赋予植物黄萎病抗性的GhMYB36基因的应用的制作方法

本发明涉及一个赋予植物黄萎病抗性的ghmyb36基因及其在植物抗黄萎病中的应用。

背景技术：

棉花黄萎病为土传病害，可造成蕾、铃的大量脱落，发病严重时脱落成光杆，甚至死亡，使棉花减产20～60％，是中国棉花生产最主要病害。到目前为止，尚无有效的防治药剂，只能依靠种植抗病品种为主的综合防治措施(简桂良等,2003；张保龙等，2012)。但我国近年来推广的棉花新品种多为感病或耐病，抗病品种的匮乏，致使该病的危害日益严重（简桂良等,2003）。黄萎病抗性资源主要存在于亚洲棉和海岛棉等野生种质资源，但由于回交选择和杂交障碍，很难直接利用。

我国的棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌（verticilliumdahliae）侵染引起的，该病广泛存在于世界各地区，是棉花最严重的土传真菌性维管束系统病害，被称为棉花的“癌症”。大丽轮枝菌以微菌核（microsclerotia）存在于土壤中，可存活达10年以上，受到根分泌物的刺激而萌发，形成的芽管侵染植物根部，在根部皮层的细胞间或细胞内生长，最终蔓延到木质部以及整个植株（veronesepetal.,2003）。大丽轮枝菌为兼性寄生菌，有很明显的致病力分化，该菌是广谱寄生菌，能侵染二百多种植物，且其微菌核在无寄主的情况下，可以顺利越冬(klimesanddobinson,etal.,2006)。

黄萎病严重威胁棉花、番茄等农作物产量与品质，已经成为农作物生产的重要限制因子之一。发掘和推广抗黄萎病能力强的品种一直是农业生产中的一个重要课题。但是抗黄萎病资源缺乏，是棉花抗黄萎病育种的主要限制。我国现存棉花品种资源中高抗黄萎病的资源多为海岛棉（g.barbadensel），如海岛棉品种h7124高抗落叶型和非落叶型黄萎病（朱龙付等,2005）。虽然海岛棉抗性很好、植株高大、生长势强，但是其生育期很长、铃小、在我国大部分棉区不仅成熟晚、而且产量较低。另外，利用常规杂交育种方法将海岛棉中的抗性基因转入陆地棉，要进行大量的杂交，再进行多代回交和定向选择等育种方法，这需要很长时间和巨大的工作量，而植物基因工程的发展则为培育抗病品种提供了一条崭新的途径。通过对棉花黄萎病抗性机制进行多年分析，确认棉花基因组中可能存在多个抗病基因，这些抗病基因对不同的病原菌小种具有专一抗性。而ve基因属于rlps类基因，这类基因多以基因簇形式存在，这种结构特征为专一性识别病原菌小种提供条件。另外，棉花转基因方法的不断成熟完善为转基因育种提供了重要的保证，通过多基因转化或聚合育种，将多个抗性基因转化得到抗性更为良好可以应用于育种的核心种质，可以大大加快育种进程，是未来抗病育种的一个长期趋势。黄萎病病原菌变化多变异快，只有从抗性材料中分离出更多的抗性基因，才能为进一步研究其抗性机制并利用转基因创制抗性新种质成为可能。

植物中myb转录因子可根据myb结合域的数目分为4类，其中r2r3型myb蛋白是最大的家族，具有快速扩张，功能相近或分化的特点。r2r3型myb蛋白主要在植物生长发育、代谢调控以及耐旱中起到重要作用cedronietal.,2003;wangetal.,2004;wuetal.,2006;puetal.,2008;machadoetal.,2009;guanetal.,2014)，而在棉花抗黄萎病方面研究较少。目前，棉花中仅克隆了myb108在抗黄萎病中具有作用（cheng，etal.,2016）。通过对棉花基因组进行生物信息学分析，找到5个myb相关基因，将陆地棉奥3503接病v991后，提取rna做荧光定量分析，发现其中一个myb基因接病相对接病前有上调表达，从而筛选出ghmyb36，并进行后续抗病性鉴定，结果显示此基因为黄萎病抗性基因。棉花黄萎病抗性基因ghmyb36的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性ghmyb36基因的应用，该基因编码r2r3myb蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高受体植物对落叶黄萎病病原菌v991的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。

技术方案

本发明涉及一个植物基因ghmyb36（mf362615.1，位置1-909）的功能分析和应用，该基因来源于陆地棉奥3503。ghmyb36完整编码框长度为909个碱基，编码蛋白含302个氨基酸，分子量为33.55kd。该基因编码的蛋白与拟南芥myb36(登录号np_200570.1)相似性为53.5%，编码典型的r2r3myb结构域。

本发明还提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。

本发明赋予植物黄萎病抗性的ghmyb36基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株v991的诱导后表达量增加，将ghmyb36与pbingfp4载体构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因表达可以大幅降低平均发病率，说明该基因具有对棉花黄萎病强致病力菌株v991的抗性。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或用在棉花黄萎病抗性改良中。

ghmyb36的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

赋予植物黄萎病抗性的ghmyb36基因的应用，包括：

1）ghmyb36基因的克隆和表达载体构建

以陆地棉奥3503cdna为模板，用引物

p1:5’-cggggtaccatgggtcgagcaccttgctg-3’，

p2:5’-gggcatattgaaccccaattc-3’

扩增得到909bp片段，将该片段命名为ghmyb36，登录号：mf362615.1，位置1-909，ghmyb36基因用kpni单酶切，并与pbingfp4载体连接，连接产物用jm109感受态细胞进行热激转化，测序后成功构建的质粒命名为pbingfp4:ghmyb36；

2）转基因植株的获得

将步骤1)中构建好的pbingfp4:ghmyb36提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌lba4404，用蘸花法转化拟南芥，当代植株为t0代，种子为t1代，t1代种子在1/2ms培养基上进行卡那筛选，选择可在1/2ms培养基上生长的植株，种植到土壤中，pcr方法分别在dna和rna水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，用引物p1和p2扩增植株dna进行pcr鉴定909bp大小片段，获得转ghmyb36基因的阳性转基因植株t1植株，收获种子为t2代。选择t2代种子纯合不分离植株，收获种子为t3代。

有益效果

1.本发明获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的ghmyb36基因。本发明获得的ghmyb36基因来源于陆地棉奥3503，该基因编码的蛋白是一个典型的r2r3myb蛋白，blast搜索没有与其高度同源的相似基因。该基因受棉花黄萎病病原菌诱导后表达量明显上升。将ghmyb36与构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因在转基因植株中表达后可以大幅降低菌株v991侵染后的平均发病率，说明其具有对棉花黄萎病强致病力菌株v991的抗性。ghmyb36的分离可以进一步丰富抗性基因资源，其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。

2.本发明有助于更好地了解抗病基因的作用机制。ghmyb36的克隆为进一步了解病原菌与抗病基因互作，抗病信号传导通路奠定基础。ghmyb36是怎样将抗性信号传导的，此基因参与了哪些信号传导过程，可以利用该基因转基因植株进行进一步分析，从而获得抗性信号传导通路，所以ghmyb36的分离以及功能鉴定为研究抗病基因的作用机制奠定基础。

3.本发明应用于黄萎病抗性育种。ghmyb36抗性效果良好，可大幅降低平均发病率，所以在育种中有较大的应用价值。

附图说明

图1ghmyb36和拟南芥atmyb36的氨基酸序列相似性比较。atmyb36（登录号：np_200570.1）。

图2黄萎病病原菌v991处理陆地棉奥3503后4d后ghmyb36的表达。

图3ghmyb36转基因植株的分子检测。a,dna,基因组水平检测；cdna,rna水平检测，m,marker。wt为未转化植株；oe1,oe2,oe7为卡那霉素筛选出的抗性转化株。rubisco基因为内参。循环数为28个。

图4ghmyb36转化植株对黄萎病抗性检测。a,ghmyb36转化植株和野生型植株接种v991落叶型黄萎病菌菌株14d后表型。b,ghmyb36转化植株和野生型植株接种v991落叶型黄萎病菌菌株14d后平均发病率。wt为未转化植株；oe1,oe2,oe7为ghmyb36转化株。**为在0.01水平上有显著差异（studentt-test）。

具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验中基因来源于陆地棉奥3503（gossipiumhirsutum）。

1）棉花ghmyb36的诱导表达分析

所用棉花为2周苗龄，病原菌诱导条件为：菌株为落叶型强致病力病原菌v991。病原菌经pda平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液（g/l）：nano32g、k2hpo41g、mgso4-7h2o0.5g、kcl0.5g、feso4-7h2o0.01g、蔗糖30g，25℃，180r·min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。诱导方法为蘸根法，接种接种孢子浓度为1×10⁷个/ml。诱导时间别为4d。分别采集未诱导和诱导后葡萄材料的叶片，总rna提取以及rt-pcr模板制备方法见附录。表达分析结果显示v991处理4d后，在叶片中ghmyb36基因表达量明显增加，为上调表达（图2）。

2）ghmyb36基因的克隆和表达载体构建

以陆地棉奥3503cdna为模板，用引物

p1:5’-cggggtaccatgggtcgagcaccttgctg-3’，

p2:5’-gggcatattgaaccccaattc-3’

扩增得到909bp片段，将该片段命名为ghmyb36，登录号：mf362615.1，位置1-909，ghmyb36基因用kpni单酶切，并与pbingfp4载体连接，连接产物用jm109感受态细胞进行热激转化，测序后成功构建的质粒命名为pbingfp4:ghmyb36；

3）转基因植株的获得

将步骤1)中构建好的pbingfp4:ghmyb36提取质粒后，用冻融法将重组载体质粒转化农杆菌lba4404，用蘸花法转化拟南芥，当代植株为t0代，种子为t1代，t1代种子在1/2ms培养基上进行卡那筛选，选择可在1/2ms培养基上生长的植株，种植到土壤中，pcr方法分别在dna和rna水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达，用引物p1和p2扩增植株dna进行pcr鉴定909bp大小片段，获得转ghmyb36基因的阳性转基因植株t1植株，收获种子为t2代。选择t2代种子纯合不分离植株，收获种子为t3代。

4）t3代转化株的抗病性鉴定

对3个ghmyb36基因可以正常表达的t3代转化株系进行抗病性鉴定。所用菌株为棉花黄萎菌落叶型强致病力菌株v991（徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌t-dna插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496;张天真,周兆华,闵留芳,等.棉花对黄萎病的抗性遗传模式及抗(耐)病品种的选育技术.作物学报,2000,26(6):673-680）。病原菌经pda平板活化后，从菌落边缘挑取菌块放入查氏培养液，25℃，180r•min培养5-6d，用纱布过滤培养液，镜检并用血球计数板计数。接种方法为蘸根法，接种浓度为1×10⁷个/ml。每个转基因株系每种病原菌的鉴定株数40株，接种后每天观察病害的发生情况，在14天后就可以明显看见发病症状，发病植株表现为叶片黄化，萎蔫，生长延缓。抗病性鉴定结果显示，在病原菌接种后14天后，对于落叶型黄萎病v991，对照发病率为85%，而三个转基因株系的平均发病率分别仅为22.2%，26.3%，16.7%。抗病性鉴定说明ghmyb36可以使显著降低发病率（图4），说明ghmyb36可以赋予受体植株黄萎病抗性。

附录：

1．rna提取方法

（1）取材料加液氮充分研磨成粉末状转运至离心管中；

（2）加10倍体积的rna提取缓冲液，震荡混匀，50℃水浴约20min，中途可混合2-3次；

（3）加0.6倍体积的氯仿，混匀，静置冰浴20min；

（4）12000rpm离心20min，将上清转运至一新离心管中；

（5）加1/2体积的8mlicl溶液，冰浴过夜（12h以上）；

（6）12000rpm离心20min，弃上清，用70%酒精洗沉淀1次并将沉淀转运至一新的离心管中；

（7）12000rpm离心20min，弃乙醇溶液，沉淀抽干20min；

（8）加200ul无rnase的水溶解沉淀，加1倍体积的水饱和酚/氯仿=1:1充分混匀，静置5min；

（9）12000rpm离心20min，将上清转运至另一新的离心管中，再加1倍体积的水饱和酚/氯仿=1:1重复抽提一次；

（10）12000rpm离心20min，上清加1倍体积的氯仿抽提一次；

（11）12000rpm离心20min，上清加1/2体积8mlicl溶液，冰浴过夜（12h以上）；

（12）12000rpm离心20min，沉淀用70%酒精洗一次。抽干后溶于100-200ul无rnase的水中。取2ul检测质量。

2．cdna的合成

将提取的rna用dnasei37℃纯化处理30min后备用。用transscriptreversetranscriptase试剂盒（transgen公司）合成第一链cdna。体系如下：

rna模板6.0µl

引物(500µmolµl^-1)1.0µl

dntp(10mmolµl^-1)1.0µl

5×rtbuffer4.0µl

ribonucleaseinhibitor(ri)0.5µl

transcriptrt1.0µl

depcddh2o补至20.0µl

42℃45min，85℃5min。于-20℃保存。

序列表

<110>江苏省农业科学院

<120>赋予植物黄萎病抗性的ghmyb36基因的应用

<141>2017-11-27

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>1

cggggtaccatgggtcgagcaccttgctg29

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)

<400>2

gggcatattgaaccccaattc21