BRAF基因突变检测的引物和探针及应用的制作方法

本发明属于基因检测
技术领域：
，尤其涉及braf基因突变检测的引物和探针及应用。
背景技术：
：braf基因是raf基因家族中的一员，位于7号染色体的长臂上，编码一个含有766个氨基酸残基的蛋白质。braf蛋白是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，其参与调控细胞内多种生物学活动，其在mapk通路中将信号从ras转导至mek1/2。braf基因突变使得该蛋白激酶活性产生变化，导致细胞出现异常的增殖和分化，最终形成肿瘤。近8％的人类肿瘤中都发生了braf基因突变，其中结肠直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头瘤发生较多。在braf基因突变中，最多的为第1799位氨基酸上密码子t变为a(brafv600e)，占比92％。目前有两类braf抑制剂，一类是广谱的raf激酶抑制剂，适用于多种类型，但针对性不强；另一类是brafv600e靶向抑制剂，对brafv600e有很高的抑制作用。靶向抑制剂威罗菲尼治疗该种突变引起的晚期黑色素瘤患者效果显著，但是耐药性使该种药物的使用效果大大受限，耐药机制、新药研发以及如何避免或者减少耐药是目前亟待解决的问题。目前基因检测的技术方法有sanger测序、rna酶切割法、变性梯度凝胶电泳法(denaturedgradientgelelectrophoresi，dgge)、杂合双链分析法(ha)、化学切割错配法(ccm)、sorpions-arms(scorpions，蝎形探针；amplificationrefractorymutationsystem，扩增阻滞突变系统)、dna芯片技术、taqman-qpcr、dhplc(denaturinghighperformanceliquidchromatography)、pcr-sscp(single-strandconformationpolymorphism)、pcr-rflp(restrictionfragmentlengthpolymorphism)等，其中sanger测序和scorpions-arms在临床和科研中应用较多。德国qiagen公司基于scorpions-arms法开发检测试剂盒，该试剂盒优点为灵敏度高、操作简单且检测快速，但其成本过高。sanger测序法是基因突变检测及基因多样性检测的金标准，平台和技术都较为成熟，兼备检测结果准确、全面，检测费用低廉且能检测出未知突变；但sanger测序法受限于突变基因含量要达到10％以上，且需要后期处理，容易受污染。传统荧光定量pcr法虽然应用广泛，但是准确性有待提高。因此，有必要设计出一种操作简单、费用低廉且准确度高的荧光定量pcr检测。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种检测人类braf基因突变的引物和探针及应用，该引物和探针应用于荧光定量pcr检测中，结果发现操作简单、费用低廉且准确度高。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：braf基因突变检测的引物，包括同时扩野生型基因和突变型基因的通用引物，以及只扩增突变型基因的突变引物，所述突变引物的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述通用引物的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，所述braf基因突变为c.1799t＞a。另外，本发明还提供所述的引物在制备用于检测braf基因突变的试剂盒中的应用。另外，本发明还提供braf基因突变检测的探针，所述探针的核苷酸序列如seqidno.5所示，所述braf基因突变为c.1799t＞a。作为上述技术方案的改进，所述探针的两端分别标记荧光报告基团和荧光猝灭基团，所述荧光报告基团选自于fam、vic、hex、cy5和cy3中的一种，所述淬灭基团选自于bqh1、mgb、tamara和bhq2中的一种。另外，本发明还提供所述的探针在制备用于检测braf基因突变的试剂盒中的应用。另外，本发明还提供一种试剂盒，其包含所述的引物和/或所述的探针。作为上述技术方案的改进，所述试剂盒还包含rna提取试剂、cdna合成试剂和pcr反应试剂。作为上述技术方案的进一步改进，所述pcr反应试剂包含pcr缓冲液、dntps和dna聚合酶。作为上述技术方案的更进一步改进，当pcr扩增体系为20μl时，扩增体系含有以下组分：pcr混合液10μl、cdna模板1μl、每条引物0.5μl、探针0.5μl和无核酸酶纯水7.5μl；扩增程序为：95℃预变10min；94℃变性15s，60℃延伸1min，循环40次；50℃2min。本发明的有益效果在于：本发明提供一种检测人类braf基因突变的引物和探针及应用，本发明设计的突变引物和探针在检测不含brafv600e突变样本时，扩增曲线的ct值大，突变引物的特异性强；通用引物可以避免假阴性结果，使荧光定量pcr的操作简单、费用低廉且准确度高。附图说明图1为样本中存在braf基因突变的阳性检测结果图；图2为样本中不存在braf基因突变的阴性检测结果图。具体实施方式为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例、附图对本发明作进一步说明。实施例1本实施例提供一对用于检测braf基因突变的引物，包括同时扩野生型基因和突变型基因的通用引物，以及只扩增突变型基因的突变引物，突变引物f的核苷酸序列为：5’-tcataatgcttgctctgatagg-3’，突变引物r的核苷酸序列为：3’-ccaaaaatttaatcagtgga-5’；通用引物f的核苷酸序列为：5’-taggtgattttggtctagctactt-3’，通用引物r的核苷酸序列为：5’-tagttgagaccttcaatgactttctagt-3’。实施例2本实施例提供一对用于检测braf基因突变的探针，探针的核苷酸序列为：5’-fam-tggagtgggtcccatcagtttg-bqh1-3’。实施例3本实施例提供一对用于检测braf基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含实施例1所述的引物和实施例2所述的探针。实施例4本实施例提供一种用于检测braf基因突变的试剂盒，其与实施例3的区别在于：本实施例中试剂盒还包括所述试剂盒还包含rna提取试剂、cdna合成试剂、pcr反应试剂，所述pcr反应试剂包含pcr缓冲液、dntps和dna聚合酶。当pcr扩增体系为20μl时，扩增体系含有以下组分：pcr混合液10μl、cdna模板1μl、每条引物0.5μl、探针0.5μl和无核酸酶纯水7.5μl；扩增程序为：95℃预变10min；94℃变性15s，60℃延伸1min，循环40次；50℃2min。荧光定量pcr检测方法1.总rna提取需要准备的试剂：氯仿、异丙醇、75％乙醇(用rnase-free水配制)、rnase-free的水。1)匀浆处理(homogenization)直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10,000rpm离心1min；彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀，每100～200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol；2)分层(phaseseparation)样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解(如不进行下一步操作，样品可放入-80℃长期保存)；可选步骤：4℃12,000rpm离心10min，取上清；如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除；处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去；取澄清的匀浆溶液进行下一步操作，每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3～5min使其自然分相；3)rna沉淀(rnaprecipitation)4℃12,000rpm离心10～15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相；rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10～20min；4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底；4)rna漂洗(rnawash)rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；每1mltrizol加入1ml75％乙醇，4℃5,000～8,000rpm离心1～2min，弃上清，室温放置1～2min晾干沉淀；5)溶解rna沉淀中加入50～100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-80℃保存。2.去基因组使用rnase-free的dnasei，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min；体系包含以下组分：rna60μl，dnasei20μl，10×buffer20μl，h2o100μl；然后按以下步骤操作：1)加入等体积的苯酚，上下颠倒混匀后10,000rpm，离心5min；2)取上清液，加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，10,000rpm，离心10min；3)取上清液，加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20℃静置15min；4)4℃10,000g离心10min，去上清；5)用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；6)加入10μldepc水溶解。3.rna浓度、纯度及完整性检测纯度检测：取rna样品适度稀释，在微量分光光度计k2800上测定od值，od260/od280的比值大于1.8，说明制备的rna较纯，无蛋白质污染。4.逆转录1)在pcr管中加入rna、引物混合物，总量10μl，体系包含以下组分：rna15μg，olig(dt)180.5μl，randomprimer0.5μl，rnasefreeddh2o补足至10μl；2)70℃保温10min后迅速在冰上冷却2min；3)在该pcr管中加入下列试剂：rna/引物变性溶液12μl，10mmdntpmixture0.5μl，rnaseinhibitor(40u)0.25μl，5×m-mlvbuffer4μl，rtasem-mlv0.5μl，rnasefreeddh2o补足至20μl；4)将上述20μl反应溶液42℃保温60min；72℃保温15min；-20℃保存备用。5.引物设计采用primerpremier5.0在含有突变位点的外显子两端设计引物，避开具有引物二聚体以及茎环错配的序列，使用其扩增出来的序列长度不超过400bp，且所用引物的退火温度基本一致；本发明所扩增引物和连接引物的序列如表1下。表16.片段扩增20μl扩增体系如表2所示；表2试剂使用量pcr混合液10μl引物f(10μm)0.5μl引物r(10μm)0.5μl突变探针0.5μlcdna模板1μl无核酸酶纯水7.5μl扩增程序为：95℃预变10min；94℃变性15s，60℃延伸1min，循环40次；50℃2min。7.结果如图1所示，图中显示两条阳性扩增曲线，说明测试样品含有braf基因突变；如图2所示，图中显示一条阳性扩增曲线，说明测试样品不含有braf基因突变。由此可见，本发明的突变引物和探针在检测不含brafv600e突变样本时，扩增曲线的ct值大，突变引物的特异性强；通用引物可以避免假阴性结果，使荧光定量pcr的准确度高。最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。sequencelisting<110>广州誉嘉生物科技有限公司<120>braf基因突变检测的引物和探针及应用<130>2017<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工合成<400>1tcataatgcttgctctgatagg22<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2ccaaaaatttaatcagtgga20<210>3<211>24<212>dna<213>人工合成<400>3taggtgattttggtctagctactt24<210>4<211>28<212>dna<213>人工合成<400>4tagttgagaccttcaatgactttctagt28<210>5<211>22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