵母中的高效表达，对基因序列进行毕赤酵母密码子优化，将其命名为xyna。在其基因两端分别加入ecori和noti限制性酶切位点，经人工合成后克隆至pgem-t质粒。重组质粒转化e.colixl10-gold感受态细胞,经酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得重组质粒pgem-t-xyna。
实施例2重组表达质粒的构建
将上述得到的重组质粒pgem-t-xyna进行ecori和noti双酶切，割胶回收目的基因xyna，与经同样双酶切的表达质粒pgapzαa连接，转化e.colixl10-gold感受态细胞，经pcr筛选鉴定后送上海生工测序，获得重组质粒pgapzαa-xyna。将测序正确的重组质粒pgapzαa-xyna进行sali线性化处理，再经电击转化法导入毕赤酵母gs115感受态细胞中。转化子涂布于含博莱霉素的ypd平板，经pcr筛选出高拷贝阳性转化子，阳性转化子命名为rx8。
实施例3重组木聚糖酶的表达与纯化
将rx8接种于5mlypd培养基中，于30℃，250rpm/min振荡培养12h。以1％的接种量转接于100mlypd培养基中，振荡培养96h。发酵液离心后的上清液为粗酶液，使用分子筛层析的方法纯化该酶。
实施例4重组木聚糖酶xyna酶学属性测定
1.酶活与分子量
木聚糖酶酶活测定采用dns法。在标准反应条件下，一个酶活性单位(u)定义为每分钟产生1μm还原糖所需的酶量。结果显示，dns法测定粗酶液的木聚糖酶活性为40u/ml。使用分子筛层析的方法纯化该酶，重组酶的比酶活为1053u/mg。
sds-page分析显示重组酶的表观分子量为75kda。
2.酶的最适温度及热稳定性
取适当重组酶稀释液于不同温度下(30～100℃)测定酶活性，以酶活力最高者为100％，获得重组酶的最适反应温度。将酶液置于不同温度下保温0～4h，参照标准方法测定残余酶活，未处理酶液的酶活力为100％。当残余酶活达到85％以上，定义为稳定。结果显示，该酶的最适反应温度为75℃，在100℃处理3h后，残余酶活性为86.5％。
3.酶的最适ph与ph稳定性
在最适温度下，测定不同ph值(ph3.0～ph11.0)条件下木聚糖酶的酶活性。以酶活力最高者为100％，绘制ph-相对酶活性曲线，获得最适ph。将粗酶液在不同的ph值，在75℃中保温4h，测定残余酶活性，以未处理酶液的酶活性为100％。当残余酶活达到85％以上，即定义为稳定。结果显示，重组木聚糖酶的最适ph为8.0，在ph4.0～10.0的范围内较为稳定。
4.金属离子对酶活性的影响
将酶液与不同金属离子溶液混合，终浓度为5mm，30℃，保温1h，参照常规方法测定残余酶活性，以不加金属离子的酶活性定义为100％。结果显示，金属离子对该酶的活性影响较小。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
<110>安徽医科大学
<120>一种耐热木聚糖酶及其编码基因
<130>1
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>987
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atggtgaggccaacaatcctattgacatccctacttcttgctccattcgcagccgcctct60
cctatattggaggaaagacaggcagcacaatctgtcgatcaactaatcaaggctagagga120
aaggtctacttcggtgttgctactgatcagaacagattgacaaccggtaaaaacgctgca180
atcatccaggcagatttcggtcaggttactcctgaaaactccatgaagtgggatgctaca240
gagccaagtcaaggaaatttcaacttcgcaggagctgattacttggttaactgggctcag300
caaaacggcaaattgatcaggggtcatacattggtctggcattcccaattgccaagttgg360
gtttcatccattactgacaagaacaccttaaccaacgtcatgaagaaccacataaccacc420
ctaatgacccgttacaagggcaagatccgtgcttgggatgttgttaacgaggctttcaac480
gaagacggttctttgagacaaaccgtgttccttaacgtcatcggtgaagattacattcca540
atcgcatttcaaaccgcaagagccgccgatccaaatgctaagttatacattaacgactac600
aatttggactccgcttcctaccctaagactcaagctatcgtcaatagagtcaagcaatgg660
agagccgctggtgtgccaattgatggtattggttctcaaacccacctaagtgctggtcaa720
ggtgctggtgttttgcaagcattacctttgttagcttctgctggtactccagaagtggct780
attactgaattggacgttgccggtgcctctccaactgactatgttaatgttgtcaacgcc840
tgtttaaacgttcagtcatgcgttggtattaccgtttggggtgtggccgaccctgactct900
tggagagcttcaactactccattgttgtttgacggcaattttaacccaaaaccagcctat960
aatgccattgtgcaagacttgcaacaa987
<210>2
<211>329
<212>prt
<213>人工序列
<400>2
metvalargprothrileleuleuthrserleuleuleualaprophe
151015
alaalaalaserproileleuglugluargglnalaalaglnserval
202530
aspglnleuilelysalaargglylysvaltyrpheglyvalalathr
354045
aspglnasnargleuthrthrglylysasnalaalaileileglnala
505560
asppheglyglnvalthrprogluasnsermetlystrpaspalathr
65707580
gluproserglnglyasnpheasnphealaglyalaasptyrleuval
859095
asntrpalaglnglnasnglylysleuileargglyhisthrleuval
100105110
trphisserglnleuprosertrpvalserserilethrasplysasn
115120125
thrleuthrasnvalmetlysasnhisilethrthrleumetthrarg
130135140
tyrlysglylysileargalatrpaspvalvalasnglualapheasn
145150155160
gluaspglyserleuargglnthrvalpheleuasnvalileglyglu
165170175
asptyrileproilealapheglnthralaargalaalaaspproasn
180185190
alalysleutyrileasnasptyrasnleuaspseralasertyrpro
195200205
lysthrglnalailevalasnargvallysglntrpargalaalagly
210215220
valproileaspglyileglyserglnthrhisleuseralaglygln
225230235240
glyalaglyvalleuglnalaleuproleuleualaseralaglythr
245250255
progluvalalailethrgluleuaspvalalaglyalaserprothr
260265270
asptyrvalasnvalvalasnalacysleuasnvalglnsercysval
275280285
glyilethrvaltrpglyvalalaaspproaspsertrpargalaser
290295300
thrthrproleuleupheaspglyasnpheasnprolysproalatyr
305310315320
asnalailevalglnaspleuglngln
325