本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法。
背景技术：
干细胞是具有自我复制和多向分化能力的细胞，可以不断地自我更新，并在特定条件下分化成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞，可使组织恢复再生能力，修复其功能。研究者在脱落乳牙的牙髓组织中发现一种新的成体干细胞，将其命名为乳牙牙髓干细胞，至今已有较多实验证明乳牙牙髓干细胞具有高度自我更新、克隆形成以及成骨分化的能力。
乳牙牙髓干细胞具有以下优势：1)取材方便，多取自自然脱落和拔除的滞留牙，对供者正常牙伤害较少；2)不受伦理限制，可进行自体移植治疗，最大限度降低免疫排斥和交叉感染的风险；3)具有较强的增殖能力和多向分化潜能。但牙髓中干细胞含量较低，必须在体外进行扩增，以获得足够的细胞数量来满足应用需求。目前，牙髓干细胞培养体系主要采用含动物源胎牛血清的培养基，动物源胎牛血清在一定程度上有可能引起人体免疫排斥反应，增加了牙髓干细胞临床应用的风险。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种人牙髓干细胞培养基及其制备方法，该培养基制得的人牙髓干细胞产量高，无人体免疫排斥反应，为临床牙的修复与再生提供了可靠的种子细胞。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量为6-12％的人ab血清、牛磺酸5-10mg/l、硫辛酸0.1-0.2mg/l、葡萄籽提取物2-5mg/l、羧甲基壳聚糖0.6-1.5g/l、葫芦素b0.3-0.8mg/l、血小板衍生生长因子1-4μg/l、表皮生长因子1-4μg/l、薯蓣皂苷元0.6-1.8mg/l和氯化胆碱50-65μm。
进一步地，添加物包括：体积百分含量8-10％的人ab血清、牛磺酸6-8mg/l、硫辛酸0.12-0.18mg/l、葡萄籽提取物3-5mg/l、羧甲基壳聚糖1.0-1.5g/l、葫芦素b0.4-0.6mg/l、血小板衍生生长因子2-3μg/l、表皮生长因子2-3μg/l、薯蓣皂苷元0.8-1.5mg/l和氯化胆碱55-63μm。
进一步地，添加物包括：体积百分含量10％的人ab血清、牛磺酸7mg/l、硫辛酸0.15mg/l、葡萄籽提取物5mg/l、羧甲基壳聚糖1.2g/l、葫芦素b0.5mg/l、血小板衍生生长因子2μg/l、表皮生长因子2μg/l、薯蓣皂苷元1.2mg/l和氯化胆碱60μm。
进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32-35％的水和0.03-0.08％的酵母，室温下密封发酵10-12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60-62℃，萃取压力为3.8-4.0mpa，萃取时间为1-1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3-1/4，所得浓缩液以0.6-0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
进一步地，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8mpa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌30-40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌30-40min，静置1.5-2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌30-40min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后过滤除菌，制得。
进一步地，用0.22μm滤膜过滤除菌。
本发明提供的人牙髓干细胞培养基及其制备方法，具有以下有益效果：
在本发明中，血小板衍生生长因子和表皮生长因子主要作为维持牙髓细胞体外培养生存、增殖和分化所需的补充因子；牛磺酸和硫辛酸可协同进一步促进牙髓细胞的增殖，同时硫辛酸与籽葡萄提取物可协同起到抗氧化作用；羧甲基壳聚糖可与牛磺酸和硫辛酸协同起到增殖作用，加入葫芦素b更能显著提高牙髓细胞的增殖作用，同时羧甲基壳聚糖还能起到稳定剂的作用。
本发明通过特定组分组成，各组分协同作用，能够显著提高牙髓细胞的扩增速度，且不影响牙髓干细胞的多向分化能力，同时无人体免疫排斥反应，可为临床牙的修复与再生提供可靠的种子细胞。
具体实施方式
实施例1
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量为6％的人ab血清、牛磺酸5mg/l、硫辛酸0.1mg/l、葡萄籽提取物2mg/l、羧甲基壳聚糖0.6g/l、葫芦素b0.3mg/l、血小板衍生生长因子1μg/l、表皮生长因子1μg/l、薯蓣皂苷元0.6mg/l和氯化胆碱50μm。
其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵10天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8mpa，萃取时间为1h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/3，所得浓缩液以0.6v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌30min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌30min，静置1.5h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌30min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。
实施例2
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量为12％的人ab血清、牛磺酸10mg/l、硫辛酸0.2mg/l、葡萄籽提取物5mg/l、羧甲基壳聚糖1.5g/l、葫芦素b0.8mg/l、血小板衍生生长因子4μg/l、表皮生长因子4μg/l、薯蓣皂苷元1.8mg/l和氯化胆碱65μm。
其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量35％的水和0.08％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为62℃，萃取压力为4.8mpa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.8v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌40min，静置2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌40min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。
实施例3
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量8％的人ab血清、牛磺酸6mg/l、硫辛酸0.12mg/l、葡萄籽提取物3mg/l、羧甲基壳聚糖1.0g/l、葫芦素b0.4mg/l、血小板衍生生长因子2μg/l、表皮生长因子2μg/l、薯蓣皂苷元0.8mg/l、氯化胆碱55μm。
其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8mpa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌30min，静置2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌40min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。
实施例4
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量10％的人ab血清、牛磺酸8mg/l、硫辛酸0.18mg/l、葡萄籽提取物5mg/l、羧甲基壳聚糖1.5g/l、葫芦素b0.6mg/l、血小板衍生生长因子3μg/l、表皮生长因子3μg/l、薯蓣皂苷元1.5mg/l、氯化胆碱63μm。
其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8mpa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌30min，静置2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌40min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。
实施例5
一种人牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加物；基础培养基为α-mem培养基；添加物包括：体积百分含量10％的人ab血清、牛磺酸7mg/l、硫辛酸0.15mg/l、葡萄籽提取物5mg/l、羧甲基壳聚糖1.2g/l、葫芦素b0.5mg/l、血小板衍生生长因子2μg/l、表皮生长因子2μg/l、薯蓣皂苷元1.2mg/l、氯化胆碱60μm。
其中，葡萄籽提取物通过以下方法制备得到：
(1)将葡萄籽粉碎，加入葡萄籽重量32％的水和0.03％的酵母，室温下密封发酵12天，然后真空干燥至含水量≤7％；
(2)以无水乙醇为萃取剂，对步骤(1)所得物进行亚临界萃取，萃取温度为60℃，萃取压力为3.8mpa，萃取时间为1.5h，得萃取物；
(3)将萃取物减压浓缩至原体积的1/4，所得浓缩液以0.6v/h的流速过活性炭柱，然后用70％乙醇溶液洗脱，最后再浓缩干燥，得葡萄籽提取物。
上述培养基的制备方法，包括：向基础培养基中加入人ab血清、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、牛磺酸、硫辛酸和氯化胆碱，搅拌40min，然后再加入羧甲基壳聚糖、葫芦素b和薯蓣皂苷元，继续搅拌30min，静置2h，最后加入籽葡萄提取物，搅拌40min，得混合物，调节混合物的ph值值6.8-7.2，然后用0.22μm滤膜过滤除菌，制得。
对比例1
对比例1与实施例5不同之处在于，不含牛磺酸和硫辛酸，其余与实施例5相同。
对比例2
对比例2与实施例5不同之处在于，不含葫芦素和薯蓣皂苷元，其余与实施例5相同。
对比例3
对比例2与实施例5不同之处在于，不含牛磺酸、硫辛酸、葡萄籽提取物葫芦素和薯蓣皂苷元，其余与实施例5相同。
试验例
1、对牙髓干细胞的培养效果
用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织，用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm3，置于50ml离心管中，加入13ml的组织消化液，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃，200r/min消化15min，加入等体积的培养基(实施例1-5及对比例1-3)反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，2000r/min离心3min，利用pbs清洗1-2次，沉淀用培养基重悬，以5×103个/ml接种培养皿中，混匀细胞悬液，放于37℃，湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养，每隔24h用血球计数板测一次细胞数量，结果如下表。
由上表可知，在相同的培养时间内，采用本发明培养基培养牙髓干细胞，其数量明显大于对比例的培养基，尤其是实施例5效果最佳，扩增效果最好。
2、对增殖后的牙髓干细胞体外分化为成骨细胞，成软骨细胞，成脂肪细胞的潜能分析
采用本发明实施例1-5及对比例1-3培养牙髓干细胞，将其传代扩增至p10代，使用lonza的成脂，成骨，成软骨检测试剂盒对p10代牙髓干细胞进行分化检测。
检测结果表明，经本发明实施例1-3培养基培养过的牙髓干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞的比率在90％以上，而对比例1-3培养基培养的牙髓干细胞分化成脂肪细胞，成软骨细胞，成骨细胞的比率在65％左右。因此，本发明所得适用于牙髓干细胞体外培养的培养基可以有效的保持牙髓干细胞的多向分化能力。