猪CLIC4基因作为免疫性状相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及猪clic4基因作为免疫性状相关的分子标记及其应用。

背景技术：

我国是一个发展中国家，也是一个农业大国，在改革开放的推动下，我国的农业也在走向现代化。尤其是畜牧业，因为人们生活水平的提高，对肉类需求量的加大，让畜牧业得到了迅速的发展，现在其已成为支撑我国经济发展的重要力量之一。

在畜牧业发展迅速的同时，疾病对养殖业来说，一直是一个难以彻底解决的问题，它不仅影响到猪的养殖质量，而且还对养猪市场的发展有一定的阻碍(夏宗成等，2016)。由于人们对肉类需求的增加，随之出现了更多的猪场，但是猪场的养殖水平参差不齐。在很多小型猪场中，养殖人员缺乏专业的生产养殖和治疗疾病的知识，导致产生了很多新的疾病，这对整个养殖业造成了很大的损失。如今由于抗生素的滥用，细菌的变异程度更加复杂，一些疾病很难治愈。而且一旦出现大范围的猪流行病的爆发，更会造成巨大的损失。我们现在对猪的疾病，主要是采取预防和治疗两种方式。在预防方面，主要是采取对猪场环境的消毒和对猪进行疫苗接种。然而在实际的预防实践中，对猪接种疫苗的时候依然会出现猪群死亡或者未产生免疫相关抗体的情况。这些问题的主要原因是个体状况不同所导致的(王泽岩等，2013)。猪的免疫情况主要是由遗传因素所决定的，如今动物的品种繁多，产生的免疫应答也各有不同。在实际的应用中，还存在同一品种的不同个体，对相同疫苗的免疫反应各不相同，而且有的个体还存在先天免疫疾病，从而无法抵抗病菌。在实际的接种过程中，会对猪造成惊吓，这会造成部分猪的应激，不仅有可能会导致免疫的失败，而且还会影响到猪的生长状况。所以虽然打疫苗可以在一定程度上增加猪的免疫力，但是我们也要对多方面的情况进行考虑。在疾病的治疗方面，由于在用药方面缺少详细的规定，导致养殖场在治疗猪病的时候大量使用抗生素，久而久之细菌就产生了耐药性，使药物对很多疾病的治疗效果下降。最近几年，在猪中流行的传染病主要是对猪的免疫系统进行破坏，从而进一步导致多种细菌的感染以及一些病原体的变异等。由于这些新出现的病菌缺乏相对有效的治疗方法，所以它们最终对养殖业造成了巨大的损失。尤其是一些小的不正规的猪场，一旦猪场爆发流行病，就难以应对，最终可能面对倒闭的风险。所以用药物对猪病进行治疗，只能治标不治本。要想有效的防治猪病的发生，需要用科学的养殖方法。在国外比较先进的养殖方法是注重猪的健康程度，注重从源头上——也就是猪本身来解决问题。只有猪自身条件好，才能更好的养殖，进而更好的抵抗疾病(王金利，2016)。我们应该树立健康养殖的理念，要选好猪，才能养好猪(郭雪峰，2010)。在对猪的选择方面，我们可以利用现在新的选种育种技术，将最新的理论结合到实践当中，从源头上选择品质优良的猪种。如今在正规的大型养殖场中，均有对应的选种育种的指导人员，他们利用新的选种技术淘汰掉带有致病基因的猪，做到从源头上防治疾病。在本申请中，我们发现在猪的clic4基因中有一个snp位点，其和免疫性状嗜碱细胞数百分比呈极显著相关。因此其可以用作群体育种的分子标记，在疾病预防中，可以对猪群进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，选种效率和准确性，从而降低疾病发生率。该分子标记技术在动物育种中，具有广阔的应用价值。

clic4基因翻译后的clc4蛋白属于氯离子通道蛋白家族(clics)中的一种。氯离子是细胞跨膜运输的必需电解质成分，广泛存在于机体的各个细胞之中，而运输氯离子的通道称为氯离子通道。氯离子通道是分布在细胞膜或细胞器膜上的一类跨膜蛋白质，对跨膜运输的氯离子以及其他一些阴离子具有通透性。氯离子通道有几种不同的种类，其中胞内氯离子通道(clic)是氯离子通道的一种，其存在于细胞内。在当前的研究中，根据clic蛋白之间的同源性关系，可将其分为三类。第一类有clic1、clic2、clic-kb和clic-ka，它们主要存在于细胞质膜上，clic3、clic4和clic5属于第二类蛋白；而clic6和clic7则属于第三类蛋白，主要存在于胞内膜之上。clic蛋白具有可以存在于膜结合状态下，和水溶性状态下的特性，依靠这个特性，clic在机体的很多细胞中都广泛分布存在着。clic蛋白家族参与了细胞生命代谢活动的许多过程，例如信号的转导，细胞骨架的形成，以及细胞凋亡的发生。这些年来，越来越多的的科学研究证据发现，氯离子通道蛋白家族(clics)在参与疾病的预防方面具有重要的作用(ensselense,brady-kalnaysm，2004)。clic发生障碍时会导致某些疾病的发生,例如肌强直、dent’s病还有囊性纤维化这些疾病(姚勤，2009)。目前有很多研究都是针对clic1蛋白，而且clic1与疾病之间的关系以及其在各种癌症和肿瘤中有什么作用的研究，还在进行中。已有的研究中报道称，clic1蛋白在肝癌细胞中(jannotg等，2010)、结肠癌患者(songb等，2005)、胃癌、大肠癌和乳腺癌中都有明显的过表达现象(hezy等，2010)。可见clic1蛋白在上述肿瘤和癌症的治疗中都具有一定的作用。由于clic4蛋白与clic1蛋白都是属于氯离子通道蛋白家族，且clic家族成员之间的同源性较高，所以对clic4蛋白的研究也多了起来。clic4蛋白在氯离子通道蛋白家族中具有鲜明的特点，可溶性的clic4蛋白最初被认为是p53基因和原癌基因反应的促凋亡蛋白(shiioy等，2008)。它参与角质化细胞的分化，并且它还对多元细胞类型中的tgfβ信号因子具有调节作用。clic4蛋白的促凋亡和分化的功能依靠于它可以转移出细胞核。在最近的研究中发现clic4和免疫有一定关系，例如在lps刺激的巨噬细胞中clic4是irf3早期独立反应的基因，其引起糖皮质激素受体的抗炎反应。clic4在巨噬细胞早期的刺激反应功能中发挥作用(hezy,et等，2011)。clic4蛋白的核内转移可以调节巨噬细胞的减活化作用等。我们根据文献对clic4基因在免疫上有一定作用的报道，在猪上，我们展开了clic4基因与免疫性状之间互作关系的研究，这对提升猪的免疫性能和分子标记辅助育种有重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的是在于克服现有技术的缺陷，提供一种与猪免疫性状相关基因clic4的分子标记及其应用。利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间免疫性状的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为免疫性状的可靠标记，便于进行早期选择，从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高选种效率和准确性。

为实现上述目的，本发明提供了一种与猪免疫性状相关基因clic4的分子标记，其核苷酸序列如seqidno：1或如图5所示，在该分子标记的核苷酸序列的第116位碱基处有一个snp位点，即发生t/c等位基因突变，该突变导致bstui-rflp多态性。

具体地，该分子标记的核苷酸序列如下所示：

actataccttgtctatcccccttagcctaatctggaataactgcatgttcgtgcaaaataaaatttctactttataagaagaggagcagtctgttaggaaaagcattttcttagtr(t/c)ggggaagatgtggagacattgctctcataagtgc

上述序列中的第116位碱基处的r是t或c，该突变导致bstui-rflp多态性。

申请人提供了一种扩增与猪免疫性状相关基因分子标记的引物对，该引物对的核苷酸序列如下：

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’。

本发明还提供了一种获得上述分子标记的方法，其步骤包括：以clic4基因的猪基因组dna为模板，通过以下引物组合进行扩增后获得所述的分子标记，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’；

pcr扩增得到如seqidno：1所述的分子标记。

申请人提供了一种筛选猪免疫性状分子标记的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)猪clic4基因的引物设计与部分dna序列扩增

由于ncbi以及ensembl上面没有提供clic4-sus的外显子序列以及相关的snp位点信息，因此采用与clic4-human进行序列的同源性的比对的这种方法推测clic4-sus的外显子序列信息，在ensembl上查找出clic4-human的dna序列，该序列的id为ensg00000169504，选择clic4-001，其转录id为enst00000374379利用引物设计软件oligo7.0设计引物，引物序列如下:

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’；

(2)pcr扩增反应：

利用tianampgenomicdnakit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从猪品种二花脸与杜洛克杂交f2代实验群体(该群体来源于申请人的实验室与广东温氏集团合作构建的广东免疫群体，为常用品种)收集耳组织中提取的基因组dna，具体操作方法参照tianampgenomicdnakit试剂盒说明书进行。

pcr反应：pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。

pcr反应条件为：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分clic4基因的片段，长度为150bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

(3)pcr产物的纯化、测序

pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化pcr产物。将纯化后的dna溶液送至上海生工生物工程技术服务有限公司作正反向测序。

用本发明设计的引物扩增猪基因组dna得到了150bp特异性扩增片段，结果如图2所示。正反向测序结果发现该片段的第116碱基位存在一个t-c转换(即等位基因突变，如图3所示)，该突变造成一个bstui酶切位点(gc^gc)。

本发明还提供了一种上述分子标记在非诊断目的的猪免疫性状相关分子标记辅助育种中的应用，具体应用方法如下：

采集样品的白细胞数、嗜中性细胞数、淋巴细胞数、嗜碱细胞数、平均血红蛋白浓度、嗜碱细胞数百分比等22个血液指标和cd4-cd8-cd3-等8个t细胞含量指标。根据采集样品的群体结构，运用混合线性模型来统计分析clic4基因snp位点的基因型效应及其与上述30项性状之间的关系：

公式如下：y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε

其中μ为平均值；x1、x2、x3、z为相应效应的设计矩阵；β1、β2、β3为固定效应，分别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～n(0，aσa²)；ε为残差；相互独立且服从于ε～n(0，iσε²)。采用免费软件r(3.2.4)进行数据处理与统计分析。

统计分析发现该基因的t/c突变基因型与嗜碱性细胞数百分比呈现极显著相关关系(p＝0.0045)，与其他免疫性状差异不显著。本发明还提供了一种上述分子标记的引物对在猪免疫性状相关分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种鉴定含有clic4基因的猪的方法，所述的方法包括以下步骤：

设计引物对：

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’。

(2)pcr扩增条件

pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。

(3)pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5min；pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)rflp检测

pcr产物酶切反应体积为10μl，其中pcr产物3μl，去离子水5μl，10×buffer1.6μl，限制性内切酶bstui为0.4μl，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用4％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

结果发现，在seqidno：1所示序列的116碱基位存在一个酶切位点，经bstui酶切后产生三种基因型，即：tt基因型只有150bp一条带，含有杂合子tc基因型有150bp、117bp、33bp三条带，cc基因型有117bp一条带。

本发明原理在于：

clic4基因序列中包含一个snp位点，该突变位点为等位基因突变，即t/c的碱基突变，该突变导致bstui-rflp多态性。由于这个碱基突变位点，为同义突变。故本发明在clic4基因序列的snp位点附近设计引物，选择的限制性内切酶为bstui酶，得到如seqidno：1所述序列的分子标记(简洁序列)，该分子标记可用于非诊断目的的鉴定猪的免疫性状相关的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用pcr-rflp技术，在clic4基因中发现一个t-c突变，且发现此多态位点与嗜碱性粒细胞具有极显著相关性(p＝0.0045)。对猪免疫性状的辅助选择具有积极的意义。

附图说明

序列表seqidno:1是筛选的与猪免疫性状相关的分子标记的核苷酸序列。其中在该序列的第116位碱基处存在一个snp位点，即发生t/c等位基因的突变，该突变导致bstui-rflp多态性。

图1：本发明技术流程图。

图2：猪clic4基因基因组扩增电泳结果示意图。附图标记说明：泳道m：dl2000分子量标记。

图3为：本发明中猪clic4基因测序发现的t>c突变snp。

图4：猪clic4基因外显子的bstui-rflp的三种基因型(tttccc)电泳结果示意图。附图标记说明：泳道m：2000bpdna分子量标记。

图5：是本发明制备的与猪免疫性状相关的分子标记的直观的核苷酸序列，在该序列的第116位碱基处存在一个t/c等位基因突变。英文字母“r”标记为突变位点snp。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1猪免疫性状相关的分子标记的制备：

(1)猪clic4基因的引物设计与部分dna序列扩增

由于ncbi以及ensembl上面没有提供clic4-sus的外显子序列以及相关的snp位点信息，因此本发明采用与clic4-human进行序列的同源性的比对的方法推测clic4-sus的外显子序列信息，申请人在ensembl上查找出clic4-human的dna序列，(登陆号id为ensg00000169504)，选择其中的clic4-001，其转录id为enst00000374379，利用引物设计软件oligo7.0设计引物，引物的dna序列如下:

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’。

(2)pcr扩增反应：

利用tianampgenomicdnakit试剂盒(购自美国invitrogen公司)从猪品种二花脸与杜洛克资源群体,(该群体来源于申请人所在的实验室与广东温氏集团合作构建的广东免疫群体f2代，共计296头，仔猪生长到35日龄时，收集血液并测定血小板、血小板压积等22个血液指标和8个t细胞含量共计30个性状指标)收集耳组织样中提取的基因组dna。具体操作方法参照tianampgenomicdnakit试剂盒说明书进行。

pcr反应：pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正、反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加去离子水至总体积10μl。

pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得了部分clic4基因的片段，长度为150bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

(3)pcr产物的纯化、测序

pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化pcr产物(按照试剂盒说明书操作)，具体步骤是按照100mg胶块加入400μlgsbuffer的比例加入gsbuffer，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次。将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液。将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μlwashbuffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μlwashbuffer溶液洗涤一次。将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min。小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min。取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(dna溶液)置于-20℃保存备用。将纯化后的dna溶液送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

利用上述引物扩增猪基因组dna得到了长度为150bp特异性扩增片段(见seqidno:1)，结果如图2所示。正反向测序结果发现该片段所在的clic4基因，即该基因序列的第116碱基位发现一个t-c转换(即等位基因突变，如图3所示)，该突变造成一个bstui酶切位点(gc^gc)。

实施例2与猪免疫性状相关的分子标记的检测

1、pcr-rflp诊断方法建立

(1)设计引物对：

正向引物：5’-actataccttgtctatccccctt-3’；

反向引物：5’-gcacttatgagagcaatgtctccacatcttccgc-3’；

该引物扩增所得的片段长度为150bp，其序列为seqidno：1所示。在该片段的116碱基位发生一个等位基因突变如图5所示的t/c突变。。

(2)pcr扩增条件

pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna模板1μl，正反向引物各0.2nmol/μl,pcrmix5μl，最后加入去离子水至总体积10μl。

pcr反应条件：95℃预变性5min后，循环35次95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。pcr产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)rflp检测

pcr产物酶切反应体积为10μl，其中pcr产物3μl，去离子水5μl，10×buffer1.6μl，限制性内切酶bstui为0.4μl，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用4％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

结果发现，在seqidno：1所示序列的116碱基位存在一个酶切位点，经bstui酶切后产生三种基因型，即：tt基因型只有150bp一条带，含有杂合子tc基因型有150bp、117bp、33bp三条带，cc基因型有117bp一条带。

实施例3本发明发的分子标记在不同猪群体多态性检测中关联分析的应用-1

利用pcr-bstui-rflp检测了猪品种“二花脸与杜洛克杂交f2代实验群体”(广东温氏集团广东免疫群体f2代)。该突变位点在实验群体中的基因型和基因频率如表1所示，检测结果显示，clic4基因在实验群体中存在三种基因型，其中tt基因型频率为0.15，tc基因型频率为0.76，cc基因型频率为0.09，酶切分型的检测结果与测序结果相符，本发明的检测方法可靠。该结果表明clic4基因在资源群体中等位基因t占优势。

实施例4本发明的分子标记与免疫性状的关联分析应用-2

本实施例的猪群来“二花脸与杜洛克资源猪群”。

采集样品的白细胞数、嗜中性细胞数、淋巴细胞数、嗜碱细胞数、平均血红蛋白浓度、嗜碱细胞数百分比等22个血液指标和cd4-cd8-cd3-等8个t细胞含量指标，根据采集样品的群体结构，运用混合线性模型来统计分析clic4基因snp位点的基因型效应及其与上述性状之间的关系：按以下计算公式：

y＝μ+x1β1+x2β2+x3β3+zu+ε

在上述公式中：μ为平均值；x1、x2、x3、z为相应效应的设计矩阵；β1、β2、β3为固定效应，分别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～n(0，aσa²)；ε为残差；相互独立且服从于ε～n(0，iσε²)。

采用免费软件r(3.2.4)进行数据处理与统计分析。

对猪clic4基因bstui-rflp多态性位点与免疫性状进行关联分析，得到如表1所示的结果。由表1可知：tt基因型频率为0.15，tc基因型频率为0.76，cc基因型频率为0.09。

表1猪的clic4基因snp位点(t/c)多态性与嗜碱性细胞数百分比的关联分析结果

表1的说明：ba％为嗜碱性细胞数百分比。

进一步，本实施例采用r(3.2.4)语言软件中的混合线性模型对猪clic4基因的t>c突变位点的多态在实验猪群中对免疫性状进行了关联分析。分析结果见表1。统计分析发现该clic4基因的t/c突变基因型与嗜碱性细胞数百分比呈现极显著相关。

参考文献：

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[11]hezy,wenh,shicb,etal,up-regulationofhnrnpal,ezrin,tubulinβ-2candannexinalinsentinellymphnodesofcolorectalcancel(j).worldjgastroenterol,2010,16(37):4670-6。

序列表

<110>华中农业大学

<120>猪clic4基因作为免疫性状相关的分子标记及应用

<141>2017-09-13

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>150

<212>dna

<213>猪(susscrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(150)

<220>

<221>mutation

<222>(116)..(116)

<400>1

actataccttgtctatcccccttagcctaatctggaataactgcatgttcgtgcaaaata60

aaatttctactttataagaagaggagcagtctgttaggaaaagcattttcttagtcgggg120

aagatgtggagacattgctctcataagtgc150